A) obejmuje cykl życia seksualnego Chlamydomonas reinhardtii… / Pobierz Diagram Naukowy

… natury substancji genetycznych, które sprzeciwiały się prawu Mendla. Rozległe badania w ciągu ostatniego stulecia, z wykorzystaniem licznych technik, w tym mikroskopii elektronowej, genetyki, biologii molekularnej i biochemii, wykazały, że substancje genetyczne są w rzeczywistości genomami w chloroplastach i mitochondriach (Kuroiwa 1991; Birky 1995). Uważa się, że chloroplasty (cp) i mitochondria (mt) powstały w wyniku przodkowych związków endosymbiotycznych między komórkami jąderkowymi a wolnymi żywymi bakteriami-odpowiednio cyjanobakteriami i bakteriami Alfa – fioletowymi. Zawierają one własne genomy, które są prawdopodobnie śladami ich przodków (Gray 1992). Dziś wiemy, że geny CP i mt są przekazywane potomstwu wyłącznie od matki rodzicielskiej w różnych taksonach roślin wyższych, paproci, mchów, glonów (Kuroiwa 1991), grzybów (Mitchell and Mitchell 1952; Kawano et al. 1987) i zwierząt (Hutchison et al. 1974), w tym ludzi. Jednobiegunowe dziedziczenie genomów cp/mt od dawna uważano za pasywny wynik oparty na fakcie, że jaja zawierają wiele liczb organelli, podczas gdy męskie gamety, w najlepszym razie, przyczyniają się tylko do kilku (Gyllensten et al. 1991). Jednak proces dziedziczenia jednoparentnego może być bardziej dynamiczny. Klasycznym i uderzającym przykładem byłoby występowanie dziedziczenia nie-Mendeliańskiego w jednokomórkowych zielonych alg Chlamydomonas reinhardtii, które wytwarzają gamety o identycznych rozmiarach (izogamiczny) (Sager 1954). Cykl życia C.reinhardtii jest niezwykle prosty. Istnieją dwa typy krycia C. reinhardtii, Typ krycia plus (mt+) i typ krycia minus (mt), kontrolowane przez pojedynczy złożony typ krycia loci na grupie wiązania VI (Ferris et al. 2002). C. reinhardtii przechodzi cykl życia seksualnego, który obejmuje określone etapy różnicowania (ryc. 1). Komórki wegetatywne różnicują się w gamety w warunkach głodu azotu i napromieniowania światłem (Pan et al. 1996). W ciągu kilku minut od wymieszania gamety przeciwnych typów godowych przylegają do siebie przez wić i łączą się tworząc zygoty. Po obowiązkowym okresie uśpienia zygota ulega mejozie i kiełkowaniu, aby wyprodukować cztery haploidalne potomstwo. Ponad 90% powstałych Potomków dziedziczy cechy chloroplastu (cp), preferencyjnie od rodzica mt+, zjawiska opisanego po raz pierwszy ponad 50 lat temu (Sager 1954). Sager opisał wzorce dziedziczenia dwóch mutacji wywołanych promieniowaniem UV, sr1 i sr2 . Mutacja sr1 nadaje oporność na niskie poziomy antybiotyku streptomycyny, a mutacja sr2 nadaje oporność na wysokie poziomy streptomycyny. Po przejściu sr1 do szczepu wrażliwego na streptomycynę dziedziczono niski poziom oporności na streptomycynę, zgodnie z prawem Mendla. W przeciwieństwie do tego, gdy rodzic mt+ posiadający mutację sr2 został przekreślony do wrażliwego rodzica mt, wszystkie potomstwo mejotyczne było oporne na wysokie poziomy streptomycyny. W krzyżówce krzyżowej potomstwo mejotyczne było wrażliwe na streptomycynę (Sager 1954). W 1962 roku dowody na istnienie cpDNA pochodzą z badań mikroskopowych nad światłem i elektronami Ris i Plaut (Ris and Plaut 1962). Zaledwie rok później Sager i Ishida opisali izolację cpDNA przez odwirowanie gradientu gęstości chlorku cezu (CSCL) (Sager i Ishida 1963). W 1989 roku wykazano, że mutacja sr2 lokalizuje się w genie rps12 genomu cp (Liu et al. 1989). W 1972 r. jedno z badań biochemicznych wykazało, że ilość mt – cpDNA zmniejszyła się w stosunku do mt + cpDNA, 6-24 h po kryciu (Sager and Lane 1972). DNA z GAMET mt+ i mt – znakowano 14 N-lub 15 NH 4 Cl, A do monitorowania losów nuklearnego DNA i cpDNA u 6 – i 24-h zygot zastosowano odwirowanie gradientu gęstości CsCl. Sześć godzin po rozwoju zygoty sygnał reprezentujący mt-cpDNA był wyraźnie niższy niż mt+ cpDNA, co wskazuje na preferencyjne zmniejszenie mt-cpDNA w stosunku do mt+ cpDNA. W 1980 roku Grant et al. przedstawił pierwsze molekularne dowody na preferencyjną redukcję mt-cpDNA. (Grant et al. 1980). Autorzy monitorowali zachowanie mt+ i mt-cpDNA, wykorzystując polimorfizmy długości fragmentu restrykcyjnego (rflps) w zmutowanym szczepie C. reinhardtii ac-U-g-23, który przenosi dwie małe delecje w swoim chloroplastowym DNA. Autorzy odkryli, że zarówno delecje w cpDNA, jak i fenotyp nie-fotosyntetyczny były jednoparentnie dziedziczone. 203-kb chloroplast genomu C. reinhardtii (Maul et al. 2002) jest obecny w ~ 80-100 kopii na komórkę i jest zorganizowany w 5-10 kompleksów DNA-białkowych, które są nazywane nukleoidami chloroplastowymi (Kuroiwa et al. 1981). W 1982, Kuroiwa et al. okazało się, że barwione dapi (specyficzny fluorochrom dsDNA,4′, 6-diamidino-2-fenylindol) nukleoidy mt-CP zniknęły preferencyjnie u młodych zygotów w ciągu 50 minut od krycia (Kuroiwa et al. 1982). W 1999 r.zaobserwowano preferencyjny zanik nukleoidów mt – cp u żywej zygoty przy użyciu SYBR Green I (fluorochrom specyficzny dla dsDNA, który może przenikać do żywych komórek) (Fig. 1999). Interpretacja tego dramatycznego zjawiska była jednak kontrowersyjna, ponieważ preferencyjny zanik fluorescencyjnych nukleoidów mt-cp nastąpił na długo przed wykryciem redukcji DNA metodami biochemicznymi lub molekularnymi (6-24 godziny po kryciu) (Sager and Lane 1972). Aby to wyjaśnić, zaproponowano dwie podstawowe możliwości. Jedną z możliwości było to, że rozpad nukleoidów cp może prowadzić do dyspersji cząsteczek cpDNA, a drugą możliwością było to, że szybkie trawienie cząsteczek cpDNA może prowadzić do zaniku nukleoidów cpDNA. Jednym z problemów w rozwiązaniu tego pytania jest to, że reakcja kojarzenia jest wykonywana przy użyciu milionów GAMET mt+ i mt – (Rysunek 2). Populacja komórek jest nieuchronnie heterogeniczną mieszaniną komórek, takich jak niezmierzone gamety mt+ i mt -, zygoty z nukleoidami mt – cp lub bez nich oraz wyjątkowe zygoty meitotyczne (1~5%), które nie tworzą zygot meitotycznych (Ebersold 1967). Ogólnie rzecz biorąc, metody molekularne i biochemiczne wymagają dużych ilości jednorodnych próbek do dokładnych analiz, a każda heterogeniczność w próbkach myli wyniki. Innymi słowy, “osobowości” poszczególnych komórek lub organelli w populacji zostaną rozcieńczone i najprawdopodobniej utracone w procesie analiz. Z drugiej strony, mikroskopia może ujawnić “osobowości” na poziomie morfologicznym, ale nie na poziomie molekularnym. Do badania stanu cząsteczek cpDNA podczas zaniku nukleoidów mt-cp konieczne było zbieranie zygot na podstawie obecności lub braku nukleoidów mt – cp oraz analiza poszczególnych zygot przy użyciu molekularnych technik biologicznych. W tym celu zastosowano pęsetę optyczną (ryc. 3). Zastosowanie pęsety optycznej jest nowatorską techniką manipulowania żywymi komórkami lub organellami pod bezpośrednią obserwacją mikroskopową(Ashkin et al. 1987). W badaniu tym za pomocą pęsety optycznej zebrano pojedynczą zygotę z nukleoidami cp lub bez nich, a obecność lub brak cząsteczek mt-cpDNA określono za pomocą zagnieżdżonej analizy PCR. Indywidualne losy mt+ i mt-zygotic cpDNA były śledzone oddzielnie przy użyciu chloroplastowego transformatora LO3c, który zawiera bakteryjny Gen Aada (aminoglikozyd adenylotransferazy). Pojedyncze zygoty, które Otrzymano za pomocą pęsety optycznej, poddano bardzo czułej analizie zagnieżdżonej-PCR dla aadA (Fig. 1999). Gdy gamety l03c mt+ zostały skrzyżowane z gametami mt typu dzikiego, sekwencje genów Aada wykryto we wszystkich badanych zygotach. Wręcz przeciwnie, gdy gamety mt – L03c zostały skrzyżowane z gametami dzikiego typu, sekwencje Aada zostały amplifikowane tylko u młodszych zygotów (10 i 30 minut po utworzeniu zygoty). Po zniknięciu fluorescencyjnych nukleoidów mt – cp, sekwencje Aada nie były już wykrywane w zygotach (90 i 120 minut po utworzeniu zygoty). Wyniki te wskazują, że cząsteczki mt – cpDNA są całkowicie trawione w ciągu 10 minut, podczas których nukleoidy mt – cp znikają, a także, że co najmniej jedna wysoce skuteczna nukleaza jest aktywowana w Mt – chloroplastu tuż po utworzeniu zygoty. To aktywne trawienie mt-cpDNA jest prawdopodobnie podstawą macierzyńskiego dziedziczenia cpDNA. Najprostszym modelem dla jednokierunkowego dziedziczenia cpDNA jest to, że proces ten składa się z dwóch różnych zdarzeń, które mogą wystąpić na różnych etapach cyklu życia: “ochrona” mt+ cpDNA, być może podczas gametogenezy, i “niszczyciel” niezabezpieczonego mt – cpDNA podczas wczesnego rozwoju zygoty. A) hipoteza metylacji restrykcyjnej w 1972 r. Sager i współpracownicy zaproponowali, że mt – cpDNA był trawiony przez działanie enzymów restrykcyjnych, podczas gdy mt+ cpDNA był chroniony przez metylację – model analogiczny do bakteryjnego systemu metylacji restrykcyjnej (Sager and Lane 1972). Sager i współpracownicy szybko zgromadzili przekonujące dowody, które pokazują wzrost poziomu metylacji mt + cpDNA, który został wykryty 7 godzin po kryciu (Burton et al. 1979; Royer and Sager 1979; Sano et al. 1980). Ponadto opisano oczyszczanie metylotransferaz DNA specyficznych dla gamety mt+ o masie cząsteczkowej 60 kDa i 20 kDa (Sano i wsp. 1981). Ten methylation MT + GAMET specyficzny zdarzenie było pozornie odwracalne, jak można się spodziewać dla ochrony (Sano et al. 1984). Gen metylotransferazy DNA rezydującej w chloroplastach został ostatecznie zidentyfikowany w 2002 r., a jego ekspresja specyficzna dla gamety mt+ i lokalizacja chloroplastów zostały potwierdzone (Nishiyama et al. 2002). Z drugiej strony, seria artykułów z niezależnych grup twierdziła następnie, że metylacja mt+ cpDNA nie może odpowiednio wyjaśnić ochrony. Bolen i in. wyizolowano mutanta jądrowego me1, który konstytucyjnie metyluje cpDNA na wyższym poziomie zarówno w komórkach mt+, jak i mt – (Bolen i wsp . 1982). Gdy gamety me1 zostały użyte do krzyżowania, zaobserwowano normalne, jednoparentne wzorce dziedziczenia, niezgodne z…