Koloniehybridisatie
Koloniehybridisatie begint met het kweken van dunbevolkte bacteriekolonies op een voedingsagarplaat. Deze kolonies worden symmetrisch herhaald op een nitrocellulosefilter door direct contact, waarna de cellen op het filtermembraan worden gelyseerd en hun DNA wordt gedenatureerd, waardoor het aan de filter kan binden. Deze clusters van DNA worden dan gehybridiseerd aan een gewenste sonde van RNA of DNA (vooraf specifiek gekozen) en gescreend door autoradiografie. De clusters van DNA die een gewenst gen tentoonstellen worden dan aangepast aan de overeenkomstige (levende) bacteriële kolonies, die voor verdere groei en het experimenteren kunnen worden geà soleerd.
definitie van Colony Hybridization: – Colony hybridization is de “Blot analysis technique” waar de bacteriële cellen worden overgebracht van het vaste voedingsmiddel naar het absorberende materiaal. Koloniekruising kan als methode voor de isolatie van de specifieke opeenvolgingen of genen van DNA van de bacteriële cellen definiëren die hybride DNA bevatten, door middel van een nitrocellulose membraanfilter. Het overbrengende medium ondergaat dan verschillende chemische en fysische behandelingen.
overdrachtmedium van Koloniehybridisatie: – het nitrocellulosefilterpapier is het overdrachtmedium van de koloniehybridisatie die replica ‘ s van de hoofdplaat vormt. Nitrocellulose doet dienst als membraan dat de nauwkeurige exemplaren van het gen aan dat van de hoofdplaat bevat. Nitrocellulose filterpapier fungeert als de “Blotting pad”.
koloniehybridisatie omvat de volgende stappen:
voorbereiding van de hoofdplaat:- Ent eerst de bacteriële celsuspensie op het vaste agar medium in om de hoofdplaat voor te bereiden. Na de inoculatie, zal het aantal bacteriële kolonies ontwikkelen met verschillende plasmiden die verwijzen als “Master of Referentieplaat”.
vorming van replica ‘ s over een nitrocellulosefilter:-breng vervolgens de bacteriële cellen van de hoofdplaat over op het membraan of filter met behulp van een “Nitrocellulosefilter”. Druk het nitrocellulose filtreerpapier over het oppervlak van de hoofdplaat. Deze compressie van het filtermembraan zal replica ‘ s of kopieën van de bacteriële cellen vormen als die van de hoofdplaat.
behandeling van filtermedium met SDS: – behandel daarna het nitrocellulose filtreerpapier met het detergent zoals SDS (natriumdodecylsulfaat) om de bacteriële cellen te Lysen.
behandeling van filtermedium met alkali: – behandel het filtermedium met het alkaliachtige natriumhydroxide om het DNA in afzonderlijke strengen te scheiden.
fixatie van DNA op het filtermedium:- Om het DNA op het nitrocellulose filtreerpapier te bevestigen, bak het filtreerpapier op 80 graden Celsius of stel het bloot aan het UV-licht.
toevoeging van radioactieve sonde: – Hybrideer het nitrocellulose filtreerpapier met afdrukken van het plasmide-DNA door toevoeging van radioactieve RNA-sonde. Deze radioactieve RNA-sonde codeert het gewenste sequentiegen van de bacteriële cellen.
wassen en Autoradiografie: – was het filtreerpapier om ongebonden sondedeeltjes te verwijderen. Daarna, bloot het nitrocellulose filterpapier aan de röntgenfilm door de methode verwijzen als “Autoradiografie”. De kolonie die zal verschijnen na autoradiografie zal verwijzen als “Autoradiogram” die de genen van belang dragen.
Identificatie van het gewenste gen:-vergelijk vervolgens het ontwikkelde autoradiogram met de hoofdplaat om de kolonies te identificeren die een relevant gen bevatten.
de cellen die het gewenste gen bevatten, kunnen in het vloeibare medium groeien en verder verwerken voor de isolatie van recombinant plasmide-DNA.
conclusie:- Daarom kunnen we concluderen dat de kolonie hybridisatie methode is de “Screening techniek” die het gebruik van de radioactieve sonde maakt. De radioactief gelabelde sonde screent dan of isoleert het specifieke gen van het aantal bacteriële kolonies.
