CMV-promotormutanten met een verminderde neiging tot productiviteitsverlies in CHO-cellen

om de effecten van methylatiegevoelige CpG-locaties vanuit de versterker, de proximale en de kernpromotorregio te monitoren, kozen we ervoor om niet alleen C-179 te onderzoeken, maar ook de cytosines op posities -508 (C-508) en -41 (C-41). Geen van de geselecteerde CpG-locaties overlapt met bekende bindingsplaatsen voor transcriptiefactoren bij Cricetidae-soorten. Om het totale GC-gehalte te behouden, hebben we C tot G-transversies uitgevoerd (Fig. 1 bis). Naast C-41, is C-13 de tweede cytosine in het kern promotorgebied dat vaak schijnt te worden geméthyleerd. Omdat de verandering van C-13 Aan G tot een nieuwe plaats van CpG zou leiden, verkozen wij om c-41G te onderzoeken. de gemuteerde promotorvarianten werden met een drielettercode afgekort, b. v.variant GCC heeft guanine in plaats van cytosine op positie -508, terwijl de cytosine basissen op -179 en -41 worden behouden. CCC is de ongemuteerde controle hCMV-MIE (Fig. 1 bis). Gemuteerde of inheemse promotors werden geà ntroduceerd in diverse plasmiden en stroomopwaarts geplaatst van verschillende verslaggeversgenen.

om te zien of de mutaties de sterkte van de promotor beïnvloeden, voerden we twee onafhankelijke experimenten uit door tijdelijk reporter plasmiden die uitgescheiden embryonale alkalische fosfatase (SEAP) tot expressie brengen in CHO-K1 cellen te transfecteren en onderzochten we de expressie van SEAP vijf dagen na transfectie. De ongemuteerde promotor werd als referentie gebruikt (Fig. 1 ter). De expressie van SEAP van GGG, GCG en CGC promotors was consistent ongeveer 20% lager dan van de ongemuteerde promotor, met kleine variatie tussen de replicate experimenten. In het algemeen vertoonden de C tot en met G mutaties een neiging tot een bescheiden verminderde promotorsterkte, wat echter aanvaardbaar leek.

vervolgens vroegen we of hCMV-Mie promotorvarianten de expressiestabiliteit van permanent getransfecteerde CHO-cellen beïnvloeden tijdens langdurige kweek. Voor dit doel, kozen wij een egfp verslaggeefster die de cytometrische analyse van verslaggeversgenuitdrukking op het ééncellige niveau toelaat. eGFP reporter plasmiden werden getransfecteerd in CHO-K1 cellen en drie tot vier onafhankelijke pools van permanent getransfecteerde cellen werden geselecteerd met methotrexaat (MTX). Deze werden gedurende drie maanden gekweekt in aanwezigheid van selectieagent MTX. Vierendertig en zevenentachtig dagen na transfectie, werd eGFP uitdrukking gemeten door cytometry (twee pools werden verloren tussen dag 34 en 87 toe te schrijven aan verontreiniging). De geometrische middelen van de fluorescentieintensiteit van 10.000 gebeurtenissen per meting werden berekend voor elke celpool en uitgezet voor beide tijdpunten (Fig. 1c). Vierendertig dagen na transfectie was er weinig verschil tussen de constructies. Slechts één CGC-pool vertoonde verhoogde expressieniveaus. Zevenentachtig dagen na transfectie vertoonden twee van de vier pools getransfecteerd met CGC en twee van de drie pools getransfecteerd met CCG duidelijk hogere eGFP-waarden dan alle andere pools, getransfecteerd met de ongemuteerde controle of de resterende promotorvarianten. Deze waarnemingen suggereerden een stabiliserend effect van de enkele c-41G of C-179G mutaties op eGFP expressie. Om dit resultaat te consolideren, herhaalden we het experiment met zowel promotorvarianten als met een groter aantal pools. We hebben tien zwembaden gegenereerd met respectievelijk CCG of CCC en acht zwembaden met CGC (twee zwembaden gingen verloren door verontreiniging). De cellen werden gecultiveerd zoals voorheen en geanalyseerd door cytometrie stroom van dag 42 tot dag 69 na transfectie (Fig. 1d en aanvullende Fig. S1 online). Na 42 dagen was de egfp-expressie sterk toegenomen in vier ccg-pools vergeleken met de CCC-controlepools, terwijl twee CGC-pools een matige toename van de eGFP-expressie vertoonden (Fig. 1d, linker paneel). Na 69 dagen vertoonden drie ccg-pools nog steeds hoge eGFP-niveaus, terwijl de egfp-expressie van de CGC-pools was gedaald tot CCC-controleniveaus (Fig. 1d, rechter paneel). De verschillen tussen de groepen werden op elk tijdstip Getest met de niet-parametrische staal-Dwass-test. Het alfaniveau was ingesteld op 0,05. Een significant verschil werd waargenomen tussen CCG en CCC op dag 56 na transfectie (p = 0,0305; zie aanvullende Fig. S1 online). Samen genomen, de resultaten van Fig. 1c, d stelde voor dat beide veranderingen C-41G en C-179G het verlies van hCMV-MIE gedreven recombinante genuitdrukking kunnen vertragen.

mutaties C-41G en C-179G remmen de DNA-methylering op de respectievelijke plaats volledig, omdat guanine niet geméthyleerd kan worden. We vroegen ons af of deze mutaties ook methylation niveaus op andere CpG plaatsen binnen hCMV-MIE beà nvloedden. Daarom hebben we de methyleringsniveaus van alle CpG-sites in de individuele hCMV-MIE-varianten gemeten door bisulfietconversie in combinatie met de volgende generatie sequencing. Hiertoe extraheerden we genomisch DNA uit de celpools van het tweede experiment 42 en 69 dagen na transfectie en behandelden we het met bisulfiet om te onderscheiden tussen geméthyleerde en niet-geméthyleerde cytosine. hCMV-Mie DNA werd vergroot en gesequenced met het Illumina MiSeq systeem (Fig. 1e). C-179 werd het sterkst geméthyleerd binnen alle pools getransfecteerd met CCC of CCG, bevestigend eerdere waarnemingen met de ongemuteerde hCMV-MIE12. Verder zagen we een duidelijk methylatiepatroon dat bij alle pools zeer gelijkaardig was, maar in algemene intensiteit verschilde. In het bijzonder waren ongemuteerde C-508 en C-41 consistent één van de meest geméthyleerde plaatsen. De verandering van C-41 in promotorvariant CCG, in het bijzonder de verandering van C-179 in variant CGC, schijnt de methylation van alle plaatsen CpG eerder uniform te verminderen dan het methylationpatroon te veranderen. Toen we de gemiddelde methyleringsniveaus over alle CpG-plaatsen voor elke pool berekenden, ontdekten we lagere totale methylering met de gemuteerde promotorvarianten (zie aanvullende Fig. S2 online). Het verschil was het duidelijkst bij variant CGC, maar bereikte geen statistische significantie bij de staal-Dwass-test (α = 0,05). Gemiddeld nam methylering in de loop van de tijd toe met alle constructies.Behalve het tot zwijgen brengen van epigenetische promotoren, is het verlies van transgene kopieën een belangrijke oorzaak van de productieinstabiliteit in recombinante cellen20. Om de relatieve bijdrage te schatten, hebben we de aantallen plasmidekopieën gemeten door qPCR 42 en 69 dagen na transfectie. Het gemiddelde aantal plasmidekopieën nam in de loop van de tijd af, zonder duidelijk verschil tussen de constructies (zie aanvullende Fig. S2 online). Interessant is dat de verdeling van kopieernummers werd verschoven naar lagere waarden in de CGC-groep. Bij het testen van de statistische significantie met de staal-Dwass-test bleken de verschillen tussen de constructies echter niet significant te zijn (α = 0,05).

Pools van permanent getransfecteerde cellen zijn zeer heterogene mengsels van klonen die verschillen in transgene expressie en groeisnelheid. Zeer productieve klonen hebben meestal een lager groeipercentage 21. Daarom, lage producerende cellen, waarvan velen in de cultuur na transfectie aanwezig zijn, bijna onvermijdelijk overgroeien de hoge producenten vroeg of laat. Om deze bias te minimaliseren, onderzochten we de mutaties C-179G en C-41G in klonale cellijnen. Omdat we de effecten op de productie van een potentieel commercieel product wilden beoordelen, zijn we als reporter overgestapt op een IgG-IL2 fusie-eiwit. Zo werden promotorvarianten die beide mutaties alleen (CGC of CCG) of in combinatie (CGG) bevatten, stroomopwaarts van de lichte keten en het zware kettinggen van een IgG-IL2 expressieplasmide ingebracht.

Expressieplasmiden met CCG, CGC, CGG of de ongemuteerde hCMV-MIE werden getransfecteerd in CHO-K1 cellen en stabiel getransfecteerde klonen werden geïsoleerd in 384-wells platen. Dertig clonale cellijnen per construct werden willekeurig geselecteerd en uitgebreid tot zes-well platen. Nadat de cellijnen een stabiele groei hadden laten zien, bestudeerden we hun productiviteit gedurende ongeveer twee maanden, van dag 68 tot dag 134 na transfectie. Sommige cellijnen gingen verloren als gevolg van verontreiniging of verminderde levensvatbaarheid, toch werden 23 tot 29 klonen per constructie onderzocht over de gehele periode van tijd.

gedurende de gehele studie bepaalden we IgG-IL2 concentraties in celkweek supernatanten en productiviteit per cel en dag (specifieke productiviteit qP). Aan het begin (dag 68) en het einde (dag 134) van het onderzoek vertoonden met CGC getransfecteerde cellijnen significant hogere titers dan de transfecterende controlestoffen (α = 0,05; Fig. 2 bis). Cellijnen met opmerkelijk hoge titers werden ook waargenomen onder de CGG transfectanten op dag 68 en onder de CCG en CGG transfectanten op dag 134. Wanneer we specifieke productiviteiten vergeleken tussen cellijnen getransfecteerd met verschillende constructies, deden we soortgelijke waarnemingen (Fig. 2b). Om de onnauwkeurigheid in het tellen van cellen te compenseren, hebben we de specifieke productieactiviteiten qP van twee passages in het begin (dag 68-71 en 83-86 na transfectie die de vroegst beschikbare data punten vertegenwoordigen) en drie passages aan het einde van de lange termijn teelt (dag 124-127, dag 127-131 en dag131-134 na transfectie) gemiddeld. Significante verschillen tussen cellijnen getransfecteerd met CGC of CCC werden waargenomen aan het einde van de lange termijn teelt (α = 0,05).

hCMV-Mie-varianten CGC en CCG stabiliseren de productie van recombinant eiwit in klonale CHO-cellijnen.

(a) IgG-IL2-titers van CHO-klonen 68 dagen (linkerpaneel) en 134 dagen (rechterpaneel) na transfectie. (b) specifieke productiviteit qP van CHO klonen aan het begin (linkerpaneel) en het einde (rechterpaneel) van de lange termijn teelt. Vroege qP-waarden werden berekend door middel van de qP-waarden van twee vroege passages die de twee vroegste gegevenspunten vertegenwoordigen (dag 68-71 en dag 83-86 na transfectie). Late qP-waarden werden berekend door middel van de laatste drie passages (dag 124-127, dag 127-131 en dag 131-134 na transfectie) (c) procentuele verandering van specifieke productiviteiten ∆qP tijdens lange termijn teelt gebaseerd op gegevens getoond in (b) met (linkerpaneel) en zonder (rechterpaneel) één uitschieter geïdentificeerd door jackknife analyse. Alleen klonen die op dag 68 detecteerbare productniveaus produceerden, werden in aanmerking genomen. (a-c) de identiteit van de promotorvarianten en het aantal (N) onafhankelijke celpools worden onder de x-as aangegeven. De bovenste en onderste uiteinden van de dozen vertegenwoordigen het eerste en het derde kwartiel van elke groep. De uiteinden van de snorharen vertegenwoordigen de laagste en hoogste waarden nog binnen het 1,5-voudige interkwartielbereik. De grijze lijn geeft het totale gemiddelde aan van de Y-variabele in het diagram. Significante verschillen (α = 0,05) tussen de groepen volgens de staal-Dwass-test worden aangegeven door de p-waarden.

hogere titers en Specifieke productiviteiten van cellijnen die G-179 of g-41 dragen suggereerden een stabiliserend effect van deze veranderingen op hCMV-MIE gedreven genuitdrukking. Om dit effect te documenteren, berekenden we het percentage verandering van qP tijdens de lange termijn teelt voor elke individuele cellijn als de meest geschikte maat voor de productie stabiliteit (Fig. 2c). Natuurlijk, was dit haalbaar slechts met cellijnen die nog IgG-IL2 op dag 68 na transfectie produceren. Een controle transfectant verhoogde zijn specifieke productiviteit met 500% en werd geïdentificeerd als een uitschieter door jackknife outlier analyse (Fig. 2c, linker plot). Daarom werd deze cellijn uitgesloten van verdere analyse (Fig. 2c, rechter plot). Cellijnen getransfecteerd met CGC of CCG waren significant stabieler dan controlecellijnen getransfecteerd met CCC (α = 0,05). Verrassend genoeg verschilde de dubbele mutant CGG niet van de controle.