Frontiers In Genetics

alkaline comet assay (single cell gel electrophoresis) er den mest brukte metoden for å måle DNA-skade i eukaryote celler (Neri et al., 2015). Det oppdager strandbrudd (sbs) og alkali-labile steder ved frekvenser fra noen få hundre til flere tusen pauser per celle-et biologisk nyttig område, som strekker seg fra lave endogene skadenivåer til omfanget av skade som kan påføres eksperimentelt uten å drepe celler. Fordøyelse av nukleoider, etter lysis, med visse lesionspesifikke reparasjonsendonukleaser tillater måling av andre skader enn SBs; spesielt har formamidopyrimidin DNA glykosylase (FPG) blitt mye brukt til å oppdage endrede puriner, som omdannes til brudd av enzymet. Nylig, (Cort@s-Guti Hryvrrez et al., 2014) utviklet en todimensjonal To-Tailed kometanalyse (TT-comet) som kan skille mellom enkeltstrenget (Ssb) og dobbeltstrenget DNA-brudd (Dsb) i de samme kometene i sæd.

siden Den første rapporten Fra Ostling Og Johanson (1984) har comet-analysen blitt mye brukt i gentoksisitetstesting av kjemikalier, både i in vitro-og in vivo-modeller. En fordel med sistnevnte er at celler fra forskjellige vev kan studeres, i et bredt spekter av eukaryote organismer. I løpet av de siste 15 årene har kometanalysen blitt mye brukt i Drosophila melanogaster for å teste gentoksisiteten til kjemikalier(Gaivã Og Sierra, 2014). Denne tilnærmingen er svært nyttig siden Drosophila melanogaster er en verdifull modell for alle typer prosesser relatert til menneskers helse, inkludert DNA-skaderespons.

bruken av planter samt et bredt spekter av terrestriske og akvatiske arter i kometanalysen har økt dramatisk det siste tiåret (Costa et al., 2014; de Lapuente et al., 2015; Santos et al.( 2015), spesielt i miljørisikovurdering (ERA). En nylig valideringsstudie har indikert at in vitro kometanalyse kombinert med FPG kan være en effektiv komplementær bevislinje i ERA, selv i spesielt utfordrende naturscenarier som estuarinmiljøer (Costa Et al., 2014).

i løpet av det siste tiåret produksjon og bruk av nano-størrelse materialer har økt betydelig, og som en konsekvens så har menneskelig eksponering for disse typer materialer. Å identifisere og forstå farene ved nanomaterialer (NMs) i forhold til menneskers helse er ikke en enkel sak. Ikke bare er den kjemiske sammensetningen av NMs ansvarlig for deres gentoksisitet, men også form, spesifikt overflateareal, størrelse, størrelsesfordeling og zeta-potensial bestemmer effektene av disse materialene på genomet. Selv om det fortsatt er en debatt om egnetheten til standard gentoksisitetsanalyser for å studere effektene Av NMs, har hittil den mest brukte metoden i nanogenotoksikologi, takket være sin robusthet, allsidighet og pålitelighet, vært kometanalysen (Azqueta and Dusinska, 2015). I tillegg til å undersøke gentoksisiteten av stråling og ulike kjemikalier, har plant comet-analysen nylig også blitt brukt til å studere den gentoksiske effekten Av Nps (Santos et Al., 2015).

en ytterligere anvendelse av comet-analysen er som et verdifullt eksperimentelt verktøy for menneskelig biomonitorering så vel som i kliniske studier. Innsamling av blod eller vev er ikke alltid mulig hos alle mennesker, og andre kilder til celler som kan samles ikke-invasivt, har blitt testet med kometanalysen; for eksempel ulike typer epitelceller (Rojas et al., 2014) så vel som sperm (Corté-Gutié, 2014; Brunborg et al., 2015).

parallelt med utviklingen av comet-analysen for DNA-skademåling, har analyser for DNA—reparasjon—et viktig element i den genotoksiske cellulære responsen-blitt utviklet. DEN enkleste tilnærmingen TIL DNA-reparasjonsmåling er å behandle celler MED ET DNA-skadelig middel og deretter inkubere dem for å tillate reparasjon å fortsette, måle mengden skade som gjenstår i intervaller. En alternativ, biokjemisk tilnærming til vurdering av reparasjonskapasitet ble beskrevet i 1994 (Collins et al., 1994), og siden da ulike modifiserte versjoner av analysen for å måle både base excision repair (BER) og nucleotid excision repair (NER)har blitt publisert (anmeldt Av Azqueta et al., 2014). Denne biokjemiske tilnærmingen har blitt brukt til å studere effekten av miljø, ernæring, livsstil og yrke PÅ DNA-reparasjonskapasitet, i tillegg til kliniske undersøkelser (Azqueta et al., 2014).

denne alternative in vitro-tilnærmingen til DNA-reparasjon vurderer reparasjonsaktiviteten til et celleekstrakt på ET DNA-substrat som inneholder definerte lesjoner. Kometanalysen brukes til å følge akkumuleringen AV DNA-pauser (reparasjons mellomprodukter) med inkubasjonstiden. Nylig Var Slyskova og kolleger de første som brukte IN vitro DNA-reparasjonsanalysene for BER og NER vellykket på humane vevsprøver; spesielt kolorektale karsinombiopsier (Slyskova et al., 2012, 2014).

en annen TYPE DNA-reparasjonsanalyse, slik at celler innebygd i gelen kan reparere før lysis, ble nylig vedtatt for å studere DNA-reparasjonskinetikk mer detaljert; spesielt for å studere reguleringen AV ber-proteiner ved post-transkripsjonelle modifikasjoner(Nickson and Parsons, 2014). En annen måte å studere DNA-reparasjon på, på nivå med spesifikke gener, er med comet-FISH-teknikken, som bruker fluorescerende merkede DNA-prober som vil hybridisere TIL det enkeltstrengede DNA i komethalen. McAllister et al. (2014) brukte denne metoden for å studere fortrinnsrett strand pause reparasjon i bulk DNA så vel som i utvalgte regioner med aktivt transkriberte gener.

Å Studere kinetikken til reparasjon av indusert skade vil bidra til vår forståelse av cellulære responser på gentoksiske kjemikalier. VIDERE kan BETYDNINGEN AV DNA-reparasjon som en aktør i den (anti)kreftfremkallende prosessen belyses ved å se på reparasjon på nivået av spesifikke kreftmålvev. Regulering av reparasjon – og andre aspekter av den cellulære responsen på gentoksiske forbindelser – vil sannsynligvis involvere epigenetiske mekanismer, og kometanalysen har blitt vedtatt med hell for å måle endringer i det globale DNA-metyleringsmønsteret i individuelle celler under forskjellige vekstforhold (Lewies et al., 2014).

prosent hale DNA anbefales som den beste beskrivelsen FOR DNA-bruddfrekvenser, da kometene referert til – og omfanget av skade—lett kan visualiseres. Men mange forskere fortsatt foretrekker bruk av halen øyeblikk (Mø et al., 2014). Faktisk er de to beskrivelsene på samme måte påvirket av analyseforhold (Azqueta et al., 2011; Ersson Og Mö, 2011).

Variabilitet i kometanalysen er et viktig tema, enten Det oppstår ved bruk av forskjellige protokoller, eller fra ukontrollabel eller tilfeldig eksperimentell variasjon. Inkluderingen av referansestandarder i alle eksperimenter anbefales, spesielt når et stort antall prøver—for eksempel fra en biomonitoringforsøk—analyseres ved forskjellige anledninger. Referansestandarder er celler med en kjent MENGDE DNA-skade; enten ubehandlede celler (negativ kontroll), Røntgeneksponerte celler (positiv kontroll) eller celler behandlet med fotosensibilisator pluss lys (positiv kontroll for analyser inkludert fpg-inkubasjon), batch-forberedt og frosset som alikvoter. Hvis det oppstår betydelig variasjon i standardene i et forsøk, kan prøveresultatene normaliseres (Collins et al., 2014). Hvis referansestandarder utveksles mellom laboratorier, kan resultatene fra disse laboratoriene lettere sammenlignes.

Referansestandardceller settes normalt i geler parallelt med prøvegeler. Interne standarder—dvs., standardceller i samme gel som prøveceller—ville være ideelle; men det er selvsagt viktig å kunne skille de to celletypene. Fiskeceller som enten er større eller mindre i genomstørrelse sammenlignet med humane celler, er vellykket vedtatt for dette formålet (Brunborg et al., 2015). Disse referansecellene kan brukes i kombinasjon med en standard-eller kalibreringskurve (etablert med celler gitt forskjellige doser ioniserende stråling), noe som muliggjør en mer presis kvantifisering AV DNA-lesjoner uttrykt som EN DNA-bruddfrekvens i stedet for % hale-DNA.

Statistikk er et viktig verktøy i alle anvendelser av comet-analysen, for å sjekke om små forskjeller oppstår ved en tilfeldighet. Konsise beskrivelser av statistisk analyse og anbefalinger for tester har blitt publisert (Lovell et al.(1999; Lovell og Omori, 2008). Mø og Loft (2014) minner oss om at for å holde kometanalysen statistisk analyse enkel, bør hensiktsmessig studiedesign og statistisk kraft vurderes nøye når du planlegger eksperimenter.

som med alle biologiske analyser, er dataintegrasjon avgjørende for å tolke kometanalyseresultatene i det større bildet. Integrering av informasjon fra comet-analysen med ANDRE DNA-skadeindikatorer og cellulære responser (f.eks. oksidativt stress, celledeling eller celledød) har blitt brukt både i ERA (Costa Et al., 2014; Santos et al., 2015) så vel som menneskelige (biomonitoring) studier (F.Eks., 2010; Slyskova et al., 2012). Også inkludert “omics” data vil hjelpe i å rakne virkemåten av gentoksiske forbindelser (Slyskova et al., 2012, 2014; Santos et al., 2015) – selv om det er verdt å påpeke at flere studier har vist at fenotypiske tiltak FOR DNA-reparasjon ikke nødvendigvis korrelerer med genomiske eller transkriptomiske data (Collins et al., 2012; Slyskova et al., 2012, 2014); de ulike tilnærmingene bør betraktes som komplementære.

selv etter tre tiår med utvikling og modifikasjon, er comet-analysen fortsatt en ganske enkel, allsidig, men arbeidsintensiv analyse. Ulike modifikasjoner av analysen med høy gjennomstrømning ble nylig gjennomgått (Brunborg et al., 2014). Både in vivo-og in vitro-applikasjoner vil få stor fordel av ytterligere forbedringer i effektivitet, standardisering av protokoll og gjennomstrømning. Automatisering og miniatyrisering er vanlige strategier på mange områder av biologi, slik at størrelsesordener endres i antall prøver analysert per eksperiment, reduserer subjektiv bias og forbedrer reproduserbarheten.

Så-hva kan vi håpe på de neste 30 årene? Aksept av in vitro komet analyse for gentoksisitet testing, billig automatisert komet scoring for å redde forskere fra uendelig mikroskop visning, protokoll standardisering (kanskje) og pålitelige interne referansestandarder, mer menneskelig biomonitoring studier AV DNA reparasjon (akseptere at fenotypiske analyser har en viktig plass sammen med genomikk og transkriptomics), miljøovervåking ved hjelp av en rekke dyre-og plantearter; og mange flere uforutsigbare utviklingen og applikasjoner.

Interessekonflikt

forfatterne erklærer at forskningen ble utført i fravær av kommersielle eller økonomiske forhold som kan tolkes som en potensiell interessekonflikt.

Takk

vi vil gjerne takke alle forfattere samt anmeldere og redaktører som har bidratt til Dette Grenseforskningstemaet. SL er mottaker av et postdoktorstipend fra AXA Forskningsfond og Cefic-LRI Innovative Science Award 2013. AA takker Den Spanske Regjeringens Ministerio De Economist Hryva y Competitive (‘Ramó y Cajal’ – programmet, 2013) for personlig støtte.