Mindestinformationen für die Berichterstattung über den Comet-Assay (MIRCA): Empfehlungen zur Beschreibung von Comet-Assay-Verfahren und -ergebnissen

Die MIRCA-Richtlinien wurden von Mitgliedern der hCOMET COST Action mit dem Ziel erstellt, die Analyse und Berichterstattung über Comet-Assay-Ergebnisse zu verbessern (http://www.hcomet.eu/). Die Autoren sind Comet-Assay-Experten mit mindestens acht Jahren Erfahrung mit diesen Assays (15 der Autoren haben > 20 Jahre einschlägige Erfahrung). Wir haben einen internetbasierten Fragebogen verwendet, um Meinungen der Autoren zur Wichtigkeit von Berichtsdetails zu sammeln (Tabelle 1; Ergänzende Daten). Jede Information wurde von den Autoren als ‘wesentlich’, ‘wünschenswert’ oder ‘nicht wichtig’ eingestuft, und für die Klassifikationen wurde ein Schwellenwert von ≥75% Kongruenz verwendet. Wenn die Anzahl der Antworten mit ‘wesentlichen Informationen’ die Schwelle von 75% der Zustimmung nicht erreichte, wurden die Antworten mit ‘wesentlichen Informationen’ und ‘wünschenswerten Informationen’ kombiniert, und die Information wurde als ‘wünschenswerte Information’ eingestuft, wenn ≥75% der Autoren zustimmten, dass sie entweder ‘wesentlich’ oder ‘wünschenswert’ war. In Tabelle 1 finden Sie Erläuterungen zu jeder Empfehlung.

Spezifische MIRCA-Empfehlungen für jeden Schritt des Comet-Assays

Schritt 1A: Isolierung von Zellen und Herstellung von Einzelzellsuspensionen

Da der Comet-Assay Suspensionen von Einzelzellen verwendet, müssen Proben, die nicht als Einzelzellen erhalten werden, mechanisch oder enzymatisch behandelt werden, um die Bindung von Zellen an eine extrazelluläre Matrix oder aneinander zu stören. Die Homogenisierung von Geweben durch mechanische Störung kann selbst DNA-Schäden verursachen, während der enzymatische Aufschluss von Gewebe aufgrund der Aktivität endogener DNA-Reparaturenzyme zur Entfernung von DNA-Läsionen führen oder die DNA-Schadensniveaus durch Freisetzung von Nukleasen aus den Zellen erhöhen kann. Die Zusammensetzung des Homogenisierungspuffers ist eine ‘wünschenswerte’ Information, insbesondere in Bezug auf die Komponenten, die zur Erhaltung der DNA-Integrität notwendig sind (z. B. Ethylendiamintetraessigsäure)24,25. Eine Beschreibung des Verfahrens zur Isolierung von Einzelzellsuspensionen, einschließlich der Homogenisierung des Gewebes, wird als ‘wünschenswerte’ Information angesehen, über die in Artikeln berichtet wird.

Blutproben werden häufig in Human-Biomonitoring-Studien verwendet. Da Blut eine heterogene Zellpopulation darstellt, sind detaillierte Informationen über die Zellpopulation in Publikationen unerlässlich. Der Text sollte genau beschreiben, ob es sich bei den Proben um Vollblut (einschließlich roter Blutkörperchen), Leukozyten, einkernige Blutzellen oder eine Teilmenge von Zellen (z. B. Lymphozyten) handelt. Es kann auch hilfreich sein, Informationen über das Verfahren zur Venenpunktion, die Art des Antikoagulans und die anschließende Methode der Zellisolierung (d. H. Zentrifugations- und Waschschritte) für diejenigen, die das Experiment wiederholen, anzugeben. Informationen über die Lagerbedingungen der Zellen oder Gewebe, wenn sie kryokonserviert sind, sowie die Gefriermethode (z. B. Schnappgefrieren auf Trockeneis oder in flüssigem Stickstoff oder ein langsames Gefrierverfahren) und das Auftauverfahren werden als wesentliche Informationen angesehen, da diese Prozesse nachweislich das Grundniveau der DNA-Migration beeinflussen26.

Schritt 1B: Vorbereitung von Substratzellen für den In-vitro-DNA-Reparatur-Assay

Jeder eukaryotische Zelltyp kann als Substratzelle für den In-vitro-DNA-Reparatur-Assay verwendet werden, und der Zelltyp und die Zelldichte sind ‘wünschenswerte’ Informationen. Es ist ‘wesentlich’, die Methode und die Art der genotoxischen Verbindung anzugeben, die verwendet werden, um DNA-Läsionen in den Substratzellen und nachfolgende Zelllagerungsbedingungen zu induzieren, während das Gesamtniveau der DNA-Läsionen, die in den Substratzellen nachgewiesen werden können (z., die Anzahl der Formamidopyrimidin-DNA-Glykosylase-sensitiven Stellen in Zellen, die mit Ro19-8022 plus Licht behandelt wurden) wird nur als ‘wünschenswerte’ Information angesehen.

Schritt 1C: Assay-Kontrollen

In diesem Artikel beziehen sich Assay-Kontrollen auf Proben, die in jedem Comet-Assay-Experiment enthalten sind; Diese werden manchmal als Referenzstandards, interne Kontrollen oder technische Kontrollen bezeichnet16,27. Die Assaykontrollen sind typischerweise kryokonservierte Aliquots aus einer einzigen Charge von Zellen, die einem DNA-Strangbrechungsmittel (z.B., ionisierende Strahlung, Wasserstoffperoxid oder Methylmethansulfonat) oder eine Behandlung, die eine bestimmte Art von DNA-Läsion verursacht (z. B. der Photosensibilisator Ro19-8022 plus Licht oder Kaliumbromatbehandlung, um DNA-Oxidation zu induzieren). Es gibt verschiedene Assay-Kontrollen für den alkalischen Standard-Comet-Assay und den enzymmodifizierten Comet-Assay. Die für den enzymmodifizierten Assay verwendete Verbindung sollte keine DNA-Strangbrüche erzeugen, da diese den dynamischen Bereich der enzymsensitiven Stellen verringern. In Biomonitoring-Studien sowie in Querschnitts-, interventionellen und klinischen Studien können nicht belichtete Zellen als Assay-Kontrollen verwendet werden. Es ist wichtig, den Grad der Schädigung in den Assay-Kontrollen und die Assay-Variation (Standardabweichung) sowohl im Standard- als auch im enzymmodifizierten Comet-Assay zu melden.

Der in vitro DNA Repair Assay verwendet interne experimentelle Kontrollen, die auch bei der Berechnung der Reparaturaktivität verwendet werden, anstatt Assaykontrollen an sich. Es handelt sich um ‘wesentliche’ Informationen, um das Ausmaß der DNA-Reparaturschnitte in Nukleoiden von (i) nicht exponierten Substratzellen, die mit Reaktionspuffer inkubiert wurden, zu melden, um das Grundniveau der DNA-Schädigung in der Substrat-DNA zu bestimmen (d. h. die ‘Hintergrundkontrolle’); (ii) exponierten Zellen, die mit dem Reaktionspuffer inkubiert wurden, um das Ausmaß unspezifischer DNA-Strangbrüche oder abasischer Stellen aufzudecken, die sich aus der Behandlung mit dem schädigenden Mittel ergeben (d. h. die ‘Behandlungskontrolle’); (iii) nicht exponierte Substratzellen, die mit Proteinextrakt aus der Probe inkubiert wurden, um auf unspezifische Inzisions- oder Spaltaktivität zu überprüfen (d. h. die ‘Spezifitätskontrolle’); und (iv) exponierte Substratzellen, die mit läsionsspezifischem Enzym inkubiert wurden, ähnlich den Assaykontrollen für den enzymmodifizierten Comet-Assay (d. h. die ‘Inkubationsreaktionskontrolle’).

Schritt 1D: Negativ- und Positivkontrollen

In diesem Artikel beziehen sich Negativ- und Positivkontrollen auf die Versuchsgruppen, wie in der OECD-Leitlinie (TG 489) für den in vivo comet Assay in tierischen Geweben18 beschrieben. Somit beziehen sich negative und positive Kontrollen auf das gesamte Experiment. Eine Positivkontrolle bezieht sich auf eine direkt oder indirekt wirkende genotoxische Verbindung, die DNA-Strangbrüche oder enzymsensitive Stellen erzeugt, die mit dem Comet-Assay nachgewiesen wurden. Für den enzymmodifizierten comet-Assay steht keine Positivkontrollliste zur Verfügung, die den Verbindungen entspricht, die die OECD als Positivkontrollen für den alkalischen Comet-Assay (zur Induktion von DNA-Strangbrüchen) in bestimmten tierischen Geweben auflistet. Darüber hinaus gibt es keine Positivkontrolle für Human-Biomonitoring-Studien, da gesunde Menschen nicht absichtlich einem genotoxischen Wirkstoff ausgesetzt werden können. Positivkontrollen werden bereits in Zellkulturversuchen in der genetischen Toxikologie als obligatorisch angesehen und werden de facto in Artikeln, die den Comet-Assay verwenden, ‘wesentliche’ Informationen sein. In Tierversuchen wurden jedoch für praktische Zwecke Daten zu Assaykontrollen (d.h.(Proben, die im obigen Abschnitt mit dem Titel ‘Schritt 1C, Assay-Kontrollen’ erwähnt wurden) ausreichend sind, während Ergebnisse von echten Negativ- und Positivkontrollen nur als ‘wünschenswerte’ Information angesehen werden.

Schritt 2: Einbettung der Zellen in Agarose

Der Comet-Assay wurde ursprünglich unter Verwendung von drei Schichten Agarose auf Objektträgern entwickelt, wobei die mittlere Schicht die Zellen enthielt. Die oberste Schicht aus Agarose ist jedoch nicht erforderlich, und bestimmte Verfahren verwenden keine untere Schicht (z. B. Gelbond-Filmassays). Es ist ‘wünschenswert’, die Art der Folien und die Größe (d. h., Oberfläche) der Gele, da der Anteil der Zellen nahe dem Rand des Gels mit abnehmender Gelgröße zunimmt und die DNA in Nukleoiden am Rand des Gels anders als in Nukleoiden zum Zentrum des Gels wandern kann22. Die endgültige Konzentration der Agarose (mit den darin eingebetteten Zellen) ist ‘essentiell’ zu berichten, da die Migration der DNA von der Dichte des Gels abhängt.

Schritt 3: Lyse der Zellen

Es gibt verschiedene Verfahren zur Lyse von Zellen im Comet-Assay. Informationen über die Zusammensetzung der Lyselösung sind ‘essentiell’. Ein zusätzlicher Enzyminkubationsschritt (z. B. mit Proteinase K) kann für bestimmte Zelltypen erforderlich sein, und Einzelheiten der Inkubation sollten ebenfalls als wesentliche Informationen angegeben werden. Einige Berichte deuten darauf hin, dass die Dauer der Lyse die Stabilität bestimmter Arten von DNA-Läsionen beeinflussen kann28,29,30, daher sind die Dauer der Lyse und die Temperatur der Lyselösung wünschenswerte Informationen.

Schritt 4A: Reparaturenzym-Behandlung im enzymmodifizierten Comet-Assay

Da die Lyselösung die Aktivität des Reparaturenzyms hemmen kann, ist es ‘wünschenswert’ festzustellen, ob zwischen dem Lyseschritt und der Enzymbehandlung ein Waschschritt durchgeführt wurde (d. h. Zusammensetzung des Waschpuffers, Anzahl der Waschungen und Dauer). Es ist wichtig, Informationen über die Quelle der Reparaturenzyme weiterzugeben, da sich Enzyme verschiedener Hersteller nachweislich sowohl in ihrer Aktivität als auch in ihrer Spezifität gegenüber Nukleobasenläsionen16 unterscheiden. In den meisten Comet-Studien werden Titrationskurvenexperimente durchgeführt, um optimale Bedingungen für die Enzymbehandlung31 zu ermitteln; Die Ergebnisse von Enzymtitrationskurven werden jedoch selten berichtet und hier als ‘wünschenswerte’ Information eingestuft (stattdessen könnte auf eine frühere Studie verwiesen werden), obwohl wir es für ‘wesentlich’ halten, die Dauer und Temperatur der Behandlung anzugeben. Die Konzentration des auf das Gel aufgebrachten Enzyms ist eine ‘wesentliche’ Information; es ist vorzuziehen, die Konzentration in enzymatischen Einheiten (U / ml) anzugeben, obwohl die Proteinkonzentration (mg / ml) ebenfalls nützlich ist. Die Art der Inkubationseinheit (z. B. Inkubator, Objektträgergraben oder 12-Gel-System) und die Art der Inkubation sind wünschenswerte Informationen. Es sollte angegeben werden, ob die Inkubation (i) in einem Enzymbad oder mit einem Tropfen und Deckglas auf dem Objektträger, (ii) in einer Standard-2-Gel-Version, 12-Gel- oder Multiple-Well-System oder (iii) in einer befeuchteten Box in einem Inkubator, auf einer Heizplatte oder in einem beheizten Objektträgergraben durchgeführt wurde.

Schritt 4B: Extraktvorbereitung und Inkubation für den In-vitro-DNA-Reparaturtest

Es ist ‘wünschenswert’, die Anzahl der Zellen oder die Gewebemasse anzugeben, die zur Herstellung der Proteinextrakte verwendet werden, wohingegen es ‘wesentlich’ ist, die endgültige Proteinkonzentration von Zell- oder Gewebeextrakten anzugeben, die der Substrat-DNA zugesetzt wird. Die Zusammensetzung des Extraktionspuffers (‘wünschenswerte’ Information) ist weniger entscheidend als die Zusammensetzung des Inkubationspuffers (‘wesentliche’ Information), da letzterer das Hintergrundniveau der DNA-Migration beeinflussen kann. In Übereinstimmung mit den Informationen für den enzymmodifizierten Comet-Test ist es wünschenswert, die Ergebnisse von Titrationsexperimenten zu melden oder auf frühere Studien desselben Labors zu verweisen, in denen diese durchgeführt wurden. Das Volumen des Extrakts, das den Gel-eingebetteten Substratzellen zugesetzt wird, ist eine ‘wünschenswerte’ Information. Es ist wichtig, die Dauer und Temperatur der Inkubationszeit anzugeben, da diese die Anzahl der Reparaturschnitte beeinflussen. Was den enzymmodifizierten Comet-Assay betrifft, so ist die Art der Inkubation eine wünschenswerte Information für den In-vitro-Reparatur-Assay. Informationen über die Identität des Enzyms, das als Inkubationsreaktionskontrolle verwendet wird (Angabe der Menge an DNA-Läsionen in den Substratzellen), und die Zusammensetzung des Puffers, der für das Hintergrundniveau von DNA-Reparaturinzisionen in unbelichteten Substratzellen verwendet wird, sind ‘wesentlich’, da sie der Schlüssel zum Nachweis der Zuverlässigkeit der DNA-Reparaturinzisionsaktivität sind.

Schritt 5: Alkalische Behandlung

Die hochalkalische pH-Lösung unterbricht die Wasserstoffbrückenbindung, die die DNA-Stränge zusammenhält, und wandelt auch bestimmte Nukleobasenläsionen in DNA-Strangbrüche um. Somit kann die Dauer der alkalischen Behandlung das Niveau der DNA-Migration in der nachfolgenden Elektrophorese beeinflussen32,33,34. Spezifische Informationen über die Zusammensetzung der alkalischen Lösung, pH-Wert, Temperatur und Dauer der Behandlung sind somit ‘wesentliche’ Informationen zu berichten.

Schritt 6: Elektrophorese

Die wichtigsten Treiber der DNA-Migration sind die Dauer der Elektrophorese und das elektrische Potential (Spannungsabfall über der Elektrophoresetankplattform)35. Es ist wichtig, dass die Zusammensetzung des Elektrophoresepuffers, die Stärke der Elektrophorese (Spannungsgradient (V / cm) über der Elektrophoresetankplattform) und die Dauer der Elektrophorese angegeben werden. Hohe Temperaturen während der Elektrophorese können die DNA-Migration beeinflussen36; Daher sind Informationen über die Temperatur der Elektrophoreselösung ‘wesentlich’, und dies kann von Beschreibungen der Schritte begleitet sein, die unternommen werden, um die Temperatur konstant zu halten (z. B. Kühlen der Plattform oder Zirkulieren des Puffers).

Schritt 7: Neutralisation

Bei diesem Schritt wird überschüssige alkalische Lösung von den Objektträgern entfernt, um eine effiziente Färbung zu gewährleisten. Es ist wünschenswert, die Zusammensetzung der Neutralisationslösung zu beschreiben.

Schritt 8: Färbung und Visualisierung

DNA-bindende Farbstoffe haben unterschiedliche Bindungsaffinitäten zur DNA und können daher die Berechnung der primären Comet-Assay-Deskriptoren in der Bildanalysesoftware unterschiedlich beeinflussen36,37,38. Die Art des Farbstoffs ist eine ‘wesentliche’ Information, während die Konzentration eine ‘wünschenswerte’ Information ist, ebenso wie die Zeit zwischen Färbung und Visualisierung. Die Intensität des Lichts von verschiedenen Arten von Mikroskoplampen unterscheidet sich. Darüber hinaus variiert es aufgrund des Alters der Lampe und der Zeit, in der sie während des Zählens von Kometen eingeschaltet wurde. Es gibt jedoch kein Standardverfahren, um die Lichtintensität zu messen und den Grad der DNA-Migration entsprechend zu korrigieren. Darüber hinaus kann derselbe Komet bei verschiedenen Mikroskopvergrößerungen unterschiedliche DNA-Migrationsniveaus aufweisen. Daher ist es ‘wünschenswert’, die für die Bewertung verwendete Mikroskopvergrößerung anzugeben. Es ist ‘wünschenswert’, repräsentative Bilder von Kometen (z., Kontrolle mit geringer oder keiner Migration, moderate und umfangreiche DNA-Migration) neben den gemeldeten DNA-Migrationsniveaus.

Schritt 9A: Scoring und Datenanalyse

Dieser Schritt erfordert die Meldung ‘wesentlicher’ Informationen für den primären Comet-Assaydeskriptor (z.. %DNA in Schweif, Schweiflänge, Schweifmoment oder visuellem Score), die Anzahl der pro Probe analysierten Kometen und wie das Gesamtniveau der DNA-Migration ausgedrückt wird (z. B. Median oder Mittelwert der Kometen-Scores). Es ist nicht wichtig, das individuelle Ergebnis jedes Kometen in jedem Gel zu melden; sie werden kombiniert, um das Gesamtschadensniveau zu berechnen. Da nicht ausgeschlossen werden kann, dass verschiedene Bildanalyse-Softwarepakete unterschiedliche Möglichkeiten zur Berechnung des primären Comet-Assay-Prädiktors haben, ist es unerlässlich, die verwendete Software (Softwarename, Hersteller, Version) zu melden. Alle primären Deskriptoren teilen die Einschränkung, dass es notwendig ist, Fachwissen im Comet-Assay zu haben, um zu verstehen, was sie bedeuten, wohingegen, wenn eine Kalibrierungskurve erstellt wird (unter Verwendung ionisierender Strahlung, die Brüche bei einer bekannten Frequenz induziert), Ergebnisse können in relative Läsionsfrequenz im Vergleich zu unveränderten Nukleotiden oder Nukleobasenpaaren umgewandelt werden; Solche Daten sind eindeutig und vermitteln Informationen, die alle Forscher verstehen können39. Über das Verfahren zur Gewinnung einer Kalibrierungskurve unter Verwendung ionisierender Strahlung und zur Umwandlung der DNA-Migrationsniveaus in die Läsionshäufigkeit relativ zu unveränderten Nukleotiden oder Nukleobasenpaaren wurde bereits früher berichtet40. Daher ist es wünschenswert, die Ergebnisse als Läsionen pro 109 unveränderten Nukleotiden oder 106 Nukleobasenpaaren zu melden.

Schritt 9B: Berechnung der enzymsensitiven Stellen bzw. der Nettozahl der Inzisionen in der Substrat-DNA für den In vitro DNA repair Assay

Die Inkubation mit DNA Repair Enzymen erhöht den Grad der DNA Migration, da sowohl der Basalwert der DNA Strangbrüche als auch enzymspezifische Läsionen zur Gesamtzahl der DNA Strangbrüche beitragen. Da die DNA-Migration, die dem Grundniveau der DNA-Schädigung und enzymspezifischen Läsionen zugeschrieben wird, von verschiedenen Mechanismen der Genotoxizität herrühren kann, reicht es nicht aus, nur das Gesamtniveau der DNA-Schädigung nach der Enzymbehandlung anzugeben. Stattdessen ist es ‘wesentlich’, die Genotoxizität als enzymsensitive Stellen zu melden, an denen das Grundniveau der DNA-Migration von der DNA-Migration in den enzymbehandelten Objektträgern abgezogen wurde.

Da der In-vitro-DNA-Reparaturassay dieselben Substratzellen mit allen Zell- oder Gewebeextraktproben verwendet, ist es nicht erforderlich, gleichzeitige Hintergrund- und Behandlungskontrollen für jede Probe im selben Experiment (d. h. Assaylauf) durchzuführen. Es kann mehr als ein Substrat (z., bei der Analyse sowohl der Basen- als auch der Nukleotid-Exzisionsreparaturaktivität), und daher sind separate Kontrollen für jede Art von DNA-Reparaturassay erforderlich. Es ist ‘wesentlich’, die Nettoschnitte durch den Reparaturextrakt in der Substrat-DNA zu melden.

Schritt 9C: Statistische Analyse der Ergebnisse

Statistische Analysen sind ‘essentiell’. Die Art der statistischen Analyse hängt vom Studiendesign ab und folgt den allgemeinen Annahmen statistischer Tests in der genetischen Toxikologie und im Biomonitoring41,42.