Komplementabhängige Zytotoxizität

Therapeutische Antikörperbearbeiten

Die Entwicklung von antitumortherapeutischen Antikörpern umfasst die In-vitro-Analyse ihrer Effektorfunktionen, einschließlich der Fähigkeit, CDC zur Abtötung von Zielzellen auszulösen. Der klassische Ansatz besteht darin, Antikörper mit Zielzellen und Komplementquelle (Serum) zu inkubieren. Dann wird der Zelltod mit mehreren Ansätzen bestimmt:

• Radioaktive Methode: Zielzellen werden vor dem CDC-Assay mit 51Cr markiert, Chrom wird während der Zelllyse freigesetzt und die Menge an Radioaktivität wird gemessen.
• Messung der Stoffwechselaktivität lebender Zellen (Lebendzellfärbung): Nach Inkubation der Zielzellen mit Antikörpern und Komplement wird plasmamembranpermeabler Farbstoff zugegeben (z.B. Calcein-AM oder Resazurin). Lebende Zellen verstoffwechseln es zu einem undurchlässigen fluoreszierenden Produkt, das durch Durchflusszytometrie nachgewiesen werden kann. Dieses Produkt kann nicht in metabolisch inaktiven toten Zellen gebildet werden.
• Messung der Aktivität freigesetzter intrazellulärer Enzyme: Tote Zellen setzen Enzym (z.B. LDH oder GAPDH) und die Zugabe seines Substrats führt zu einer Farbänderung, die üblicherweise als Änderung der Absorption oder Luminiszenz quantifiziert wird.
• Tote Zellen färben: Ein (fluoreszierender) Farbstoff gelangt durch die beschädigte Plasmamembran in die toten Zellen. Zum Beispiel bindet Propidiumiodid an DNA von toten Zellen und Fluoreszenzsignal wird durch Durchflusszytometrie gemessen.

HLA-Typisierung und Crossmatch-testEdit

CDC-Assays werden verwendet, um einen geeigneten Spender für eine Organ- oder Knochenmarktransplantation zu finden, nämlich Spender mit passendem Phänotyp des Histokompatibilitätssystems HLA. Zunächst wird die HLA-Typisierung für Patienten und Spender durchgeführt, um ihre HLA-Phänotypen zu bestimmen. Wenn ein potenziell geeignetes Paar gefunden wird, wird ein Crossmatch-Test durchgeführt, um auszuschließen, dass der Patient spenderspezifische Anti-HLA-Antikörper produziert, die eine Transplantatabstoßung verursachen könnten.

Die CDC-Form der HLA-Typisierung (mit anderen Worten serologische Typisierung) verwendet eine Charge von Anti-HLA-Antikörpern aus charakterisierten allogenen Antiseren oder monoklonalen Antikörpern. Diese Antikörper werden einzeln mit den Lymphozyten des Patienten oder Spenders und der Komplementquelle inkubiert. Die Menge der toten Zellen (und somit das positive Ergebnis) wird durch Färbung toter oder lebender Zellen gemessen. Heutzutage wird die CDC-Typisierung durch die molekulare Typisierung ersetzt, die Nukleotidsequenzen von HLA-Molekülen über PCR identifizieren kann.

Der CDC-Assay wird normalerweise zur Durchführung eines Crossmatch-Tests verwendet. Die Basisversion beinhaltet die Inkubation von Patientenserum mit Spenderlymphozyten und die zweite Inkubation nach Zugabe von Kaninchenkomplement. Das Vorhandensein toter Zellen (positiver Test) bedeutet, dass der Spender für diesen bestimmten Patienten nicht geeignet ist. Es stehen Modifikationen zur Erhöhung der Testempfindlichkeit zur Verfügung, einschließlich Verlängerung der minimalen Inkubationszeit, Zugabe von Antihumanglobulin (AHG), Entfernen ungebundener Antikörper vor Zugabe von Komplement, Trennung von T-Zell- und B-Zell-Teilmenge. Neben dem CDC-Crossmatch gibt es einen durchflusszytometrischen Crossmatch, der empfindlicher ist und sogar Komplement-nicht-aktivierende Antikörper nachweisen kann.