Krom Release Assay: Den Gamle Skolen Måte Å Teste Cytotoksiske T-Celler

Det finnes flere metoder du kan bruke for å se Om T-cellene er cytotoksiske, men en krom release assay bruker radioaktivt 51chromium (51Cr) er en av de eldste. Det gir gode resultater, og er flott for laboratorier som ikke har råd til eller ikke har flowcytometri lett tilgjengelig.

Her vil jeg skissere en enkel metode for testing Av t-celledrepende funksjon ved hjelp av 51Cr. Men før du starter analysen, må du lese opp på riktige sikkerhetstiltak ved håndtering av radioaktive materialer.

Velg Mål Og Effektorer

for å gjøre en kromfrigjøringsanalyse, inkuberer du først målcellene (T) med 51Cr. Du inkuberer deretter målcellene med effektorceller (Dine t-celler; E). Hvis effektorcellene dreper målene, vil de frigjøre 51Cr, som du vil oppdage med en gamma-teller.

hvilke mål og effektorer du bruker, er helt avhengig av søknaden din. Dine målceller er det Du tester T-cellefunksjonen mot. Du vil kanskje drepe målet ditt (måle cytotoksisitet), eller du kan se etter Om T-cellene er tolerante (som å teste produserte celler før de går inn i en pasient for sikkerhet!). Dine effektor t-celler kan også utledes fra forskjellige kilder. For eksempel kan du bruke produserte t-cellelinjer eller t-celler som er isolert fra et dyr.

La Oss Få Radioaktive

når du har samlet dine mål og effektorer, er det på tide å få matlaging.

1. Tell cellene dine. Du kan bruke et hemocytometer eller en automatisk celleteller. Antall celler du trenger er avhengig av antall forhold og hvor mange replikater av hver tilstand du gjør. Vanligvis kjører jeg analysene mine i tre eksemplarer og har fire forhold (5:1, 10:1, 20:1 og 40: 1 E: T). Aliquot dine målceller (i mitt tilfelle 500.000-ca 25.000 per brønn) i 15 ml koniske rør, og holder hver eksperimentell tilstand separat! Pass på at du suspenderer cellene dine i et lite volum, slik at de har sjansen til å komme i kontakt med krom.

1. Legg til 51Cr (rundt 50 µ) og inkuber målene dine med krom i en time. Flick rørene omtrent hvert 20. minutt for å øke mulighetene for celler å ta opp krom.

1. mens du inkuberer … Denne lange inkubasjonen er en flott tid å sette opp effektorcellene dine. Vask t-cellene to ganger med PBS for å fjerne overflødige cytokiner som kan skje resultatene dine. Deretter resuspend dem i riktig media.

1. når du er ferdig med vaskene, er du klar til å sette effektorene på tallerkenen! Jeg bruker vanligvis en 96 brønnplate siden volumene er ganske små. Plate effektorene i forskjellige forhold til målene for å bestemme terskelen for drap. Jeg kjører vanligvis analysen i triplikater, men det avhenger av hvor mange celler du har tilgjengelig. 40, 20, 10 og 5 til 1 forhold (Effektorer Til Mål) er en god mal hvis du har nok tilgjengelige celler.

i tillegg til denne testen konfigurerer du to kontrollforhold:

• en spontan frigjøringskontroll som inneholder bare målceller (i utgangspunktet en negativ kontroll fordi det ikke skal drepes uten effektorene) og
• en maksimal frigjøringskontroll der du lyser målcellene (en positiv kontroll som viser maksimal mengde et krom tatt opp av cellene).

1. Tilbake til De Målcellene…når målcellene er ferdige, vask dem tre ganger med cellekulturmedium for å fjerne overflødig krom. Spinn cellene forsiktig ved 400g i 5 min for hver av disse vasker. Dekanter supernatanten i en avfallsbeholder som kan overføres til et trygt forfallsområde i stedet for å prøve å pipet det ut. Dette vil bidra til å redusere mulig forurensning siden du ikke trenger å forholde seg til noen tips.

1. etter vask, resuspend cellene til 5000 celler per 100?l. legg deretter til 100?til hver brønn, selv de spontane og maksimale brønnene. Inkuber cellene sammen i minst 4 timer ved 37°C, nøyaktig hvor lenge avhenger av søknaden din.

1. Fire timer senere … Ta tallerkenen din ut av inkubatoren. Legg til 100?l av en 1% triton-x-løsning til cellene i de maksimale brønnene for å lyse cellene og frigjøre alt krom.

1. Spinn platen ned ved 1250rpm i ti minutter for å pellet cellene.

1. Overfør supernatanten fra hver brønn til brønnen på en absorberende plate (F. eks.

1. la platen tørke over natten. Om morgenen, pop den inn i plateleseren og få resultatene dine.

resultatene du ser vil avhenge av din spesifikke applikasjon

Beregning Av Resultatene Av Kromfrigjøringsanalysen

Når du har avlesningene, må du utføre en enkel beregning for å bestemme cytotoksisiteten til cellene dine.

først, gjennomsnitt dine triplicates for hver tilstand. Ta deretter disse gjennomsnittene og koble dem til denne formelen:

(Kromfrigivelse for tilstand av interesse – Kromfrigivelse i spontane brønner)/ (maks kromfrigivelse – Kromfrigivelse i spontane brønner)

Multipliser verdien med 100 for å få prosentlyse.