Anatomia i fizjologia

niniejsze badanie zostało przeprowadzone, z zasadami i regulacjami dotyczącymi opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych w domu zwierząt, a odpowiednie doświadczenie zostało zatwierdzone przez Centralny Komitet Etyki zwierząt . 25 samic Szwajcarskich myszy albinosów o średnim wieku 45 dni i wadze od 25 do 35gm zostało wybranych losowo z hodowli zwierząt, z różnych kolonii lęgowych. Te samice, które nie są w ciąży, zostały celowo kopulowane przez samca myszy tej samej odmiany w celu pozyskania 10 szczeniąt kolejnego pokolenia. W plastikowej klatce z poliwęglanu z dodatkami ze stali nierdzewnej umieszczono pojedyncze silne i mocne heterozygotyczne samce z pojedynczą samicą w atmosferze utrzymywanej w temperaturze 20 – 25C i wilgotności 55±5%, po 12 godzinach cyklu jasnego i ciemnego. Samice myszy zbadano pod kątem krzyżowej wtyczki pochwy, a obecność wtyczki dobrze wizualizującej oznaczono jako stwierdzoną ciążę i przypisano dzień zero ciąży. W dniu 7, 8 i 9 ciąży kobiety były poddawane badaniu palpacyjnemu jamy brzusznej.

charakterystyka AgNps

nanocząstki srebra ze źródeł zakupowych zostały ocenione pod względem ich pierwotnego rozmiaru za pomocą tem i ich aglomeracji w środowisku komórkowym za pomocą spektroskopii korelacji krzyżowej fotonów (PCCS) i spektroskopii ultrafioletowo–widzialnej (UV-Vis), dynamicznego rozpraszania światła i potencjału Zeta. Pokazano reprezentacyjne zdjęcia tem AgNps. Obrazy TEM pokryte PVP agnps rozproszone i zawieszone w 1.5M NaCl potwierdził pierwotną wielkość cząstek podaną przez producentów. Niepowlekane nanocząstki srebra znalazły heterogeniczny rozkład w zakresie od 50 do 100 nm, z czego większość to około 71 nm.

w przypadku zawieszonego proszku AgNps obrazy TEM wykazały, że w środowisku wodnym nanocząstki srebra zlepiają się i tworzą duże agregaty, z których wiele jest większych niż 50 Nm. Wynik ten jest zgodny z wynikami hydrodynamicznego rozkładu wielkości uzyskanymi metodą dynamicznego rozpraszania światła (Zeta sizer). Analizy EDX potwierdziły, że tylko srebro elementarne zostało przedstawione zarówno w Agnp koloidalnym, jak i suchym sproszkowanym. Zgodnie z wynikami ICP-AES stężenia jonów Ag w kwaśnych zapasach koloidalnego i zawieszonego proszku AgNps wynosiły odpowiednio 1908,1 i 447,2 mgl-1. Również wyniki wzorca XRD potwierdzają krystaliczność sproszkowanego typu AgNps i obecność pierwiastkowego srebra krystalicznego, również inne fazy, z wyjątkiem srebra metalicznego, nie były obecne w próbce. Ponadto wyniki XRF wykazały, że czystość sproszkowanego typu AgNps wynosiła 97,86%.

narażenie na koloidalny roztwór AgNps przez wielokrotne doustne zgłębniki

ciężarnym myszom podawano podwójnie z normalną solą fizjologiczną (Kontrola pozorowana) jako nośnikiem i w dawce 5, 10, 15, 20 mg/kg mc.podawano przez wielokrotne doustne zgłębniki, od 7 do 12 dnia ciąży za pomocą tępej końcówki zakrzywionej igły do karmienia i dołączonej furgonetki. Zwierzęta z pozorowaną kontrolą są włączane do eksperymentów na zwierzętach leczonych i nieleczonych.

rozwarstwienie i wypatroszenie

na GD 18, prawe i lewe rogi macicy ciężarnej matki zostały wyekstrahowane po laparotomii brzusznej w głębokim znieczuleniu eterem/chloroformem, a 250 świeżo zebranych matek poprzez rozwarstwienie przemyto wodą z kranu na szalce Petriego w celu usunięcia krwi i płynu owodniowego i wysuszono bibułą filtracyjną i odwodniono w 95% alkoholu przez 48 godzin w końcu wystawiono na działanie 1% KOH w celu wypatroszenia konsystencji i protokół barwienia alizaryny dla prawidłowej wizualizacji kości, normalnej lub nieprawidłowej.

metoda (ocena dysmorfologii szkieletu techniką wypatroszenia i barwienia Alizaryną)-:

badanie dysmorfologii szkieletu przeprowadzono techniką patroszenia i barwienia Alizaryną. Wszystkie próbki (50 szczeniąt) z każdej grupy odwodniono w 95% alkoholu ( spirytus rektyfikowany) przez 48 godzin, a następnie usunięto i przemyto bieżącą wodą z kranu, a następnie wypatroszono 1% roztworem KOH (KOH 1GM+100ml d.w.). Po wykonaniu laparotomii brzusznej ważne organy są usuwane. Próbki zanurzano dokładnie w dużej ilości 1% roztworu wodorotlenku potasu (KOH) przez co najmniej 2 do 4 dni, aż ciało, ścięgno, mięśnie i wnętrzności były przezroczyste & jasne i rozwiązane, a następnie krystalicznie czysta widoczność kości i chrząstek. Każdego dnia roztwór był zmieniany, gdy stał się odbarwiony i marnotrawstwa.

krystalicznie czystą kość i chrząstkę widoczną próbkę umieszczono w tym samym 1% KOH, a następnie dodano 6 do 8 kropli 1% plamy alizaryny w celu zabarwienia jej głębokiej purpurowej Czerwieni. Roztwór delikatnie wstrząsano kilka razy na godzinę. Następnie tę samą procedurę kontynuowano przez kolejne 2-3 dni, aby nadać kościom i chrząstkom głęboki purpurowo-czerwony kolor. W celu usunięcia wszelkich przebarwień i wygładzenia próbek, te same są następnie przepuszczane przez 40%, 80% (40 ml glicerolu+60 ml wody destylowanej, 80 ml glicerolu+20 ml wody destylowanej) i 1 do 2 kryształów tymolu dodanych do długotrwałej konserwacji, ostatecznie utrzymywanych w 100% glicerolu, podawanych do fotografii & potężnej ręcznej obserwacji soczewki.

łącznie pobrano 250 płodów od 25 matek z 1, 2, 3, 4 i 5 grup, z których wszystkie próbki poddano eksperymentom z dysmorfologią szkieletową. Zaobserwowano resorpcję 60 płodów.

statystyki

odsetek malformacji szkieletowych oceniano w każdej grupie i oceniano na podstawie liczby kości biorących udział w dysmorfologii, a następnie porównywano odsetek pomiędzy grupą i w grupie pod kątem zależnego od dawki czynnika teratogennego. Multi ANOVA i Statystyka opisowa (analiza post hoc) test używany w tym celu.

obserwacja i wyniki

odsetek dysmorfologii szkieletowej był wyższy i najwyższy u szczeniąt z grupy leczonej 15 mg AgNps i 20 mg AgNps / kg mc. (Tabela 1).

w grupach leczonych niższą dawką AgNps (0, 5 & 1 mg / kg mc.(ryc. 1).

ryc. 1 Kontrola plamy alizaryny płodu widok grzbietowy (A) i boczny (B).

jeden z 5 mg AgNps/ kg mc.leczonej grupy pup wykazał nie skostniały 5 segment mostka od pręta mostka i nie skostniały segment Manumbrium, który jest diagnozowany jako rozszczep mostka. Inne płody wykazywały hipoplazję szczęki i żuchwy, nie skostniałą kość czołową, ciemieniową i nosową, niepowodzenie fuzji tylnego odcinka kości biodrowej, 10,11 i 12 żebra widoczne w lewej części płodu. Brak środkowego trzonu od 6 do 12 żebra wraz ze zwiększeniem przestrzeni między kolejnymi żebrami oznaczano u wielu płodów z różnych grup i diagnozowano jako zwiększoną przestrzeń sieciową, brak ciała & proces kolanowy jest obserwowany z całych segmentów kręgów piersiowych, co jest diagnozowane jako defekt cewy nerwowej Typu Bliskiego w 1% przypadków z tej leczonej grupy płodów. Odsetek dysmorfologii szkieletowej obliczony w tej grupie wynosił 32% (rycina 2).

ryc. 2 5 mg agnps plama z grupy leczonej Alizaryną płodu widok grzbietowy (a) i (B), widok boczny (C) widok brzuszny (D) i widok grzbietowy (E)

płody z grupy leczonej AgNps 10 mg wykazały dysmorfologię szkieletową w postaci braku kręgu lędźwiowego i krzyżowego, braku kości biodrowych, poważnie zwyrodnionych żeber bez chrząstek, kości czołowej i ciemieniowej wykazały brak skostnienia i nierozwinięcia, skoliozę obserwuje się w odcinku piersiowym i lędźwiowym u jednego z płodu, brak kręgu szyjnego jest widoczny, hipoplazja szczęki, ujawnienie strzałki widoczne są również szwy koronowe. Nierozwinięte kości kończyn dolnych są widoczne po obu stronach jednego z płodu. Odsetek dysmorfologii szkieletowej obliczony w tej grupie wynosił 44% (rycina 3).

ryc. 3 10 mg agnps Grupa leczona płód alizaryna plama widok grzbietowy (A, B).

wśród 15mg agnps leczonych grupy 8 szczeniąt obserwowano brak kręgów szyjnych z brakiem 12 żebra i reszta kręgów obserwowano niezagospodarowany proces kolanowy, rozszczep śródstopia jest również widoczne na widok grzbietowy stopy jednego z płodu, nie skostniałe kości biodrowej w widoku brzusznym z brakiem segmentu & włóknienie jest również widoczne, nie skostniałe kości skroniowej, która jest fibrosed na widoku bocznym czaszki, brak proksymalnego segmentu kości innominate,anomalia kręgosłupa obserwowano z podstawowym 6-tym i 9. żebro i brak 10., 11. i 12. obserwuje się żebra u jednego płodu, nie skostniałą kość ciemieniową również obserwowano, Anencephaly ze skoliozą kręgów obserwowano w L1-L5 u jednego płodu, nie skostniałą kość biodrową obserwowano, nie skostniałą łopatkę po obu stronach widziano w widoku grzbietowym jednego płodu, brak chrząstki obserwowano od 6 do 12 żebra u jednego płodu. Odsetek dysmorfologii szkieletowej obliczony w tej grupie wynosił 60% (rycina 4).

ryc. 4 15 mg agnps plama z grupy leczonej alizaryną płodu widok grzbietowy (A, B) i widok brzuszny (C)

20mg / kg m.c. U płodu z grupy leczonej AgNps stwierdzono najwyższy odsetek dysmorfologii szkieletowej (76%). Skoliozę obserwowano w okolicy lędźwiowej u jednego płodu, u jednego płodu wykazano nie skostniałą kość potyliczną, nie skostniałą łopatkę i kość biodrową, Duże zwłóknienie obserwuje się w kościach szczękowych, czołowych i ciemieniowych, to samo obserwuje się również w drugim do szóstego segmencie mostka., rozszczep obserwuje się w stawie skokowym, obserwuje się zwiększoną przestrzeń między 1. A 2. żebrem i 5. do 8. żebrem lewej strony płodu , obserwuje się również rozszczep w stawie spojenia łonowego jednego z płodu, niedorozwój żuchwy, brak procesu kolczystego z falistymi żebrami, u jednego płodu zaobserwowano całkowite zespolenie 2.do 8. kręgu szyjnego, które jest wyraźnie odróżnione od reszty 1. kręgu szyjnego. Zaobserwowaliśmy również łagodną skoliozę i nie skostniałą kość potyliczną i ciemieniową oraz brak łopatek po prawej stronie jednego z płodu, obserwuje się również hipostatyczne kręgi (ryc. 5).

ryc. 5 20 mg agnps Grupa leczona płód alizaryna plama widok grzbietowy.