Analiza genomu wiązania kondenzyny w Caenorhabditis elegans

kondensaty I I II dzielą dwie podjednostki SMC MIX-1 i SMC-4 i wyróżniają się trzema podjednostkami bez SMC (Fig. 1a). Condensin IDC różni się od condensin I tylko jedną podjednostką, wariantem SMC-4 DPY-27. Użyliśmy jednego lub dwóch różnych przeciwciał przeciwko każdej podjednostce condensin dla ChIP-seq i zidentyfikowaliśmy te miejsca wiązania wspólne dla wielu przeciwciał i replikatów biologicznych(dodatkowy plik 1: Tabela S1). Walidacja przeciwciał i spodziewane interakcje koimmunoprecypitacji z kondenzyny holocomplex przedstawiono w dodatkowym pliku 2. Parowa korelacja mediany wyników wzbogacania chipów klastrowała oddzielnie podjednostki kondenzyny I-IDC i II, potwierdzając rozkład poszczególnych podjednostek pomiędzy trzema typami kondenzyny (Fig. 1B).

wzorce wiązania trzech kompleksów kondenzyny o wysokiej rozdzielczości są podobne

C. elegans condensin I I II mają częściowo pokrywające się, ale różne lokalizacje chromosomalne w mitozie i mejozie, a condensin IDC jest specjalnie ukierunkowany na X . W związku z tym spodziewaliśmy się znaleźć różne wzorce ChIP-seq dla kondenzyny I, IDC I II. zamiast tego, wzorce wiązania podjednostek kondenzyny i, IDC I II były ogólnie podobne (rysunek 1C). Podobieństwo to nie było spowodowane reaktywnością krzyżową przeciwciał, ponieważ przeciwciało HCP-6, które nie wykazuje żadnej reaktywności krzyżowej i nie immunoprecypituje podjednostki i-IDC kondenzyny, wykazało rozległą Ko-lokalizację z podjednostkami i-IDC kondenzyny(patrz HCP-6 na fig. Ponadto, gdyby nakładanie się kondenzyny II było spowodowane reaktywnością krzyżową z KONDENZYNĄ IDC, spodziewalibyśmy się wzbogacenia miejsc wiązania kondenzyny II na X, co nie miało miejsca (rysunek 1D). W porównaniu do kondenzyny II, podjednostki KONDENZYNY IDC konsekwentnie miały wyższe wyniki ChIP NA X, co sugeruje różnicę w powiązaniu chromosomowym dwóch kompleksów kondenzyny wychwyconych przez ChIP (zwróć uwagę na różne skale na X i chromosomie I na fig.1C). Ponieważ wykonaliśmy ChIP-seq w zarodkach w fazie mieszanej, większość komórek (ponad 95% oszacowano na barwienie 4′,6-diamidino-2-fenylindol (dapi)) znajdowała się w interfazie. Brak podjednostek condensin I na autosomach (rys. 1C i dodatkowy plik 3: S1A) oraz poprzednia obserwacja, że kondenzyna I lokalizuje się na chromosomach mitotycznych po rozpadie otoczki jądrowej sugerują, że większość sygnału ChIP-seq pochodzi z interfazy. Na poparcie tego, wykazano, że kondenzyna II jest jądrowa podczas interfazy i wykazała bardziej równomierny rozkład miejsc wiązania między wszystkimi chromosomami (Fig. 1D).

KLE-2, HCP-6 i CAPG-2 są specyficzne dla kondenzyny II, co oznacza wiązanie kondenzyny II. Condensin I I IDC współdzielą wszystkie trzy podjednostki inne niż SMC, więc od tej pory odwołujemy się do sygnału ChIP-seq z DPY-26, DPY-28 i CAPG-1, Jak z condensin i-IDC. Aby skupić się na miejscach, które są związane jako złożone, uśredniliśmy sygnał chipowy ze specyficznych podjednostek CAP typu condensin. Oprócz danych uśrednionych, zweryfikowaliśmy, że każda analiza jest prawdziwa z pojedynczymi podjednostkami i przedstawiamy HCP-6 i DPY-28 W dodatkowych liczbach. Zidentyfikowaliśmy zestaw miejsc wiązania kondenzyny o wysokim zaufaniu i-IDC i II, wybierając tylko te piki ChIP-seq, które były spójne w dwóch lub więcej podjednostkach innych niż SMC (rysunek 1D). Jak wspomniano wcześniej, 97% wiązania kondenzyny I-IDC występowało na chromosomie X. Kondenzyna II była podobnie rozmieszczona między autosomami i X. Kondenzyna II wiązała się z silniejszymi miejscami kondenzyny I-IDC na chromosomie X (Fig. 1e i dodatkowy plik 3: Fig. S1B).

miejsca wiązania Kondenzyny są wzbogacane w aktywnych promotorach

aby zidentyfikować regiony, w których kondensiny preferencyjnie wiążą się, przeanalizowaliśmy miejsca wiązania kondenzyny w odniesieniu do kilku adnotacji genomowych. Miejsca wiązania kondenzyny zostały znacząco wzbogacone w promotorach, w pobliżu genów tRNA i niekodujących RNA (Fig.2A, dodatkowy plik 4: Fig. S2). Aby wyeliminować możliwość, że geny Trna związane z kondenyną występują tylko w promotorach, usunęliśmy geny tRNA znajdujące się w obrębie 1 kb miejsca rozpoczęcia transkrypcji (TSS) i ustaliliśmy, że nakładanie się miejsc wiązania tRNA i kondenzyny pozostaje znaczące (23% i 6% Trna pokrywało się odpowiednio z miejscami i-IDC i II kondenzyny, P = 0,0002). Wiązanie kondenzyny w genach tRNA sugeruje, że rekrutacja kondenzyny za pośrednictwem TFIIIC może być zachowana między C. elegans a drożdżami .

miejsca Kondenzyny są wzbogacone w promotory i Trna, a wiązanie dodatnio koreluje z transkrypcją. A) podaje się wzbogacenie lub zubożenie miejsc wiązania kondenzyny przy różnych adnotacjach genomowych. Losowe wzbogacenie i wartości p obliczono za pomocą testu permutacji, losowo rozdzielając piki kondenzyny 10 000 razy. Zarówno dla kondenzyny I-IDC, jak I II występuje znaczne wzbogacenie miejsc wiązania przy promotorach 1 kb i blisko niekodujących RNA (P = 0.0002), zubożenie w obrębie ciał genowych (miejsce rozpoczęcia transkrypcji (TSS) do miejsca zakończenia transkrypcji (TES)) (P = 0, 0002) oraz brak znaczącego wzbogacenia lub zubożenia w 3′ genów (P > 0, 05). B) sygnał chipowy Kondenzyny jest wyrównany w TSSs genów ekspresji (górne 25% na poziomie RNA, linie stałe) i genów nieekspresji (dolne 25% na poziomie RNA, linie przerywane). Okoliczne kropki reprezentują 95% poziom ufności. Jako kontrolka, sygnał chipowy immunoglobuliny G (IgG) w tsss jest wykreślony na szaro. C) dla całego genomu i chromosomu X podano współczynnik korelacji rangi Spearmana pomiędzy medianą wyniku ChIP przy promotorach 500 bp a poziomem RNA w odpowiednich genach. Istnieje niewielka dodatnia korelacja między wiązaniem kondenzyny a transkrypcją. (D) Mediana wyniku ChIP w granicach 500 bp przed TSS jest wykreślana w stosunku do poziomu RNA każdego genu. Geny związane z promotorem kondenzyny (zdefiniowane przez pokrywanie się z miejscem kondenzyny w obrębie 1 kb TSS) wyróżniane są kolorem pomarańczowym (kondenzyna i-IDC) i niebieskim (kondenzyna II). E) zawartość GC w oknach 50 bp jest wykreślana na szczytach wiążących condensin I-IDC I II. W ramach kontroli określono zawartość GC ponad 1500 losowych współrzędnych i wykreślono w taki sam sposób, jak rzeczywiste wierzchołki kondensatu. Średnia zawartość GC jest wysoka w okolicach szczytu wiązania kondenzyny.

Wiązanie było najwyższe w granicach 500 bp TSS (dodatkowy plik 5: Rysunek S3A), a 45% pików kondenzyny i-IDC i 62% pików kondenzyny II znajdowało się na promotorach. Wiązanie kondenzyny w promotorach dodatnio skorelowane z aktywnością transkrypcyjną genu niższego rzędu (Fig. 2b, C), ale nie wszystkie aktywne promotory zostały związane (Fig. 2D). Analiza ontologii genów promotorów wiązanych wykazała nieznaczne (1,3-krotnie), ale znaczące (P = 3,5 e-17) wzbogacenie genów z funkcją rozwoju zarodka (dodatkowy plik 6: tabela S2). Około 20% genów o wysokiej ekspresji (górny kwartyl na poziomie RNA) miało miejsce wiązania kondenzyny II w granicach 1 kb, a około 70% genów chromosomu X miało miejsce wiązania kondenzyny i-IDC w granicach 1 kb. Dlatego, chociaż aktywność transkrypcyjna jest ważna, nie wystarczy wyjaśnić specyficzności wiązania kondenzyny u niektórych promotorów.

zauważyliśmy, że wszystkie miejsca wiązania kondenzyny wykazały wyraźne wzbogacenie zawartości GC w porównaniu z otaczającymi regionami i losowymi współrzędnymi (rysunek 2e). U C. elegans zawartość GC w promotorach chromosomu X jest wyższa niż w promotorach autosomalnych . Możliwe jest, że wyższa zawartość GC jest cechą sekwencji DNA dla wiązania kondenzyny, a promotory X wyewoluowały, aby zawierały wyższą zawartość GC, aby wspierać Wiązanie KONDENZYNY IDC.

miejsca wiązania Kondenzyny pokrywają się znacząco z podzbiorem czynników transkrypcyjnych

aby określić dodatkowe czynniki odróżniające promotory związane z kondenzyną, porównaliśmy miejsca wiązania kondenzyny i TF i znaleźliśmy podzbiór TFs, który wiąże się z tymi samymi promotorami co kondensiny (Fig.3A). Wcześniejsze badania wykazały, że wiele TFs wiąże się z zestawem miejsc wiążących o wysokim obłożeniu (HOT). Stwierdzono pokrywanie się 5% i 22% miejsc condenzyny I-IDC i condenzyny II z miejscami gorącymi, odpowiednio (P = 0,0002). Znaczenie nakładania się z TFs pozostało takie samo, gdy z analizy wyeliminowano gorące miejsca (dodatkowy plik 5: Rysunek S3B). Procentowe nakładanie się dla każdego TF zależy od liczby miejsc wiązania, i są pokazane w dodatkowym pliku 5: Rysunek S3C. wśród poszczególnych TFs, odkryliśmy, że 69% miejsc kondenzyny II i 53% miejsc LIN-13 nakładało się ze sobą, co czyni LIN-13 górnym TF, który znacząco pokrywał się z kondenzyną II.

Wiązanie Kondenzyny II pokrywa się z czynnikami transkrypcyjnymi nie losowo, a analiza ekspresji sugeruje funkcję represyjną dla kondenzyny II. (A) miejsca czynnika transkrypcyjnego z modENCODE są uszeregowane przez fałdowe wzbogacanie nakładania się z miejscami wiązania kondenzyny. Fałdowe wzbogacanie określa się jako stosunek procentowego nakładania się obserwowanego w stosunku do średniej losowych rozkładów miejsc kondenzyny 10 000 razy w całym genomie. Wyniki wskazują, że Wiązanie kondenzyny nie jest przypadkowe w odniesieniu do miejsc wiązania TF. B) diagramy Venna pokazują nakładanie się miejsc wiązania kondenzyny II z LIN-13 (modENCODE_3342, zarodki) i LIN-35 (modENCODE_3925, zarodki późne) (u góry), tylko z LIN-13 (u dołu po lewej) i tylko z LIN-35 (u dołu po prawej). Proporcja nakładania się kondenzyny II z LIN-13 i LIN-35 jest większa w miejscach zajętych przez oba białka. Podane nakładanie oznacza liczbę pików kondenzyny II nakładających się na odpowiednie miejsca LIN – 13 i LIN-35. C) średnie wzbogacenie ChIP-seq z kondenzyny II, LIN-13 i LIN-35 są wykreślane na szczycie każdego szczytu kondenzyny II. Miejsca wiązania Condensin II dzielą się na cztery grupy. Górna grupa składa się z miejsc wiązania kondenzyny II nakładających się na LIN-13 i LIN-35, druga pokrywa się tylko z LIN-13, trzecia tylko z LIN-35, a ostatnia grupa nie pokrywa się ani z LIN-13, ani z LIN-35. Piki są w kolejności malejącej w oparciu o ich wzbogacenie chipów. Duża liczba miejsc condensin II wykazuje wysokie Wiązanie LIN-13, ale nie LIN-35. Wiązanie kondenzyny II jest silniejsze w miejscach związanych zarówno LIN-13, jak i LIN-35. (D) Analiza ekspresji różnicowej (RNA-seq) w stadium larw 2/3 (L2/L3) heterozygota jądra kle-2 w porównaniu z homozygotą. Przedstawiono proporcje genów związanych lub niezwiązanych przez KLE-2 ze wzrostem lub spadkiem poziomu transkryptu u homozygotycznego mutanta. Poziom transkrypcji proporcjonalnie większej ilości genów wzrasta u mutanta kle-2. TF, czynnik transkrypcyjny.

Lin-13 ma motyw interakcji białka siatkówczaka (pRb) i działa w rozwoju sromu z pojedynczym homologiem pRb LIN-35 W C. elegans . U D. melanogaster, Wiązanie podjednostki condensin II dcapd3 z chromatyną zmniejsza się po mutacji pRb . Jeśli w C. elegans LIN-13 rekrutuje condensynę II poprzez LIN-35, to te miejsca Lin-13, które również są związane LIN-35 (576), powinny pokrywać się z condensyną II bardziej niż te miejsca LIN-13, które nie są związane LIN-35 (1,033). Nakładanie się miejsc zajmowanych wspólnie przez Lin-13 i LIN-35 z miejscami zajmowanymi przez kondenzynę II było tylko nieznacznie wyższe niż miejsc, w których nie było LIN-13, odpowiednio 60% i 50% (rysunek 3B). Z drugiej strony, nakładanie się LIN – 35 Z kondenzyną II było większe w miejscach, które również były związane LIN-13 (45%) w porównaniu z miejscami niezwiązanymi (9%). Sugeruje to, że potencjalna interakcja między LIN-13 i kondenzyną II jest w większości niezależna od LIN-35. LIN-35 Działa w zachowanym wielobiałkowym kompleksie zwanym DRM U C. elegans (hDREAM u ludzi), który zawiera również EFL-1 i DPL-1 . 555 miejsc wiązania DRM, które były związane LIN-13, wykazało większe nakładanie się kondenzyny II (63%) w porównaniu do 787 miejsc wiązania DRM, które nie były związane LIN-13 (13%). Miejsca kondenzyny II podzieliliśmy na cztery grupy według miejsca wiązania pokrywającego się z LIN-13 i LIN-35 (rysunek 3C). Grupa ta wskazała, że duża liczba miejsc występowania kondenzyny II wykazuje wysokie Wiązanie LIN-13, ale nie LIN-35, co sugeruje, że jeśli w C. elegans zachowana jest Rekrutacja kondenzyny II Za Pośrednictwem pRb, LIN-35 może zależeć od obecności LIN-13 W przypadku rekrutacji kondenzyny II.

mutacja Condensin II powoduje defekty transkrypcyjne, które sugerują funkcję represyjną

w drożdżach i D. melanogaster, condensin został zaangażowany w represji transkrypcyjnej . Jedno z ostatnich badań D. melanogaster wykazało, że podjednostka condensin II CAPD3 jest wymagana do transkrypcyjnej aktywacji klastra przeciwbakteryjnych genów peptydowych . Aby zrozumieć rolę kondenzyny II w regulacji transkrypcji, wykonaliśmy RNA-seq u larw mutantów L2/L3 kle-2. Matczyny załadowany KLE-2 pozwala kle-2 null mutant (ok1151 allel) dorosnąć do sterylnych dorosłych. Porównaliśmy ekspresję genu w heterozygotycznych i homozygotycznych mutantach kle-2 w larwach L2 / L3 przed namnażaniem się linii zarodkowej, a więc zawierającej prawie całkowicie jądra międzyfazowe. Analiza ekspresji różnicowej przy użyciu DESeq2 zidentyfikowała 356 genów, których ekspresja była znacząco różna u homozygoty w porównaniu z larwami heterozygoty (wskaźnik fałszywego odkrycia < 5%; wyniki DESeq2 przedstawiono w dodatkowym pliku 7: tabela S3). Większość genów różnicowo ekspresji wzrosła (70%), a nie zmniejszyła (30%) w ekspresji. Analiza ontologii genów nie wykazała konkretnej grupy genów, na które wpływ miała mutacja KLE-2. Podobnie jak w przypadku opublikowanych danych dotyczących KONDENZYNY IDC, nie stwierdzono bezpośredniej korelacji między wiązaniem KLE-2 a zmianami ekspresji genów. Co ważne, wśród 46 genów różnicowo ekspresyjnych i związanych z KLE-2, 83% zwiększyło ekspresję w porównaniu z 67% Z 310 genów, które nie były związane z KLE-2 (ryc. 3D), co sugeruje, że bezpośredni efekt wiązania kondenzyny II jest w dużej mierze represyjny.

modyfikacje histonów związane z otwartą chromatyną dodatnio korelują z wiązaniem kondenzyny

aby zrozumieć kontekst chromatyny wiązania kondenzyny, przeanalizowaliśmy związek między miejscami wiązania kondenzyny a cechami chromatyny odwzorowanymi za pomocą modENCODE . Zaobserwowaliśmy ogólną pozytywną korelację między wiązaniem kondenzyny a znakami aktywnej chromatyny. U drożdży liczba miejsc wiązania kondenzyny w całym cyklu komórkowym bezpośrednio koreluje z długością chromosomu. Liczba C. miejsca wiązania elegans condensin II nie były proporcjonalne do długości chromosomu (Fig. 4a), ale pozytywnie skorelowane z długością chromosomów związanych z aktywnymi znakami histonów (Fig.4B). Chromosom X był wyjątkiem, być może ze względu na mechanizmy kompensacji dawkowania, które zmieniają jego chromatynę . Wiązanie kondenzyny I-IDC i II w całym genomie korelowało dodatnio ze znakami chromatyny otwartej, takimi jak H3k27ac, i ujemnie ze znakami heterochromatyny, takimi jak H3K27me3 i H3K9me3 (Fig.4C i dodatkowy plik 8: Fig. S4). Korelacja ta była na poziomie całej domeny (analizowanym w oknach 1 kb), ponieważ nie widzieliśmy konkretnej modyfikacji histonów, która osiągnęła szczyt w miejscach condensin w analizie typu “metagene” (dane nie zostały pokazane). W badaniach immunofluorescencyjnych białka centromerowe pokrywały się z wiązaniem kondenzyny II w komórkach mitotycznych . Nie zaobserwowaliśmy pozytywnej korelacji pomiędzy sygnałami CENP-a i condensin II ChIP-seq w zarodkach w fazie mieszanej, co sugeruje, że w jądrach interfazowych (większość jąder w komórkach zarodków w fazie mieszanej) nie zachodzi na siebie nakładanie się. Alternatywnie, biorąc pod uwagę , że CENP-A wiąże się tylko z niewielkim podzbiorem CENP-a dodatnich regionów w genomie na komórkę, nakładanie się CENP-a z condensyną II może być widoczne tylko w pojedynczych komórkach. Aby zrozumieć, które czynniki chromatyny najlepiej przewidują Wiązanie kondenzyny, zastosowaliśmy podejście uczenia maszynowego. U C. elegans H4K20me1 jest silnie wzbogacony w chromosomie X przez DCC, a zatem H4K20me1 był najbardziej dyskryminującym czynnikiem dla wiązania KONDENZYNY IDC (Fig. 4D). Dla kondenzyny II, wysoce prognostycznymi cechami chromatyny są H3K27ac i CBP, oba markery aktywnych wzmacniaczy, co sugeruje, że Wiązanie kondenzyny jest wzbogacone w aktywnych wzmacniaczach . Wśród 201 miejsc wiążących condensin II, które były oddalone o 2 kb od opatrzonego adnotacją TSS, 58 pokrywało się z miejscem wiążącym CBP (P = 0,0002).

czynniki chromatyny związane z chromatyną otwartą i wzmacniacze dodatnio korelują z wiązaniem kondenzyny. A) liczba pików kondenzyny II jest wykreślana w odniesieniu do liniowej długości każdego chromosomu. B) Liczba pików kondenzyny II jest wykreślana na podstawie długości chromosomu objętego pikami h4k8ac i h4k16ac. Linia trendu dopasowana do danych autosomalnych wskazuje dodatnią korelację (R2 = 0,9). C) Wiązanie Kondenzyny w obrębie 1 kb sąsiadujących okien na chromosomie X (po lewej) i autosomach (po prawej) dodatnio koreluje ze znakami czynnymi (na przykład H3K27ac, H2A. Z) i ujemnie koreluje ze znakami represyjnymi (na przykład H3K27me3, H3K9me3). (D) zespół klasyfikator (losowe lasy) nauczył się przewidywać wiązania condensin w całym genomie. Top 20 cech (wśród 92 cech ogółem, dodatkowy plik 1: Tabela S1) o najwyższej mocy predykcyjnej są wykreślone dla condensin I-IDC (z lewej) i condensin II (z prawej) z najważniejszą cechą na górze. Cechy są uszeregowane na podstawie średniego spadku dokładności, który opisuje różnicę między stopniem błędu rzeczywistej klasyfikacji a stopniem błędu po permutacji cechy, uśrednionym dla wszystkich klasyfikatorów (drzew).

motywy sekwencji DNA wzbogacone w miejscach wiązania kondenzyny wykazują specyficzne cechy

chociaż kondenzyna II związana z miejscami wiązania kondenzyny i-IDC na X, kondenzyna i-IDC nie wiązała się z większością autosomalnych miejsc wiązania kondenzyny II (Fig. 1D). Aby zrozumieć specyfikę procesu rekrutacji kondenzyny IDC i II, poszukiwaliśmy cech sekwencji DNA, które odróżniają Wiązanie kondenzyny II i kondenzyny IDC. Wcześniejsze badania wykazały, że kondenzyna IDC jest najpierw rekrutowana do około 100 miejsc, a następnie rozprzestrzenia się do innych miejsc chromosomalnych . Motyw sekwencji DNA o długości 10 bp został wzbogacony w miejscach rekrutacji KONDENZYNY IDC (Fig. 5A) i mutacja motywu zniosła rekrutację kondenzyny IDC na macierzach pozachromosomalnych, co wskazuje, że motyw sekwencji DNA kondenzyny IDC odgrywa ważną rolę w rekrutacji kondenzyny IDC.

znaleźliśmy motyw sekwencji DNA zawierającej GCGC, który został wzbogacony w miejscach wiązania kondenzyny II (Fig.5A). Warto zauważyć, że zarówno kondenzyna II, jak i kondenzyna IDC zawierały rdzeń GCGC, ale motyw kondenzyny IDC został rozszerzony po jednej stronie przez AGG, co sugeruje, że specyficzność x kondenzyny IDC jest osiągana przez kofaktory rozpoznające AGG. W całym genomie, 11% motywów kondenzyny II było wiązanych przez kondenzynę II. Tak więc, podobnie jak inne TFs (na przykład), tylko część potencjalnych motywów sekwencji DNA była wiązana przez kondenzynę II. inne czynniki, takie jak dostępność chromatyny i nieznane współczynniki, mogą być zaangażowane w specyficzność wiązania. Rzeczywiście, jeśli weźmiemy motywy, które były w oknie 2 kb znacząco wzbogacone dla aktywnego znaku histonowego, takiego jak H4K16ac, odsetek motywów, które były związane, wzrósł z 11% do 29%. Ponadto, podobnie jak w przypadku kondenzyny IDC, która jest bardziej skupiona w miejscach związanych, odkryliśmy, że 1 kb okien genomowych, które zawierały więcej niż jeden motyw kondenzyny II, było około 2,5 razy bardziej prawdopodobne, że będzie związany przez kondenzynę II, w porównaniu do tych z tylko jednym motywem. Dlatego klastrowanie motywów i otwarty kontekst chromatyny pomagają określić wybór powiązanych motywów.

chromosomalna Rekrutacja condensin IDC i condensin II obejmuje zarówno wspólne, jak i odrębne regulatory. A) przedstawiono logotypy motywów sekwencji DNA o długości 10 bp wzbogacone w górne miejsca kondenzyny. B) przedstawiono nakładanie się miejsc wiązania kondenzyny i-IDC, kondenzyny II i SCC-2. Liczby pod każdym czynnikiem oznaczają całkowitą liczbę miejsc wiązania. Nakładające się liczby są oparte na liczbie pików SCC-2. (C) University of California Santa Cruz (UCSC) widok przeglądarki na przykładzie sygnału ChIP-seq SCC-2, który jest w większości ograniczony do promotorów. D) SCC-2 i condensin II wiążące w ściśle określonym miejscu rekrutacji condensin IDC na X (rex-1). E) w mutacji null sdc-2 (TY1072), kondenzyna i-IDC (DPY-26), kondenzyna II (HCP-6, KLE-2) i SCC-2 Wiązanie jest zmniejszone w rex-2 (lewy panel), ale pozostaje w dużej mierze podobne w autosomach (prawy panel). F) Wykres ramkowy stosunku wzbogacania chipów w mutancie sdc-2 do typu dzikiego w pikach wiążących SCC-2. Miejsca wiązania są klasyfikowane jako na autosomach, na X z niskim wiązaniem SDC – 2 i wysokim wiązaniem SDC-2. G) analiza qPCR wzbogacania chipów DPY-27 w embrionach wyizolowanych od dorosłych, które były karmione wektorem (kontrolnym) i PQN-85 RNAi. Wzbogacenie chipów wyraża się w stosunku do locus kontroli ujemnej. Paski błędów to odchylenia standardowe od trzech do pięciu replik biologicznych. ChIP, immunoprecypitacja chromatyny; DCC, kompleks kompensacji dawkowania.

nie wszystkie miejsca wiązania condensin II mają ten motyw. W tych miejscach condensin II bez motywu, inne czynniki mogą być odpowiedzialne za Wiązanie. Alternatywnie, niski odsetek miejsc zawierających kondenzynę II (27%) można wytłumaczyć potencjalnym rozprzestrzenianiem się kondenzyny II po rekrutacji. Miejsca rozprzestrzenienia nie powinny zawierać motywu. Na przykład w przypadku condensin IDC, wysoki odsetek potencjalnych miejsc rekrutacji (56%) zawiera motyw, ale nie miejsca rozprzestrzeniania się (8%) . Konieczne jest przeprowadzenie systematycznej analizy zdolności rekrutacyjnych zidentyfikowanych miejsc condensin II w celu zajęcia się ewentualnym rozprzestrzenianiem.

SDC-2 jest wymagane do wiązania kondenzyny I-IDC, kondenzyny II i ładowacza kohezyny z miejscami rekrutacji chromosomu X DCC

u metazoanów białka biorące udział w rekrutacji kondenzyny do chromosomów nie są dobrze poznane. U drożdży Wiązanie kondenzyny pokrywa się z wiązaniem cohesin-loading complex Scc2/4, co zwiększa skojarzenie kondenzyny z chromosomami . Aby sprawdzić, czy pokrywanie się z Scc2 / 4 jest zachowane między drożdżami A C. elegans, przeprowadziliśmy analizę ChIP-seq SCC-2 (znaną również jako PQN-85) i odkryliśmy, że niezwykłe 95% miejsc SCC-2 pokrywało się z condensyną i-IDC na X, a 60% Z condensyną II o szerokości genomu (rysunek 5B). Nakładanie się było podobne, gdy wykluczono gorące regiony (dodatkowy plik 9: rysunek S5A). Nie wszystkie miejsca kondenzyny pokrywały się z SCC-2, co sugeruje, że w przeciwieństwie do drożdży, kondenzyna nie zależy od SCC-2 do wiązania . Wiązanie SCC-2 było wyższe w promotorach i dodatnio skorelowane z transkrypcją (dodatkowy plik 9: Fig.S5B). Motyw sekwencji DNA zawierający GAGA był obecny w 58% miejsc wiązania SCC-2 (dodatkowy plik 9: Fig. S5C). W przeciwieństwie do Drosophila Nipped-B i podobnego do S. cerevisiae Scc2, Wiązanie SCC-2 nie było wysokie w transkrybowanych regionach, ale pozostawało międzygeniczne (Fig.5C).

prawie całkowite nakładanie się (96%) miejsc wiązania kondenzyny II z kondenzyną i-IDC na chromosomie X potwierdza istnienie wspólnych mechanizmów wiązania chromosomowego różnych kondensinów. Ponieważ condensin II i SCC-2 związane z condensin IDC rekrutacji miejsc na X (rysunek 5D i dodatkowy plik 9: Rysunek S5D), postawiliśmy hipotezę, że rekruterzy CONDENSIN IDC rekrutują również condensin II i SCC-2. Hermafrodyta-specyficzna Rekrutacja kondenzyny IDC na chromosom X odbywa się za pomocą SDC-2, SDC-3 i DPY-30 . Wykonaliśmy HCP-6 i KLE-2 (condenzyna II), DPY-26 (condenzyna i-IDC) i SCC-2 ChIP-seq w zmutowanych zarodkach SDC-2 null. W mutacji sdc-2 wiązania DPY-26, HCP-6, KLE-2 i SCC-2 zostały zniesione w miejscu rekrutacji kondenzyny specyficznej dla X (rex-2) (Fig.5E). Nie jest jasne, dlaczego Wiązanie HCP – 6 i KLE-2 w rex-2 zostało zmniejszone, zamiast przypominać autosomalne miejsce kondenzyny. Wiązanie SCC-2 w autosomach i miejscach chromosomu X, które są niezależne od SDC-2, pozostawało podobne u mutanta sdc-2 w porównaniu do miejsc, które były związane przez SDC-2 (Fig.5F). Nasze wyniki sugerują, że SDC-2, specyficzny dla hermafrodyty TF, który rekrutuje condensynę IDC na chromosom X, również rekrutuje condensynę II i złożoną podjednostkę SCC-2 do tych samych miejsc (dodatkowy plik 10: rysunek S6). Wcześniejsze badania genetyczne wykazały, że mutacja null sdc-2 nie powoduje śmiertelności embrionalnej u mężczyzn, dlatego funkcja condensin II i SCC-2 Rekrutacja przez SDC-2 nie jest niezbędna do ogólnej kondensacji i segregacji chromosomów . Możliwe jest, że SCC-2 i condensin II przez SDC-2 posiadają specyficzną dla hermafrodyty funkcję regulacyjną genu.

aby sprawdzić, czy SCC-2 ma wpływ na związek chromosomowy kondenzyny IDC w miejscu rekrutacji, przeprowadziliśmy ilościową analizę PCR chipu DPY-27 w kontroli w porównaniu do zarodków SCC-2 knockdown. Karmiąc RNAi, byliśmy w stanie powalić poziom SCC-2 o około 80% (dodatkowy plik 9: rysunek S5E). Po odrzuceniu SCC-2 nie widzieliśmy znaczącej zmiany wiązania DPY-27 W rex-1 lub rex-2 (Rysunek 5G). Konsekwentnie, analiza immunofluorescencji wiązania kondenzyny I I II na chromosomach mejotycznych nie wykazała znaczącej różnicy między mutantami typu dzikiego i scc-2 .