Nachweis und Identifizierung durch PCR von Clostridium chauvoei in klinischen Isolaten, Rinderkot und Substraten aus Biogasanlagen
Proben aus Verdachtsfällen von Blackleg
Für Muskelproben aus Verdachtsfällen von Blackleg sind die Ergebnisse der Kultur auf FAA-Platten, gefolgt von PCR aus Koloniematerial stimmte mit der biochemischen Identifikationsmethode überein oder schnitt sogar besser ab (Tabelle 2). Diese Ergebnisse stimmen mit Uzal et al. . Diese Studie zeigte, dass die DNA-Präparation aus Kultur vor der PCR bessere Ergebnisse lieferte als die direkt auf Biomasse angewendete PCR.
Die Kultur mit anschließender biochemischer Identifizierung ist bei Proben mit einem hohen Gehalt an kontaminierender Flora aufgrund der Notwendigkeit einer Reinkultur kompliziert und die Empfindlichkeit war wesentlich geringer als bei Kultur und PCR. In acht Fällen war es nicht möglich, C. chauvoei durch Kultur und biochemische Identifizierung nachzuweisen, aber der Organismus wurde durch PCR nachgewiesen (Tabelle 2). Für die Diagnose von Blackleg wird bei der Autopsie Muskelgewebe entnommen, da die Menge an C. chauvoei im Muskelgewebe wahrscheinlich höher ist als im Blut. Die einzige Blutprobe wurde falsch entnommen, aber die Frage war Blackleg.
Ebenso lieferten Kultur und Nachweis durch PCR in einer früheren Studie eines Blackleg-Ausbruchs bessere Ergebnisse als biochemische Analysen . In einem der Fälle wurde die Primärkultur eines Muskels auf einer Blutagarplatte von C. septicum überwachsen, ergab jedoch in der PCR eindeutig positive Ergebnisse für C. chauvoei.
In den meisten klinischen Fällen von Blackleg die Menge an C. chauvoei in infiziertem Gewebe ist hoch und kann leicht durch die PCR-Methode unabhängig von kontaminierenden Flora nachgewiesen werden. Darüber hinaus ist die PCR-Methode viel schneller als die herkömmliche biochemische Nachweismethode, die mindestens fünf Tage dauert, und es ist wichtig, eine reine Kultur des Stammes zu haben, was zusätzliche Zeit für die Kultur erfordern kann. Um eine Kontamination der Flora zu vermeiden, sollte das Muskelgewebe nicht zu klein sein; ungefähr 100-200 g wären ausreichend. Ohne Reinkultur können in Zukunft keine Stämme mehr für nachfolgende Untersuchungen verwendet werden, was ein Nachteil der Verwendung des PCR-Nachweises als alleinige Methode ist.
Bei versuchsweise mit C. chauvoei infizierten Rindern wurden PCR-Analysen am Muskel und anderen Organen durchgeführt und C. chauvoei in allen untersuchten Organen nachgewiesen. Gehackte Muskelstücke aus Verdachtsfällen von Blackleg wurden direkt per PCR getestet und mit Kultur verglichen. Der Nachweis durch PCR ergab bessere Ergebnisse als Kultur und biochemische Identifizierung , was im Widerspruch zu den Ergebnissen der vorliegenden Studie steht, bei der nur 12% (3 von 24) der Blut- oder Muskelstücke über der Nachweisschwelle der PCR lagen, während 9% der Fleischsaftproben über der Nachweisschwelle lagen (Tabelle 2). Hemmstoffe sind wahrscheinlich im Muskelgewebe vorhanden. Inhibitoren für die enzymatische Reaktion der PCR-Amplifikation wurden in Leber, Milz und Niere identifiziert, und es können ähnliche Inhibitoren im Muskelgewebe vorhanden sein. Die Ergebnisse von Muskelstücken, die in sterilen physiologischen Kochsalzproben (26%) mazeriert wurden, entsprachen nicht gut denen des biochemischen Tests. Die direkte PCR an Muskelgewebe oder ähnlichen Proben ist wahrscheinlich nicht geeignet, um Kulturschritte zu ersetzen, denen biochemische Tests oder PCR folgen.
Muskelproben durch Tupfer gesammelt
Um zu untersuchen, ob es notwendig ist, Muskelgewebe zur Analyse von C. chauvoei zu senden oder ob es ausreicht, Tupfer zur Probenentnahme zu verwenden, wurde ein Postdienst simuliert. Von den 22 untersuchten Muskelgeweben lagen 64% über der Nachweisschwelle der PCR. Für Abstriche aus den gleichen Proben nach der Postdienstsimulation lagen 36% bis 47% Abstriche über der Nachweisschwelle (Tabelle 3). Es wäre praktischer, Proben mit Tupfern anstelle von Muskelgewebe zu entnehmen, wenn Tupfer für die Analyse von C. chauvoei ausreichen. Muskelgewebe ergab jedoch positivere Proben als Abstriche, wenn beide durch Kultur und PCR analysiert wurden (Tabelle 3). Die Inzidenz von C. chauvoei auf Abstrichen aus den positiven Muskelgewebefällen schien zufällig zu sein. Es schien jedoch wenig oder gar keinen Unterschied zu machen, ob die Tupfer 1, 3 oder 6 Tage gelagert wurden.
Proben aus Biogasanlagen
Clostridium chauvoei wurde in 3 von 11 Proben im Biogassubstrat vor der Pasteurisierung nachgewiesen, konnte aber weder nach der Pasteurisierung noch nach dem Aufschluss nachgewiesen werden (Tabelle 4). Die Bakterien in solchen Proben könnten aus Gülle oder tierischen Nebenprodukten aus dem Schlachthof stammen, da beide Quellen für die Biogasproduktion verwendet werden. Keiner der in dieser Studie untersuchten Betriebe schickt seinen Mist aufgrund der geografischen Entfernung zu den Biogasanlagen, aber die Tiere werden zum örtlichen Schlachthof geschickt. Auch im Einzugsgebiet der Biogasanlage wurden Fälle von Blackleg gemeldet.
Nach der Biogasaufbereitung werden die aufgeschlossenen Reststoffe als Dünger verwendet. Sporenbildende Bakterien können die Pasteurisierung und Verdauung in Biogasanlagen überleben, und verdaute Rückstände aus Biogasanlagen können daher Blackleg auf neue Gebiete ausbreiten. Aber kein C. chauvoei wurde im verarbeiteten Produkt nachgewiesen, so dass die Umgebung im Fermenter möglicherweise nicht für C. chauvoei geeignet ist oder die Flora im Fermenter C. chauvoei entwachsen ist. Clostridiensporen können über lange Zeiträume im Boden überleben , was in weiteren Studien zu C. chauvoei im Fermenter berücksichtigt werden muss.
Proben aus landwirtschaftlichen Betrieben
Obwohl alle untersuchten Betriebe in den letzten Jahren Verdachtsfälle von Blackleg gemeldet hatten, wurden alle Proben aus Kot, Boden und Silage negativ auf C. chauvoei getestet. Es könnte mehrere Erklärungen dafür geben. Sporen könnten noch im Material vorhanden sein, jedoch unterhalb des Nachweisniveaus. Darüber hinaus können PCR-Inhibitoren in den Proben vorhanden sein und die PCR kann behindert werden. Rinderkot enthält flüchtige Fettsäuren (VFA) und die Bodenproben können Spuren von Metall enthalten, von denen bekannt ist, dass beide die PCR-Reaktion stören. Der Kulturschritt vor der PCR reduziert jedoch den Einfluss hemmender Substanzen.
Seit C. chauvoei ist ein Bodenbakterium Einige saisonale Schwankungen können auftreten, Zum Beispiel können starke Regenfälle zur Ausbreitung der Sporen beitragen, und die Menge der Sporen im Boden kann für Rinder zugänglicher sein. Die meisten Probenahmen wurden im Frühherbst bei sonnigem Wetter durchgeführt, so dass die Konzentration der Sporen in den Proben voraussichtlich gering war. Die Anzahl der Proben war möglicherweise nicht ausreichend für den Nachweis von Umweltkontaminationen. Aus praktischen Gründen sind jedoch selten sehr viele Umweltproben aus dem Feld verfügbar.
Verdachtsfälle von Blackleg in den Betrieben waren hauptsächlich bei Kälbern und Färsen aufgetreten, aber ein Betrieb meldete einen Fall bei einer erwachsenen Kuh. Sieben der elf Betriebe A-K hatten zum Zeitpunkt der Probenahme Impfroutinen (Tabelle 1).
Zwei der Betriebe lagerten Gülle vor dem Ausbreiten und die anderen nicht, aber keiner der Betriebe verteilte Gülle auf der Weide. Berichten zufolge haben lokale Tierärzte auf der Insel Öland nach der Rodung von Sträuchern mehr Fälle von Schwarzbeinern gesehen, insbesondere auf Alvaret (einer kargen Kalksteinebene, fast 40 km lang und 10 km breit, mit einer speziellen Flora, die vom dünnen Boden und dem hohen pH-Wert abhängt). Alvaret wird normalerweise von benachbarten Bauernhöfen als Weide genutzt. Im Jahr der Probenahme war nicht viel Gebüsch gerodet worden.
PCR
Kulturverfahren sind teuer und zeitaufwendig, und eine Kontamination mit anderen anaeroben Bakterien, die aus C. chauvoei herauswachsen, verursacht häufig Probleme . Bei Verwendung der PCR wird die DNA sowohl lebensfähiger als auch nicht lebensfähiger Zellen amplifiziert. Wenn nur lebensfähige Zellen nachgewiesen werden sollen, kann ein Anreicherungsschritt angewendet werden. In dieser Studie wurde Kultur auf FAA-Platten vor der PCR verwendet, um den Nachweis nicht lebensfähiger Bakterien und falsch positiver PCR-Reaktionen zu vermeiden. DNA lässt sich aus Reinkulturen leicht amplifizieren, Probleme ergeben sich jedoch bei kontaminierten Proben, beispielsweise Proben aus Bioabfällen. Der Nachweis von DNA durch PCR kann durch zahlreiche Substanzen wie Huminsäuren, VFA, Fette und Proteine behindert werden . Der Kulturschritt vor der PCR wurde jedoch als Anreicherungsschritt verwendet und reduziert daher den Einfluss von inhibitorischen Substanzen. Aufgrund der schwärmenden Flora konnte keine Reinigung von den FAA-Platten durchgeführt werden.
Nachweisschwelle der PCR-Methode
Der Nachweiswert lag bei 200 KBE/g. Dies mag als schlechter Nachweiswert erscheinen, lässt sich aber dadurch erklären, dass Proben wie Gülle, Boden und Biogassubstrat durch die umgebende Flora stark kontaminiert sind. Sasaki berichtete von einem Nachweiswert von 10 KBE / g, anscheinend in saubereren Proben. Da der Nachweiswert in unserer Studie jedoch 200 KBE / g betrug und solche Proben eine geringe Anzahl von C. chauvoei enthalten sollten. Daher ist die in der vorliegenden Studie verwendete Methode praktisch nicht anwendbar.
Umweltaspekte
Die Nachweisschwelle der PCR-Methode nach Vorkultur ist derzeit kaum geeignet, die Infektionsfreiheit der Tiere zu gewährleisten oder den Zustand der Weiden zu bestimmen. Stattdessen müssen die derzeit angewandten Empfehlungen verwendet werden, da die Methode nicht als Grundlage für Impfroutinen verwendet werden kann. In Gebieten, in denen Schwarzkraut endemisch ist, wird trotz der Kosten und des Zeitaufwands eine jährliche Impfung vor der Beweidung empfohlen.
Diese Studie gab Hinweise darauf, dass C. chauvoei den Biogasprozess nicht durchläuft. Die Anzahl von C. chauvoei im Bioabfall ist im Fermenter unter die Nachweisschwelle des Verfahrens gesunken und die Gefahr der Ausbreitung von Faulrückständen ist somit vernachlässigbar. Weitere Studien über das Überleben von Clostridien durch den Biogasprozess sind erforderlich, bevor endgültige Schlussfolgerungen gezogen werden können. Die Vorteile von aufgeschlossenen Rückständen als Düngemittel überwiegen jedoch möglicherweise das Risiko der Ausbreitung von Blackleg.
