Frontiers in Genetics

de alkalische comet assay (single cell gel electrophoresis) is de meest gebruikte methode voor het meten van DNA schade in eukaryotische cellen (Neri et al., 2015). Het detecteert strandbreuken (SBS) en alkali-labiele plaatsen met frequenties van enkele honderden tot enkele duizenden breuken per cel—een biologisch nuttig bereik, dat zich uitstrekt van lage endogene schadeniveaus tot de mate van schade die experimenteel kan worden toegebracht zonder cellen te doden. De spijsvertering van de nucleoïden, na lysis, met bepaalde laesie-specifieke reparatie endonucleases staat meting van schade buiten SBs toe; met name, is de glycosylase van formamidopyrimidine DNA (FPG) wijd gebruikt om veranderde purines te ontdekken, die in breuken door het enzym worden omgezet. Onlangs, (Cortés-Gutiérrez et al., 2014) ontwikkelde een tweedimensionale Two-Tailed comet assay (TT-comet) die kan onderscheiden tussen single-stranded (SSBs) en double-stranded DNA breaks (dsbs) in dezelfde kometen in sperma.

sinds het eerste rapport van Ostling en Johanson (1984) wordt de comet-test op grote schaal gebruikt bij genotoxiciteitstesten van chemische stoffen, zowel in vitro als in vivo modellen. Een voordeel met de laatste is dat cellen uit verschillende weefsels kunnen worden bestudeerd, in een grote verscheidenheid van eukaryotic organismen. Gedurende de laatste 15 jaar is de comet-test uitgebreid gebruikt in Drosophila melanogaster om de Genotoxiciteit van chemische stoffen te testen (Gaivão and Sierra, 2014). Deze benadering is zeer nuttig aangezien Drosophila melanogaster een waardevol model voor allerlei processen met betrekking tot menselijke gezondheid, met inbegrip van de schadereacties van DNA is.

het gebruik van planten en een breed scala aan terrestrische en aquatische soorten in de Comet-test is de laatste tien jaar sterk toegenomen (Costa et al., 2014; de Lapuente et al., 2015; Santos et al., 2015), met name in environmental risk assessment (ERA). Een recente validatie studie heeft aangetoond dat de in vitro comet assay gecombineerd met FPG kan een effectieve complementaire lijn-of-bewijs in ERA zelfs in bijzonder uitdagende natuurlijke scenario ‘ s zoals estuariene omgevingen (Costa et al., 2014).

gedurende het afgelopen decennium is de productie en het gebruik van materialen van nanogrootte aanzienlijk toegenomen, en bijgevolg ook de blootstelling van de mens aan deze soorten materialen. Het identificeren en begrijpen van de gevaren van nanomaterialen (NMs) in relatie tot de menselijke gezondheid is niet eenvoudig. Niet alleen is de chemische samenstelling van NMs verantwoordelijk voor hun Genotoxiciteit, maar ook vorm, specifieke oppervlakte, grootte, grootteverdeling, en zeta potentieel bepalen de effecten van deze materialen op het genoom. Hoewel er nog steeds een debat is over de geschiktheid van standaard genotoxiciteitsanalyses voor het bestuderen van de effecten van NMs, is tot nu toe de meest gebruikte methode in nanogenotoxicologie, dankzij zijn robuustheid, veelzijdigheid en betrouwbaarheid, de comet-analyse geweest (Azqueta and Dusinska, 2015). Naast het onderzoeken van de Genotoxiciteit van straling en verschillende chemicaliën, is de plant comet assay onlangs ook gebruikt om de genotoxische impact van NPs te bestuderen (Santos et al., 2015).

een verdere toepassing van de Comet-test is een waardevol experimenteel instrument voor humane biomonitoring en in klinische studies. Het verzamelen van bloed of weefsels is niet altijd mogelijk bij alle menselijke proefpersonen, en andere bronnen van cellen die niet invasief kunnen worden verzameld, zijn getest met de comet-test; bijvoorbeeld, verschillende soorten epitheliale cellen (Rojas et al., 2014) en sperma (Cortés-Gutiérrez et al., 2014; Brunborg et al., 2015).

parallel met de ontwikkeling van de comet—test voor het meten van DNA—schade zijn tests voor DNA-herstel-een essentieel element in de genotoxische cellulaire respons-ontwikkeld. De eenvoudigste benadering van DNA-reparatiemeting is om cellen te behandelen met een DNA-beschadigend middel en ze vervolgens te incuberen om de reparatie door te laten gaan, waarbij de hoeveelheid schade wordt gemeten die met tussenpozen blijft. In 1994 werd een alternatieve, biochemische benadering voor de beoordeling van de reparatiecapaciteit beschreven (Collins et al., 1994), en sindsdien verschillende gewijzigde versies van de assay om zowel base excision repair (BER) en nucleotide excision repair (NER) te meten zijn gepubliceerd (beoordeeld door Azqueta et al., 2014). Deze biochemische benadering is toegepast om de effecten van milieu, voeding, levensstijl, en bezetting op DNA-reparatiecapaciteit te bestuderen, in aanvulling op klinische onderzoeken (Azqueta et al., 2014).

deze alternatieve In-vitro-benadering voor DNA-herstel beoordeelt de herstelactiviteit van een celextract op een DNA-substraat dat gedefinieerde laesies bevat. De comet-test wordt gebruikt om de accumulatie van DNA-breuken (tussenproducten voor herstel) te volgen met de incubatietijd. Onlangs, Slyskova en collega ‘ s waren de eerste om de in vitro DNA reparatie assays voor BER en NER met succes toe te passen op menselijke weefselmonsters; in het bijzonder colorectaal carcinoom biopten (Slyskova et al., 2012, 2014).

een ander soort DNA-reparatietest, waardoor cellen die in de gel zijn ingebed, vóór lysis kunnen herstellen, werd onlangs aangenomen om de DNA-reparatiekinetiek in meer detail te bestuderen.; specifiek, om de regulatie van Ber proteã nen door post-transcriptional wijzigingen te bestuderen (Nickson and Parsons, 2014). Nog een andere manier om DNA-herstel te bestuderen, op het niveau van specifieke genen, is met de comet-FISH-techniek, die gebruik maakt van fluorescerende DNA-sondes die hybridiseren met het single-stranded DNA in de komeetstaart. McAllister et al. (2014) gebruikte deze methode om de preferentiële reparatie van de bundelbreuk in bulkdna evenals in geselecteerde gebieden met actief getranscribeerde genen te bestuderen.

het bestuderen van de kinetiek van het herstel van geïnduceerde schade zal helpen bij het begrijpen van cellulaire reacties op genotoxische chemische stoffen. Bovendien kan de Betekenis van DNA-herstel als speler in het (anti)carcinogene proces worden opgehelderd door te kijken naar herstel op het niveau van specifieke kankerdoelweefsels. Regulatie van herstel-en andere aspecten van de cellulaire respons op genotoxische verbindingen—zal waarschijnlijk epigenetische mechanismen impliceren en de comet-test is met succes aangenomen om veranderingen in het globale methylatiepatroon van DNA in individuele cellen onder verschillende groeiomstandigheden te meten (Lewies et al., 2014).

percentage staartdna wordt aanbevolen als de beste descriptor voor DNA—breukfrequenties, aangezien de genoemde kometen—en de mate van schade-gemakkelijk kunnen worden gevisualiseerd. Echter, veel onderzoekers nog steeds de voorkeur aan het gebruik van staart moment (Møller et al., 2014). In feite worden de twee descriptoren op dezelfde wijze beïnvloed door de testomstandigheden (Azqueta et al., 2011; Ersson and Möller, 2011).

variabiliteit in de Comet-test is een belangrijke kwestie, of deze nu het gevolg is van het gebruik van verschillende protocollen, of van oncontroleerbare of willekeurige experimentele variatie. De opname van referentiestandaarden in alle experimenten wordt aanbevolen, vooral wanneer een groot aantal monsters—bijvoorbeeld van een biomonitoringproef—bij verschillende gelegenheden worden geanalyseerd. Referentiestandaarden zijn cellen met een bekende hoeveelheid DNA-schade; onbehandelde cellen (negatieve controle), aan röntgenstraling blootgestelde cellen (positieve controle) of cellen die zijn behandeld met fotosensitizer plus licht (positieve controle voor tests met inbegrip van FPG-incubatie), batchgewijs bereid en ingevroren als aliquots. Als aanzienlijke variatie in de normen in een reeks experimenten optreedt, kunnen de resultaten van de steekproef worden genormaliseerd (Collins et al., 2014). Als referentienormen tussen laboratoria worden uitgewisseld, kunnen de resultaten van deze laboratoria gemakkelijker worden vergeleken.

Referentiestandaardcellen worden gewoonlijk in gels parallel aan de monstergels ingesteld. Interne standaarden-d.w.z., standaardcellen in dezelfde gel als monstercellen-zou ideaal zijn; maar het is natuurlijk essentieel om de twee soorten cellen te kunnen onderscheiden. Viscellen die of groter of kleiner zijn in genoomgrootte in vergelijking met menselijke cellen zijn met succes goedgekeurd voor dit doel (Brunborg et al., 2015). Deze referentiecellen kunnen worden gebruikt in combinatie met een standaard-of kalibratiekromme (vastgesteld met cellen die verschillende doses ioniserende straling krijgen), waardoor een nauwkeurigere kwantificering van DNA-letsels mogelijk is, uitgedrukt als een DNA-breukfrequentie in plaats van % DNA van de staart.

statistieken zijn een belangrijk instrument in alle toepassingen van de Comet-test, om te controleren of kleine verschillen bij toeval voorkomen. Beknopte beschrijvingen van statistische analyse en aanbevelingen voor tests zijn gepubliceerd (Lovell et al., 1999; Lovell and Omori, 2008). Møller and Loft (2014) herinneren ons eraan dat om de Comet assay statistische analyse eenvoudig te houden, een passend studieontwerp en statistische kracht zorgvuldig moeten worden overwogen bij het plannen van experimenten.

net als bij alle biologische analyses is data-integratie cruciaal voor de interpretatie van de resultaten van de cometanalyse in het grotere geheel. Integratie van de door de comet-test verstrekte informatie met andere indicatoren voor DNA-schade en cellulaire reacties (bijvoorbeeld oxidatieve stress, celdeling of celdood) is zowel in ERA toegepast (Costa et al., 2014; Santos et al., 2015) evenals menselijke (biomonitoring) studies (bijv., Langie et al., 2010; Slyskova et al., 2012). Ook het opnemen van” omics ” gegevens zal helpen bij het ontrafelen van de werkingswijze van genotoxische stoffen (Slyskova et al., 2012, 2014; Santos et al., 2015) – hoewel het de moeite waard is erop te wijzen dat verscheidene studies hebben aangetoond dat fenotypische maatregelen van DNA-reparatie niet noodzakelijk correleren met genomische of transcriptomische gegevens (Collins et al., 2012; Slyskova et al., 2012, 2014); de verschillende benaderingen moeten als complementair worden beschouwd.

zelfs na drie decennia van ontwikkeling en modificatie is de comet-test nog steeds een vrij eenvoudige, veelzijdige maar arbeidsintensieve test. Verschillende high throughput modificaties van de assay werden onlangs herzien (Brunborg et al., 2014). Zowel in vivo als in vitro toepassingen zouden groot voordeel halen uit verdere verbeteringen in efficiëntie, standaardisatie van protocol, en doorvoer. Automatisering en miniaturisatie zijn gemeenschappelijke strategieën op vele gebieden van biologie, die orden-of-magnitudeveranderingen in het aantal geanalyseerde steekproeven per experiment toestaan, die subjectieve vooringenomenheid verminderen, en reproduceerbaarheid verbeteren.

dus – waar kunnen we de komende 30 jaar op hopen? Acceptatie van de in vitro comet assay voor genotoxiciteitstesten, goedkope geautomatiseerde komeetscores om onderzoekers te redden van eindeloze microscopische weergave, protocolstandaardisatie (misschien) en betrouwbare interne referentiestandaarden, meer humane biomonitoringstudies van DNA-reparatie (acceptatie dat fenotypische assays een belangrijke plaats innemen naast genomica en transcriptomica), milieumonitoring met behulp van een verscheidenheid aan dier-en plantensoorten; en nog veel meer onvoorspelbare ontwikkelingen en toepassingen.

belangenverstrengeling verklaring

de auteurs verklaren dat het onderzoek werd uitgevoerd zonder enige commerciële of financiële relatie die als een potentieel belangenconflict kon worden opgevat.

Dankbetuigingen

wij willen alle auteurs, reviewers en redacteuren bedanken die aan dit onderwerp van het Grensonderzoek hebben bijgedragen. SL is de begunstigde van een postdoctorale subsidie van het AXA Research Fund en de Cefic-LRi Innovative Science Award 2013. AA bedankt het Ministerio de Economía y Competitividad (“Ramón y Cajal” programma, 2013) van de Spaanse regering voor persoonlijke steun.