Makrophagen-Depletion durch Clodronat-haltige Liposomen reduziert neointimale Bildung nach Ballonverletzung bei Ratten und Kaninchen

Entzündungszellen spielen eine wichtige Rolle bei der Gefäßreparatur, die unmittelbar nach der Verletzung rekrutiert wird.1,2 Die Makrophageninfiltration im Atherektomiegewebe und der Aktivierungsstatus von Blutmonozyten korrelieren mit einer erhöhten Restenoserate.3,4 Die Wirkungen von Makrophagen bei der Restenose werden wahrscheinlich durch ihre Fähigkeit verursacht, zahlreiche Wachstumsfaktoren, Zytokine und Enzyme zu exprimieren, die zur Entwicklung der Restenose beitragen.5 Daher stellten wir die Hypothese auf, dass die systemische Inaktivierung von Monozyten und Makrophagen zu einer Abschwächung der neointimalen Bildung führen kann und dass Makrophagen eine zentrale Rolle bei der Pathogenese der Restenose spielen.

Die Depletion von Makrophagen kann durch systemische Injektion von Clodronathaltigen Liposomen erreicht werden.6 Clodronat gehört zur Familie der Bisphosphonate (BPs), Knochen suchende Mittel, die starke Inhibitoren von Osteoklasten sind. Wie andere BPs hat Clodronat eine schlechte Zellmembranpermeabilität.7 Liposomen werden von Zellen des retikuloendothelialen Systems, insbesondere Makrophagen, leicht aufgenommen. Die liposomenvermittelte Abgabe von Clodronat inaktiviert und tötet Makrophagen nach wirksamer Phagozytose8, ist jedoch für nichtphagozytische Zellen nicht toxisch.6

Methoden

Liposomen

Clodronat (Sifavitor) und Rhodamin RE (Avanti Polare Lipide) wurden in Liposomen verkapselt, die aus 50 µmol/L Distearoylphosphatidylglycerin (DSPG) (Avanti), 100 µmol/L Cholesterin (Sigma Chemicals) und 150 µmol/L 1,2- distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DSPC) (Avanti) durch Umkehrphasenverdampfungstechnik, wie an anderer Stelle beschrieben.9 Die durchschnittliche Größe der Liposomen betrug 190 ± 18 nm, 24,5 mmol / l bzw. 20 mmol / l, Clodronat und Lipide.

Die Validierung der biologischen Aktivität von LC wurde an Makrophagen-ähnlichen ROHEN 264-Zellen bestimmt. LC, aber nicht freies Clodronat reduzierte die Anzahl und Proliferation lebensfähiger Zellen dosisabhängig signifikant und beeinflusste die Lebensfähigkeit und Proliferation von glatten Muskelzellen (SMCs) oder Endothelzellen (EC) bei Konzentrationen bis zu 500 µmol / l (Daten nicht gezeigt) gemäß den veröffentlichten Daten nicht.8,10

Kaninchenmodell

Neuseeländische weiße Kaninchen (Harlan Laboratories, Jerusalem, Israel) mit einem Gewicht von 2,5 bis 3.5 kg wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien für die Tierpflege der Hebräischen Universität Jerusalem und der National Institutes of Health (USA) verwendet. Die Tiere erhielten eine atherogene Diät mit 2% Cholesterin und 6% Erdnussöl, beginnend 30 Tage vor der Angioplastie. Es wurde eine Hypercholesterinämie festgestellt (Plasmacholesterin > 1200 mg / dl). Die Tiere wurden mit Xylazin (7 mg / kg) und Ketamin (40 mg / kg) betäubt. Heparin (200 E / kg), Atropin (0,05 mg) und Norfloxacinnicotinat (70 mg) wurden verabreicht. Die Ballonverletzung wurde an der linken A. carotis communis mit einem 3-mm-Angioplastie-Ballonkatheter durchgeführt (Cordis, 2 × 1-minütige Inflation bei 8 atm). Die Tiere wurden randomisiert intravenösem liposomalem oder freiem Clodronat (15 mg/kg), leeren Liposomen oder Puffer zugeteilt. Ein Forscher, der für die Art der Versuchsgruppe geblendet war, führte die Experimente durch. Nach Euthanasie mit Pentothal wurden Arterien in situ mit 150 ml 4%iger Formaldehydlösung (pH 7) perfusionfixiert.4), zur morphometrischen Analyse aufbereitet und mit Verhoeff-Elastin-Färbung, Mayer-Hämatoxylin und Eosin sowie modifiziertem Movat-Pentachrom gefärbt.

Rattenmodell

Männliche Sabra-Ratten (Harlan Laboratories) mit einem Gewicht von 350 bis 420 g wurden verwendet. Das Rattenkarotisverletzungsmodell wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt.11,12 Liposomales Clodronat (15 mg/kg) wurde an den Tagen -1 und +6 injiziert. Die Organe wurden am 14. Tag entnommen und wie oben beschrieben weiterverarbeitet.

Morphometrische Analyse

Acht bis 10 Abschnitte in jedem Objektträger wurden mittels computergestützter morphometrischer Analyse (NIH-Bild) von einem für den Typ der Versuchsgruppe verblindeten Ermittler analysiert. Der Schnitt mit der größten luminalen Verengung durch neointima wurde wie zuvor beschrieben analysiert.11 Das Restlumen, die von der inneren elastischen Lamina begrenzte Fläche (Originallumen) und die von der äußeren elastischen Lamina umschriebene Fläche (arterielle Gesamtfläche) wurden direkt gemessen. Der Grad der neointimalen Verdickung wurde als Verhältnis zwischen der Fläche des Neointimums und dem ursprünglichen Lumen (% Stenose) und als Verhältnis zwischen der neointimalen Fläche und der Fläche der Medien (N / M) ausgedrückt. Der Grad der Remodellierung, der konstriktiven (negativ) und der expansiven (positiv) und des Remodellierungsverhältnisses (RR) wurde geschätzt, indem das Verhältnis der gesamten arteriellen Fläche des ballonverletzten Segments mit dem eines benachbarten, nicht verletzten Referenzsegments verglichen wurde.

Durchflusszytometrie

Antikoaguliertes Blut (200 µL) wurde für 30 Minuten (4°C, im Dunkeln) mit Maus-Anti-Human-RPE-konjugiertem Anti-CD14 (DAKO) inkubiert. FACS-Lysierlösung (1:20 Verdünnung) wurde 15 Minuten zugegeben. Die restlichen Zellen wurden gewaschen (×1500 RPM, 5 Minuten, 4°C) in FACS-Medium (PBS, 1% BSA, 0,02% Natriumazid) und zur Durchflusszytometrie in 1 ml FACS-Medium suspendiert. Monozyten wurden nach ihrer relativen Größe, Seitenstreuung und Fluoreszenz identifiziert.

Verteilung der Liposomen

Kaninchen wurden am Tag -1 mit Rhodamin-markierten Liposomen (0,4 mg / kg) und LC oder Puffer injiziert und an den Tagen +1 und +6 eingeschläfert. Blutmonozyten wurden unter Verwendung eines Ficoll-Gradienten (Sigma) und Zentrifugation (× 1500 RPM, 5 Minuten) getrennt. Geerntetes Gewebe wurde in Kochsalzlösung gespült; Schnitte wurden auf Objektträger montiert und durch konfokale Mikroskopie (Zeiss LSM 410) beobachtet.

Immunhistochemie

Explantierte Proben wurden nach kurzer Salzperfusion herausgeschnitten und sofort in einer Verbindung zur Kryosektion eingefroren (Ted Pella, Inc). Objektträger wurden entparaffiniert, mit 1% H2O2 in Methanol (10 Minuten) inkubiert, um endogene Peroxidase zu blockieren, und dann mit 10% Pferdeserum-PBS für (20 Minuten). Primärantikörper für Kaninchen RAM-11 (DAKO) oder PCNA (PC10, DAKO) wurden 1 Stunde bei 37°C appliziert. Die Schnitte wurden dann mit PBS gewaschen, gefolgt von einem biotinylierten Sekundärantikörper (Horse anti-mouse IgG, Vector Laboratory) und einem Avidin-Biotin-Peroxidase-Komplex (ABC Elite Kit, Vector Laboratory) für jeweils 30 Minuten. Die Farbentwicklung wurde durch 5-minütige Exposition mit 3,3′-Diaminobenzidintetrahydrochlorid (DAB-Peroxidase-Substrat, Sigma Chemical Co) in Gegenwart von Peroxidase-Substrat (Sigma) erreicht. Objektträger wurden leicht mit Kiemen Nr. 3 Hämatoxylin (Sigma) gegengefärbt. Die positive Färbung wurde unter einem Mikroskop (Olympus, BX40) bei 2 ×/0,25 10×/0 ausgewertet.25 vergrößerung und digitalisierte Videobilder. Die Prävalenz von Makrophagen wurde als mittlere prozentuale Fläche von positiv gefärbten Zellen in 5 bis 6 Hochleistungsfeldern bewertet.

IL-1β-Produktion und Transkription

Für diese Studien wurden separate Tiergruppen verwendet. Arterien und Lebern wurden in Kollagenase-Puffer homogenisiert und extrahiertes IL-1β wurde unter Verwendung kommerzieller ELISA-Kits (R & D-Systeme) gemessen.

Für die Analyse der reversen Transkription–Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) wurde RNA aus den Halsschlagadern unter Verwendung eines RNA-Isolationskits (Life Technologies) extrahiert. Qualität, Größe und Quantität der RNA wurden untersucht, und die Werte der Banden wurden auf die β-Aktin-mRNA-Expression normalisiert.13

Matrix-Metalloproteinase-2-Aktivität

Der Überstand des Homogenats in Kollagenase-Puffer wurde auf Kollagenase-Aktivität analysiert. Die Proben wurden getrennt auf Gelatine imprägniert (1 mg/ml: Difco) SPS 8% Polyacrylamidgele unter nicht reduzierenden Bedingungen, 30 Minuten in 2,5% Triton X-100 (BDH) geschüttelt, in Kollagenase-Puffer inkubiert (16 Stunden, 37°C) und mit 0,5% Coomassie G 250 (BioRad) in Methanol/Essigsäure/H2O (30:10:60) gefärbt. Die Bandintensität wurde mittels computerisierter Densitometrie (Molecular Dynamics Typ 300A) bestimmt.

Statistik

Die Daten werden als Mittelwert±SD ausgedrückt. Vergleiche der histologischen Befunde zwischen Kontroll- und Behandlungsgruppe wurden durch den t-Test des ungepaarten Studenten durchgeführt. Vergleiche von Blutmonozyten und Zytokinen im Zeitverlauf wurden mit 2-Wege-ANOVA-Analyse durchgeführt. Unterschiede wurden bei P < 0,05 als statistisch signifikant bezeichnet.

Ergebnisse

Prävention der postangioplastischen Hyperplasie

Bei Kontrolltieren wurde nach Ballonverletzung eine massive Proliferation von SMCs und extrazelluläre Matrixbildung beobachtet (Abbildung 1, a und b). Es wurden keine signifikanten Unterschiede zwischen der Behandlung mit leeren Liposomen, Kochsalzlösung oder freiem Clodronat in Lösung gefunden (Ergebnisse als Kontrollen zusammengefasst). Das N / M-Verhältnis betrug 1,4 ± 0,44 (Abbildung 1e) und die Luminalstenose betrug 75 ± 8%. LC (15 mg / kg, Tage -1 und +6) reduzierte das N / M-Verhältnis auf 0,66 ± 0,2 (Abbildung 1, c, d und e) und die Luminalstenose auf 41 ± 8%. In beiden Kontrollgruppen trat eine leichte expansive Remodellierung auf (RR=1. 22±0,24) und LC-behandelten Tieren (RR=1,29±0,25). Der mediale Bereich, die Knochenmorphologie und die Mineralzusammensetzung wurden durch die LC-Behandlung nicht beeinflusst (Daten nicht gezeigt). Es wurden keine offenen Infektionen und keine nachweisbaren systemischen Nebenwirkungen beobachtet.

Um den Effekt der Makrophagenabreicherung in einem nicht-hypercholesterinämischen Tiermodell (keine Schaumzellen) zu ermitteln, wurde das Karotisverletzungsmodell der Ratte verwendet.11 Das markierte Neointima wurde durch LC-Behandlung unterdrückt, ohne signifikante Veränderung der medialen und gesamten arteriellen Fläche (Tabelle).

Wirkmechanismus

Reduktion von Blutmonozyten und Gewebemakrophagen

Der Ausgangswert der Monozyten betrug 2,8±0,5% der weißen Blutkörperchen (WBC). Vor der Operation, 24 Stunden nach der LC-Injektion, waren die Monozyten stark auf < 0,2% der gesamten WBC reduziert (Abbildung 2, a und b), während die WBC-Zahl unverändert blieb. Drei Tage nach der Operation waren die Blutmonozyten bei Kontrolltieren leicht auf 3,5 ± 0,4% und bei LC-behandelten Tieren auf 0,7± 0,7% erhöht und kehrten nach 6 Tagen auf die Ausgangswerte zurück (Abbildung 2c).

Leber- und Milzmakrophagen wurden 6 Tage nach der Verletzung durch LC (RAM 11-Färbung) reduziert (Abbildung 3). Die positiv gefärbte Fläche in der Leber war signifikant reduziert von 21,5± 4% auf 14,7± 2,9% und in der Milz von 33,3± 1,5% auf 11,4± 3% bei Kontroll- und LC-behandelten Kaninchen. In ähnlicher Weise wurde bei LC-behandelten Kaninchen 3 und 6 Tage nach der Verletzung eine verminderte arterielle RAM-11-Färbung für Makrophagen beobachtet (Abbildung 4).

Die Reduktion von Monozyten und Makrophagen wurde auch durch Injektion fluoreszierender Liposomen (FL) nachgewiesen. Eine deutliche Reduktion des Fluoreszenzsignals wurde in Blutmonozyten (sowie in reduzierter Anzahl) und in Leber und Milz von LC-behandelten Tieren beobachtet (Abbildung 5). FL wurden in verletzten, aber nicht in intakten Arterien nachgewiesen. FL in Kombination mit LC reduzierte signifikant das Fluoreszenzsignal in der verletzten Arterienwand (Abbildung 5).

PCNA, IL-1β und Matrix-Metalloproteinase-2

Die für PCNA positiv gefärbte Fläche 6 Tage nach der Verletzung war signifikant reduziert von 5,6 ± 2,6% bei Kontrolltieren auf 1,7 ± 1,3% bei LC-behandelten Kaninchen (Abbildung 6, a und b). Neointima wurde zu diesem frühen Zeitpunkt, in dem die SMC-Proliferation maximal ist, kaum beobachtet.

Die Analyse der IL-1β-Spiegel im arteriellen Gewebe nach einer Verletzung ergab ein glockenförmiges Muster, das 6 Tage nach der Verletzung seinen Höhepunkt erreichte und nach 30 Tagen zu den Basalspiegeln zurückkehrte (Abbildung 7a), und eine signifikante Abnahme der IL-1β-Spiegel wurde nach 3 und 6 Tagen bei LC-behandelten Tieren beobachtet. Bei Kontrolltieren war die IL-1β-mRNA-Transkription am Tag 3 stärker als die schwächere Expression 1 Tag nach der Verletzung, aber beide wurden durch LC-Behandlung signifikant reduziert (Abbildung 7b). Die IL-1β-Spiegel in der Leber waren ebenfalls nach einmaliger Injektion von LC am Tag -1 reduziert und neigten sich nach 30 Tagen zu den Basalspiegeln (Daten nicht gezeigt).

Die Aktivität der arteriellen Matrix-Metalloproteinase (MMP-2) nahm nach der Verletzung zu, zeigte ein glockenförmiges Muster, das nach 6 Tagen (292 ± 46) seinen Höhepunkt erreichte und nach 14 Tagen wieder auf das Grundniveau zurückkehrte (Abbildung 7c). LC linderte die MMP-2-Aktivität signifikant und betrug am Tag 6 nur 52 ± 17.

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Diese Studie zeigt zum ersten Mal, dass die Inaktivierung von Makrophagen durch systemische Verabreichung von liposomenverkapseltem Clodronat den Luminalverlust nach Ballonverletzung sowohl bei Ratten als auch bei hypercholesterinämischen Kaninchen hemmt. Diese Ergebnisse bestätigen unsere Hypothese, dass Makrophagen eine zentrale Rolle bei der Pathogenese beschleunigter Arteriopathien spielen. Die beobachtete Zunahme der luminalen Fläche wurde hauptsächlich durch Verringerung der neointimalen Hyperplasie erreicht. Eine leichte Zunahme des expansiven Umbaus wurde ebenfalls gezeigt, aber sein Beitrag zum Unterschied in der luminalen Fläche war minimal.

Clodronat gehört zur Familie der BPs, Arzneimittel, die klinisch bei Knochenerkrankungen einschließlich Osteoporose eingesetzt werden. Da freie BPs stark hydrophil und negativ geladen sind, sind sie fast nicht in der Lage, Zellmembranen zu durchqueren.7 Die BP-Aufnahme durch knochenresorbierende Osteoklasten (die als Makrophagen aus Blutmonozyten stammen) tritt auf, wenn die Zellen arzneimittelbeschichteten Knochen verschlingen.7 Weder freies Clodronat noch LC hemmten die SMC- oder EC-Proliferation oder die neointimale Bildung. Eine effektive und selektive Endozytose von Clodronat in Makrophagen wird durch Verkapselung von Clodronat in Liposomen erreicht.9,10,14 Nach der Phagozytose unterbricht die lysosomale Wirkung die Fettdoppelschichten des Liposoms, und freies Clodronat wird in die Zelle freigesetzt, was zu irreversiblen Funktionsschäden und Apoptose führt.8,15

Die Verabreichung von LC hat wahrscheinlich die Frühphasenreaktion auf eine Verletzung abgebrochen, die durch Makrophagenmigration als Reaktion auf die MCP-1-Expression vermittelt wird.16 Injektion von LC vor der Verletzung stark abgereicherte Blutmonozyten (Abbildung 2) und Makrophagenzahl und -aktivität in Leber, Milz und verletzter Arterienwand (Abbildungen 3, 4 und 5). Die zum Zeitpunkt der Verletzung verfügbare Reduktion der Monozyten verringerte die Intimahyperplasie, möglicherweise ähnlich wie bei der Deaktivierung von Blutmonozyten durch IL-10.17, die die Monozyten- / Makrophagenmigration aus dem Lumen und / oder der Adventitia in das verletzte Gefäß blockierte (Abbildung 5)) verhindert die Auswirkungen dieser Zellen auf die SMC-Migration und -Proliferation.

IL-1β- und MMP-2-Spiegel wurden in verletzten arteriellen Segmenten nach LC-Behandlung reduziert. Diese Hauptprodukte aktivierter Makrophagen, die nach einer arteriellen Verletzung ausgeschieden werden, tragen zum Prozess der neointimalen Proliferation bei.18-20 Reduzierte SMC-Proliferation kann auch zur Reduktion von IL-1β und MMP-2.21 beitragen, da LC SMCs und ECs nicht beeinflussen und keine Wirkung auf Fibroblasten haben,9 Der Makrophage ist wahrscheinlich das primäre Ziel für LC. Die Hemmung der Intimahyperplasie im Rattenmodell ohne Schaumzellen in der Arterie unterstützt weiterhin die systemische Depletion von Makrophagen als Mechanismus, der die SMC-Proliferation und die neointimale Bildung antreibt. Zusammengenommen reduzierte diese vorübergehende systemische immunmodulatorische und entzündungshemmende Wirkung die SMC-Migration und -proliferation sowie die arterielle Restenose.

Unsere Ergebnisse stimmen mit den positiven Effekten überein, die nach Modulation der Makrophagenfunktion durch verschiedene Modalitäten beobachtet wurden. Eine verminderte Neointimabildung nach Verletzung wurde bei Kaninchen durch Blockade von Mac-122 und bei Mac-1–defizienten Mäusen erreicht.23 So, in Übereinstimmung mit den jüngsten Berichten, 9,17,22,23 der Entzündungsprozess spielt eine zentrale Rolle in der Kaskade der neointima Bildung. Makrophagen-Depletion reduziert auch Hyperplasie von Venentransplantaten.24 Ungeachtet der unterschiedlichen Pathologie in Bezug auf Auslöser, betroffenes Gefäß, darunter liegende Plaque in der angioplastischen Arterie, Zusammensetzung des stenotischen Gewebes und Dauer des Prozesses deutet der positive Effekt im Venentransplantatmodell auf eine gemeinsame Rolle von Makrophagen bei der Stimulierung der vaskulären Intimahyperplasie hin.

Implikationen und Einschränkungen

Freies Clodronat durchdringt keine Zellen und hat eine kurze Halbwertszeit im systemischen Kreislauf.6 Clodronat, das aus toten Makrophagen und Liposomen austritt, reichert sich in anderen Geweben als Knochen nicht signifikant an. Nach der LC-Behandlung wurde kein Effekt auf das somatische Wachstum oder den Serummineralgehalt beobachtet, da das Ergebnis der liposomalen Formulierung, wie bei den meisten anderen Liposomen und partikulären Wirkstoffabgabesystemen, im retikuloendothelialen System lag. Darüber hinaus sollten zwei Injektionen von 15 mg / kg freiem Clodronat keine Auswirkungen auf den normalen Knochen haben.25

Die Inaktivierung von Makrophagen birgt die Gefahr der Immunsuppression und Infektion. Wie in Studien an Mac-1-defizienten Mäusen 26 und Ratten 24 wurde in unserer Studie jedoch keine offene Infektion mit vorübergehendem Makrophagenabbau beobachtet. Die Blutmonozyten erholten sich in dieser Studie 6 Tage nach der Injektion vollständig und die IL-1β-Konzentrationen kehrten auf die Grundwerte zurück. Andere haben gezeigt, dass die Wiederherstellung der Makrophagenfunktion 4 bis 6 Tage nach LC-induzierter Depletion keine langfristigen toxischen Wirkungen hervorruft.6,14 Die klinischen Auswirkungen einer vorübergehenden partiellen Depletion von Leber- und Milzmakrophagen mit systemischer LC sollten in Studien am Menschen weiter untersucht werden.

Eine große Anzahl von Berichten über pharmakologische Versuche, die Intima-Hyperplasie bei Tieren zu hemmen, wurden nicht in eine nachfolgende Hemmung der Restenose beim Menschen übersetzt. Die aktuelle Studie verwendet LC als Untersuchungsinstrument, um die Rolle der Entzündung bei der Gefäßreparatur und dem möglichen Wert der Modulation der angeborenen Immunität bei der Verringerung der Intimahyperplasie nach Verletzungen aufzuklären. Dass der Nutzen in zwei Tiermodellen, der Ratte und dem hypercholesterinämischen Kaninchen, mit unterschiedlichen Verletzungen und unterschiedlichen Entzündungsgraden beobachtet wurde, unterstützt die wichtige Rolle von Monozyten und Makrophagen bei der Gefäßreparatur und erhöht den Vorhersagewert für die Hemmung der Restenose beim Menschen.

Makrophagenreiche Bereiche sind bei atherosklerotischen Läsionen von Patienten mit instabiler Angina pectoris und akutem Myokardinfarkt weit verbreitet,3 und Makrophagen vermitteln wahrscheinlich einen Bruch der atherosklerotischen Plaque und ein plötzliches Auftreten akuter Koronarsyndrome.27 Weitere Studien sind erforderlich, um zu untersuchen, ob die Depletion von Makrophagen durch liposomale Bisphosphonate eine Strategie zur Stabilisierung anderer entzündungsvermittelter Vaskulopathien und Kardiomyopathien, einschließlich akuter Koronarsyndrome, bieten kann.

Zusammenfassend hemmte die Verabreichung von LC die neointimale Proliferation nach Ballonverletzung in der Ratte und in den hypercholesterinämischen Kaninchenmodellen. Der vorgeschlagene Mechanismus ist eine systemische selektive, transiente Modulation der Monozyten / Makrophagen-Aktivität. Makrophagen spielen, obwohl sie im neointimalen Gewebe relativ dürftig sind, eine wichtige Rolle im Prozess der neointimalen Proliferation. Daher verringert eine frühe Modulation und Inaktivierung von Makrophagen für 1 Woche nach der Verletzung die postangioplastische Arterienverengung zu einem späteren Zeitpunkt signifikant.

Fußnoten