Kolonie-PCR
Die Kolonie-PCR ist eine praktische Hochdurchsatzmethode zur Bestimmung der Anwesenheit oder Abwesenheit von Insert-DNA in Plasmidkonstrukten. Einzelne Transformanten können entweder mit einem kurzen Aufheizschritt in Wasser lysiert oder direkt der PCR-Reaktion zugesetzt und während des ersten Aufheizschritts lysiert werden. Dieser anfängliche Erwärmungsschritt bewirkt die Freisetzung der Plasmid-DNA aus der Zelle, so dass sie als Vorlage für die Amplifikationsreaktion dienen kann. Primer, die speziell auf die Insert-DNA abzielen, können verwendet werden, um zu bestimmen, ob das Konstrukt das interessierende DNA-Fragment enthält. Alternativ können Primer, die auf Vektor-DNA abzielen, die das Insert flankiert, verwendet werden, um zu bestimmen, ob das Insert die richtige Molekülgröße hat oder nicht. Insertspezifische Primer können Informationen sowohl über die Spezifität als auch über die Größe der Insert-DNA liefern, während die Verwendung vektorspezifischer Primer das gleichzeitige Screening mehrerer Konstrukte ermöglicht. Kolonie-PCR kann auch verwendet werden, um die Insert-Orientierung zu bestimmen. Die PCR-Amplifikation des Plasmids unter Verwendung eines Insert-spezifischen Primers gepaart mit einem Vektor-spezifischen Primer kann nur dann so ausgelegt werden, dass ein Amplikon einer bestimmten Größe erzeugt wird, wenn der Insert in der richtigen Orientierung ist. In allen Versuchsdesigns werden das Vorhandensein oder Fehlen eines PCR-Amplifikats und die Größe des Produkts durch Elektrophorese neben einem DNA-Größenmarker auf einem Agarosegel bestimmt.
