acetylotransferaza Chloramfenikolowa jako marker selekcji dla transformacji chlamydialnej

pGFP::SW2, wektor wahadłowy skonstruowany przez Wanga i wsp., zawierał Gen β-laktamazy jako marker selekcji. Nosi również gen kota, który jest połączony z genem GFP . Odkryliśmy, że E. coli przekształcone za pomocą pGFP::plazmid SW2 był w stanie rosnąć w środowisku zawierającym chloramfenikol (końcowe stężenie: 170 µg / ml), co sugeruje, że Gen kota może być również stosowany jako marker selekcyjny do eksperymentów transformacji chlamydialnej. Jak ostrzegł Wang et al., niekorzystny wpływ chloramfenikolu na mitochondria gospodarza, wykazany przez Li i wsp. może wpływać na użyteczność tego antybiotyku do transformacji chlamydialnej . In Li et al.w raporcie stwierdzono, że minimalne toksyczne stężenie chloramfenikolu wynosiło 10 µg / ml, co spowodowało łagodne 20% zmniejszenie produkcji ATP. Ustaliliśmy, że pozornie najniższe stężenie chloramfenikolu, które całkowicie hamowało tworzenie się inkluzji w C wolnym od plazmidów. szczep trachomatis L2 oznaczony jako L2R wynosił tylko 0,05 µg / ml (dane nie pokazane), co było znacznie niższe od stężeń toksycznych dla komórek gospodarza. Dlatego uznaliśmy, że ten antybiotyk może być stosowany do selekcji transformantów wyrażających koty bez znaczącego obciążania komórek gospodarza.

przekształciliśmy L2R za pomocą pGFP:: SW2 i wybraliśmy połowę przekształconych komórek za pomocą ampicyliny, a drugą połowę za pomocą chloramfenikolu. Antybiotyki (2 µg/ml ampicyliny lub 0,1 µg/ml chloramfenikolu) dodawano do hodowli po 10 godzinach od przekształcenia. Począwszy od przejścia 2, ich stężenia zwiększano odpowiednio do 5 i 0,2 µg/ml i dodawano je w momencie szczepienia. Stosunek podziału między fragmentami pozostał 1: 1 od fragmentu 1 do fragmentu 4. Mimo, że MIC chloramfenikolu, który oznaczano przy niskiej wielokrotności infekcji (~0,1 jednostek tworzących inkluzję na komórkę), wynosił 0,05 µg/ml, spodziewano się, że niektóre nieprzetransformowane chlamydiae będą tworzyć inkluzje w obecności 0,1-0.2 µg/ml antybiotyku, ponieważ zastosowaliśmy wysoki stosunek EB do komórki do transformacji, a na skuteczność hamowania wzrostu chlamydiów przez antybiotyki wpływa mnogość infekcji . Przy opisanym powyżej protokole selekcji, w hodowlach wyselekcjonowanych za pomocą ampicyliny, pod mikroskopem kontrastu fazowego, stwierdzono, że prawie 100% komórek zawiera inkluzję z nieprawidłowym RBs w początkowym przejściu. Nieprawidłowe inkluzje zawierające RB były nadal obecne w niewielkiej części komórek w przejściu 2, ale w większości zostały zastąpione przez pozornie normalne inkluzje w przejściu 3. Normalne inkluzje stwierdzono w około 20% komórek, a nieprawidłowe inkluzje rzadko obserwowano w przejściu 4. W fragmencie 5, który wynikał z zaszczepienia 10% zbiorów z fragmentu 4, inkluzje znaleziono w 80% komórkach; najwyraźniej żaden z tych inkluzji nie zawierał nieprawidłowych RBs.

ponieważ chloramfenikol nie powoduje, że chlamydiae tworzą nieprawidłowy RBs, oceniliśmy odporność na antybiotyk na podstawie wielkości inkluzji. Inkluzje o mniejszych niż normalne rozmiarach wykryto w prawie wszystkich komórkach w przejściu 1. Niektóre, ale bardzo małe inkluzje zostały znalezione w przejściu 2, a większość z tych inkluzji została zastąpiona normalnymi inkluzjami przez przejście 3. Inkluzje o normalnej wielkości stwierdzono w ponad 20% komórek w przejściu 4. Przy przejściu 5, uzyskanym po zaszczepieniu przy 10% zbiorze passage 4 i zwiększeniu stężenia chloramfenikolu (z 0,2 µg / ml do 0,5 µg / ml), inkluzje o normalnej wielkości stwierdzono w prawie 100% komórkach 0000000.

oprócz pozornej oporności na czynniki selekcyjne, jako dodatkowe markery dla pomyślnej transformacji wykorzystaliśmy ekspresję GFP i przywrócenie syntezy glikogenu . EBS pobrane z fragmentu 5 zostały użyte do infekcji komórek McCoya z szybkością rozcieńczenia 1:100 (równoważność liczby komórek) do eksperymentów określających ekspresję GFP i syntezę glikogenu (fig. 2). Zgodnie z oczekiwaniami, ani C. trachomatis L2 (434/bu) (Fig.2A), ani nieprzetransformowany L2R wolny od plazmidów (Fig. 2b) nie wykazywały GFP. Zgodnie z ustalonymi ustaleniami synteza glikogenu w C. trachomatis wymaga swojego plazmidu, plama jodowa wykazała, że glikogen został nagromadzony w inkluzjach L2 typu dzikiego (Fig.2A), ale nie w L2R (Fig. 2b). W obecności 5 µg/ml ampicyliny, która hamuje podział RB, nie przekształcone L2R (Fig.2C) tworzyły inkluzje zawierające gigantyczne RBs bez wytwarzania glikogenu; natomiast chloramfenikol (końcowe stężenie: 0,5 µg/ml) całkowicie hamował tworzenie widocznych inkluzji w zakażonych komórkach L2R (Fig. 2D). Zgodne z danymi opublikowanymi przez Wang et al. , pGFP::Transformowany przez SW2 L2R wyselekcjonowany z ampicyliną utworzył inkluzje GFP-dodatnie z glikogenem (Fig.2e). pGFP:: transformowany przez SW2 L2R wyselekcjonowany chloramfenikolem również utworzył inkluzje GFP-dodatnie zawierające glikogen (Fig. 2F). Zgodnie z oczekiwaniami, transformanty wyselekcjonowane przez ampicylinę mogły tworzyć inkluzje zawierające glikogen o normalnej wielkości, dodatnie GFP w obecności chloramfenikolu (Fig. 2G); podobnie, transformanty wyselekcjonowane przez chloramfenikol były całkowicie oporne na ampicylinę, ulegały ekspresji GFP i wytwarzały glikogen(Fig. 2H). Wyniki te sugerują, że Gen kota w pGFP::Plazmid SW2 działa w chlamydiach, a oporność na chloramfenikol może być wykorzystana jako marker selekcji do transformacji chlamydialnej.

inkluzja, ekspresja GFP i synteza glikogenu pGFP:: transformanty SW2 C . trachomatis L2. Nieprzetransformowany szczep 434/bu (a), nieprzetransformowany szczep L2R wolny od plazmidów (B-D) i przekształcony szczep L2R wybrany za pomocą ampicyliny (E, G) lub chloramfenikolu (F, H) hodowano albo z pożywką zawierającą wskazany antybiotyk, albo z pożywką wolną od antybiotyków. Obrazy inkluzji w kulturach nieutwardzonych i barwionych jodem uzyskano za pomocą mikroskopii kontrastu fazowego lub mikroskopii fluorescencyjnej 48 h po zaszczepieniu. We wszystkich panelach kontrast fazowy i obrazy GFP mogą być nakładane na siebie.

następnie usunęliśmy Gen β-laktamazy z pGFP::Plazmid SW2, jak opisano w sekcji “Metody”, i wykorzystał otrzymany plazmid pGFP-CAT:: SW2 do transformacji L2R. przekształcone chlamydiae poddano selekcji z chloramfenikolem przy użyciu tego samego schematu, jak opisano powyżej. Inkluzje oporne na chloramfenikol pojawiły się w około 20% zakażonych komórek w hodowli passage 4. Mikroskopia fluorescencyjna i plama jodowa ujawniły inkluzje GFP-i glikogenu-dodatnie w komórkach zakażonych EBs pobranych z pasażu 5 i hodowanych w obecności chloramfenikolu (Fig. 3, górny panel). Jednakże, w wyniku braku β-laktamazy w plazmidzie pGFP-CAT::SW2, transformanty nie były w stanie tworzyć normalnych inkluzji w obecności ampicyliny; zamiast tego ich inkluzje były wypełnione nieprawidłowym RBs. Podczas gdy nieregularne inkluzje były nadal dodatnie dla GFP, były one w dużej mierze wolne od glikogenu (Fig. 3, dolny panel). Po przejściu 5, transformanty pGFP-CAT:: SW2 hodowano z 0,5 µg / ml chloramfenikolu dla dodatkowych czterech przejść w stosunku 1: 100 dla każdego przejścia. Wszystkie inkluzje w pasażu 9 miały taki sam wygląd jak inkluzje chlamydów pełnych plazmidów, a nie L2R wolnych od plazmidów i stwierdzono, że wszystkie wykazują ekspresję GFP (dane nie zostały przedstawione). Wyniki te dowodzą, że Gen CAT w plazmidzie pGFP-CAT::SW2, podobny do plazmidu pGFP::SW2, działa jako marker selekcji dla transformacji C. trachomatis.

inkluzja, ekspresja GFP i synteza glikogenu w L2R przekształconym pGFP-CAT:: SW2. Komórki zakażone chloramfenikolem-wybrane transformanty były narażone na działanie chloramfenikolu lub ampicyliny. Obrazy inkluzji w kulturach nieutwardzonych i barwionych jodem uzyskano za pomocą mikroskopii kontrastu fazowego lub mikroskopii fluorescencyjnej 48 h po zaszczepieniu. Kontrast fazowy i obrazy GFP można nakładać na siebie.

należy zauważyć, że Tam et al. wcześniej próbował opracować system transformacji z genem kota jako selektywnym markerem . W badaniu tym wektor wahadłowy zawierający Gen kota został elektroforetyzowany do EBs C. trachomatis E (szczep UW-5 / CX) i L2 (szczep 434 / Bu). Chociaż zarówno mRNA kota, jak i aktywność enzymów były wykrywalne w początkowych hodowlach przekształconych chlamydiae, autorzy nie uzyskali stabilnych transformantów po selekcji z chloramfenikolem przez 4 przejścia. Ważne jest, aby zauważyć, że oba szczepy elektroporatowane zawierają natywny plazmid, który ma to samo pochodzenie replikacji z rekombinowanym plazmidem stosowanym do transformacji . Od Wang et al. były w stanie uzyskać stabilne transformanty oporne na penicylinę tylko z L2R, wolnego od plazmidów C. wariant trachomatis L2, ale nie dziki Typ, pełen plazmidów 434 / Bu, w identycznych warunkach eksperymentalnych, nie jest zaskakujące, że tam et al. nie udało się uzyskać stabilnych chlamydiów odpornych na chloramfenikol.