Baza wiedzy Alpha CETSA

• CETSA ®
• typy docelowe/próbki
• Warunki testu Cetsa®
• testy immunologiczne Alfa CETSA®
• Analiza i interpretacja danych CETSA®

Zastrzeżenie: wyłącznie do użytku badawczego. CETSA® jest zarejestrowanym znakiem towarowym firmy Pelago Bioscience AB. Należy pamiętać, że do korzystania z zestawu wymagana jest ważna subskrypcja CETSA®.

sama metoda CETSA®

P: Co to jest CETSA®?

A : Komórkowy Test przesunięcia termicznego jest metodą, która umożliwia kwantyfikację docelowego zaangażowania związku (TE)w żywych komórkach lub w komórkach zaburzonych. Zasada testu CETSA® opiera się na zmianie profilu denaturacji termicznej białka docelowego, która następuje po związaniu związku. Test CETSA® przeprowadza się przez inkubację komórek z badanym Związkiem, następnie przez ogrzewanie komórek poddanych działaniu związku, a następnie przez pomiar pozostałego rozpuszczalnego białka docelowego.

P: Co to jest przesunięcie termiczne

A: Po podgrzaniu białko napotyka temperaturę, w której denaturuje (czasami określaną jako temperatura topnienia). Ta temperatura topnienia jest właściwością fizyczną i stałą dla dowolnego zestawu warunków (pH, ciśnienie, sole). Związki, które wchodzą w interakcje z białkiem, zmieniają temperaturę topnienia (przesunięcie termiczne). Dla danego miejsca wiązania w białku wielkość przesunięcia termicznego może być mierzona przy różnych stężeniach związku (dawka-odpowiedź), a wartości EC50 pochodzące z takich krzywych mogą być wykorzystane do ustalenia rzędu siły szeregów związków, co bezpośrednio koreluje z rzędem powinowactwa związków . Istnieje kilka odmian testu przesunięcia termicznego in vitro, ale kluczowa technika została po raz pierwszy opisana przez Semisotnova i wsp. (1991). W tej metodzie topnienie i rozkładanie białka naraża hydrofobowe powierzchnie, które umożliwiają Wiązanie SYPRO orange. Fluorescencja tych barwników jest gaszona w wodzie, więc wiązanie z tymi hydrofobowymi powierzchniami odwraca to i powoduje szczyt fluorescencji, gdy białko jest w pełni rozłożone. Ten typ testu przesunięcia termicznego może być stosowany tylko do wysoko oczyszczonych białek, a dla gatunków o niskiej obfitości może to oznaczać, że system nadmiernej ekspresji jest wymagany do wytworzenia wystarczających ilości.

Thermofluor-system barwników wrażliwych na temperaturę (przy użyciu Sypro Orange)

różnicowa fluorymetria skaningowa (DSF) – alternatywne metody oparte na barwnikach

Kwantytywne systemy PCR (np. Roche Light cycler) : są one używane do dostarczania zdarzenia grzewczego i mogą mierzyć zmiany fluorescencji

Nanotemper – jest firmą produkującą dedykowany przyrząd, który ogrzewa próbkę i mierzy fluorescencję. Oferuje lepszą wydajność niż przystosowane systemy PCR.

P: Dlaczego pomiar zaangażowania celu jest ważny?

A: w przypadku braku potwierdzenia, że związek rzeczywiście wchodzi w interakcję z pożądanym celem, twórcy leków mogą stracić cenny czas i zasoby poruszające się w złym kierunku. Z tego powodu potwierdzenie docelowego zaangażowania związku od dawna uważane jest za niezbędne w odkrywaniu leków. Takie testy umożliwiają bezpośrednie porównanie powinowactwa związku do jego celu, ponieważ jest to niezbędny środek do wyboru, które związki mają awansować na wszystkich etapach wytwarzania ołowiu i optymalizacji. Ponieważ zaangażowanie docelowe może być skorelowane z powinowactwem, umożliwia naukowcom wybór związków o najwyższych wartościach powinowactwa. Jako taki jest to niezwykle przydatny środek zapewniający prawidłową priorytetyzację związku na każdym etapie procesu odkrywania leku.

P: czym różni się CETSA® od innych technologii badania przesunięć termicznych?

A: oprócz CETSA ® istnieje wiele metod oceny zaangażowania docelowego(np. powierzchniowy rezonans Plazmonowy, Polaryzacja fluorescencji i przesunięcie termiczne). Jednakże wszystkie te metody opierają się na dostępności oczyszczonego białka i mogą być stosowane tylko In vitro, co oznacza, że pochodne wartości powinowactwa mogą nie przewidywać rzeczywistego powinowactwa lub potencjału wiązania w żywych komórkach. Będąc w stanie przeprowadzić testy przesunięcia termicznego w odpowiednim kontekście komórkowym, gdzie białko znajduje się w swoim rodzimym środowisku, w obecności naturalnych białek partnerskich, z fizjologicznymi stężeniami kofaktorów i substratów, daje znacznie bardziej istotne dane, które lepiej przełożą się na modele zwierzęce i badania kliniczne.

podczas gdy komórkowy Test przesunięcia termicznego jest metodą opartą na tej samej zasadzie biofizycznej, co standardowe testy przesunięcia termicznego (tj. że określone białka będą denaturyzowane w zadanej temperaturze), nie mierzy on bezpośrednio specyficznej temperatury rozkładania, lecz opiera się na fakcie, że obecność związku na białku wpłynie na ilość rozpuszczalnego białka obecnego po podgrzaniu do zadanej temperatury. Jako takie, CETSA® jest w istocie całkowitym testem białka przeprowadzonym po określonym zdarzeniu grzewczym. Związki o różnej docelowej sile zaangażowania zmienią względne ilości białka, które przetrwają Zdarzenie grzewcze. Ponieważ test mierzy to białko resztkowe, a nie rzeczywiste Zdarzenie topnienia, może być stosowany do bardziej złożonych systemów in vivo, takich jak komórki i lizaty (a w niektórych formatach CETSA® nawet tkanka stała). Ponadto CETSA® może zidentyfikować związki, które destabilizują białko (tj. obniżają jego temperaturę topnienia), jest to mniej proste w przypadku innych metod przesunięcia termicznego.

Q: Czym Alpha CETSA® różni się od innych komórkowych technologii testu przesunięcia termicznego lub innych komórkowych testów zaangażowania docelowego?

A: jak wspomniano powyżej, CETSA® jest zasadniczo całkowitym testem białka przeprowadzonym po szoku cieplnym. Alpha CETSA® wykorzystuje podwójny system wykrywania zbliżeniowego przeciwciał. Inne metody unikają stosowania układu opartego na przeciwciałach poprzez modyfikację białka docelowego:

• Promega nanoluciferaza Thermal shift assay (NaLTSA): Nanoluc Lucyferaza skondensowana z białkiem docelowym (białko rekombinująco wyrażone); Gdy cel białka z znacznikiem enzymu Nanoluc agreguje się, sygnał lucyferazy zmniejszy się.
• Promega NanoBRET Target Engagement Assay: znacznik fuzyjny Lucyferazy w połączeniu ze znakowanymi związkami znakującymi, które w bliskim sąsiedztwie lucyferazy doprowadzą do transferu energii rezonansu Bioluminescencyjnego (BRET). Wiązanie złożone w tej samej kieszeni wyprze znacznik, a sygnał BRET zmniejszy się. To nie jest metoda szoku cieplnego.
• DiscoverX Incell Pulse: oparty na technologii uzupełniania fragmentów enzymów (EFC) : białko docelowe jest skondensowane z małym fragmentem dawcy enzymu β-galaktozydazy (β-gal). Dodane białko reporterowe wiąże się z tym fragmentem w celu odtworzenia aktywnego enzymu, który hydrolizuje substrat i generuje sygnał chemiluminescencyjny umożliwiający kwantyfikację obfitości białka. Po denaturacji ciepła białko agreguje się i ogranicza dostęp większego składnika lucyferazy do swojego partnera na docelowym białku.

zasadnicza różnica między tymi systemami ” rekombinowanego cetsa® “lub” rekombinowanego zaangażowania docelowego ” a Alfa CETSA® polega na tym, że nie można ich stosować do komórek natywnych i niezmodyfikowanych. Ma to szereg negatywnych konsekwencji:

1. podczas gdy koszt opracowania nowej pary przeciwciał i późniejsze koszty per well mogą być wyższe niż zwykłe transfekcja pojedynczej linii komórkowej, jest prawdopodobne, że każdy program odkrywczy będzie chciał być testowany z różnymi modelowymi liniami komórkowymi, każda transfekcja wiąże się z własnymi kosztami, a klonowanie kolejnych linii komórkowych zajmie dodatkowe tygodnie.
2. generowanie oznaczonego białka zawsze będzie miało fizjologiczne konsekwencje dla komórki, a oznaczone białko może być (i) nadmiernie ekspresyjne (zła Stechiometria vs. partnerzy), (ii) Nie zlokalizowane w prawidłowym przedziale komórkowym lub (iii) nie związane z kluczowymi białkami partnerskimi oraz (iv) mogą mieć inne właściwości topnienia niż białko natywne. Co oznacza, że pozorny efekt związku może nie odzwierciedlać jego rzeczywistego zachowania w tkance pacjenta. Problemy te mogą być powiększone w dowolnym systemie tymczasowej transfekcji.
3. inhibitory Lucyferazy mogą powodować fałszywie dodatnie trafienia.
4. w późniejszych etapach optymalizacji ołowiu, gdy wymagane są bardziej złożone i fizjologicznie bardziej istotne modele komórkowe (pierwotne, natywne linie komórkowe i tkanka), tagowane podejścia białkowe po prostu nie mają zastosowania.

P: Jakie informacje dostarcza test CETSA®?

A: CETSA® zapewnia unikalną miarę obecności związków “w celu” i może być traktowana jako obłożenie celu. To obłożenie będzie miało wpływ zarówno na zdolność związków do angażowania celu, jak i na zdolność związku do obecności we właściwym miejscu (tj. czy ma odpowiednią rozpuszczalność, przepuszczalność, stabilność metaboliczną i dostępność w odpowiednim przedziale komórkowym). Pozakomórkowe testy zaangażowania docelowego oferują miary powinowactwa, które korelują tylko z zachowaniem białka w wysoce sztucznym środowisku, często przy użyciu oczyszczonych rekombinująco wyrażonych białek docelowych.

P: Czy CETSA® może być stosowany do badań analizy SAR?

A: nie ma jeszcze opublikowanych przykładów, w których CETSA® została użyta do optymalizacji związków. Jednak potencjał i zastosowanie CETSA® do analizy SAR i potwierdzenia trafienia zostały wyraźnie wykazane przez Shaw et al. przez porównanie danych z testu CETSA® z powszechnie stosowanymi danymi biochemicznymi i komórkowymi (Shaw et al. Doi: 10.1177/2472555218813332). Publikacja pokazuje wartość dodaną CETSA® do badań przesiewowych, potwierdzenia trafień i generowania SAR dla dwóch celów białkowych: B-Raf i PARP1.

typy obiektów/próbek

p: ile obiektów zostało zatwierdzonych do tej pory w CETSA®?

A: W CETSA® HT (większość z nich to Alpha Cetsa® , niektóre z użyciem HTRF) pomyślnie zatwierdzono ponad 30 celów, w tym cele z lokalizacją jądrową, mitochondrialną, cytoplazmatyczną i błoną plazmatyczną.

do tej pory ponad 100 celów zostało zatwierdzonych w CETSA® Classic (Western Blot based detection).

CETSA® m/s generuje informacje dla 6000 do 7000 celów jednocześnie.

P: Czy wszystkie białka docelowe mogą być testowane w CETSA®?

R: niektóre cele są “ślepe” w CETSA® , tzn. Wiązanie złożone nie zmieni ich stabilności termicznej. Może się to zdarzyć, gdy białko ma wiele domen, a Związek wiąże się tylko z jedną domeną, a stabilizacja tej pojedynczej domeny nie wpływa globalnie na stabilność termiczną całego białka. Istnieje kilka białek, które nie topią się w typowym zakresie temperatur, stosowanych w eksperymentach CETSA®.

Pelago ma dostęp do dużej bazy danych z danymi dotyczącymi stabilności termicznej z projektów z odczytem spektrometrycznym mas (CETSA® MS), a informacje te są brane pod uwagę, gdy Pelago ocenia “bility cetsa®” docelowego białka przed opracowaniem testu alfa CETSA®. Prosimy o kontakt z Pelago w celu uzyskania takich informacji.

P: Czy GPCR są podatne na CETSA® ?

A: kilka przykładów GPCR zostało przetestowanych w CETSA® . W niedawnej publikacji Astra Zeneca (Kawatkar et al Chem Biology 2019) ustanowiono testy CETSA® Classics dla zestawu białek związanych z błoną, w tym celu białka GPCR. Jednym z potencjalnych wyzwań związanych z zastosowaniem CETSA® w leczeniu GPCR może być ograniczona dostępność przeciwciał do wykrycia. Ponadto integralna lokalizacja membrany Gprc może prowadzić do nieprzewidywalnych zachowań topnienia.

P: Jaki rodzaj próbek można przetestować w CETSA®?

A : Istnieją przykłady testów CETSA® wykorzystujących wiele różnych typów matryc, w tym uwiecznione linie komórkowe, komórki pierwotne, komórki iPS, PBMC pochodzące od pacjentów, sferoidy, frakcje jądrowe z hodowanych komórek, tkanki poddane działaniu ex vivo, tkanki z badań in vivo na zwierzętach, bakterie, drożdże, danio pręgowany i owady.

P: Czy próbki mogą być zamrożone po etapie ogrzewania?

A: jest to możliwe, jednak wymaga walidacji w każdym przypadku, ponieważ proces zamrażania może denaturować niektóre białka.

P: moje komórki potrzebują powłoki płytki hodowlanej z niektórymi białkami (np. kolagen lub Matrigel); czy należy zachować szczególną ostrożność, aby uniknąć przygotowania próbki?

A: nie napotkaliśmy żadnych problemów z komórkami hodowanymi na powlekanych płytach.

Warunki testu Cetsa®

P: Jakie są typowe punkty optymalizacji testu Alpha cetsa®?

A: jeśli zaczynając od zera, test immunologiczny musi być najpierw opracowany i zoptymalizowany. Jest to ważne i warte zainwestowania w opracowanie bardzo czułego testu alfa, ponieważ pozwoli to zmniejszyć liczbę komórek na studnię potrzebną w teście CETSA®. Ponieważ test CETSA® niszczy część białka, które należy wykryć, zazwyczaj w teście CETSA® potrzeba więcej komórek / studni w porównaniu do innych testów opartych na komórkach. Należy zapoznać się z przewodnikami Perkinelmera dotyczącymi opracowywania testu alfa, aby dowiedzieć się, jak postępować i uzyskać przydatne wskazówki, oraz z podręcznikami cetsa® toolbox, jeśli używasz podejścia toolbox (anti mouse Ig X anti rabbit IG beads).

następnie punkty optymalizacji testu CETSA® obejmują:

• miareczkowanie gęstości komórek
• dobór buforu do lizy komórek
• czas inkubacji komórek z badanym Związkiem
• Temperatura do inkubacji komórek z badanym Związkiem
• ustalanie krzywych stopu i przesunięcia
• dobór temperatury do eksperymentów z dawką izotermiczną 4259>
• ustawienia przepływu pracy i automatyzacji

P: Dlaczego dostępne są różne bufory lizy komórek cetsa® i jaki jest wpływ stosowania różnych buforów lizy komórek?

A: Bufor lizy jest ważny w odniesieniu do kilku aspektów testu. Jego rola jest wieloraka: lizowanie komórek i potencjalnie uwolnienie białka docelowego od białek partnerskich, które mogą zakłócać rozpoznawanie przeciwciał, w celu udostępnienia celu do wykrycia przez przeciwciała; stabilizacja białka docelowego w celu ustabilizowania testu; unikanie lub minimalizowanie potencjalnego efektu epiturbancji; zapewnienie odpowiednich warunków fizykochemicznych (pH, Siła jonowa i charakter soli, rodzaj detergentu i stężenie,…) dla testu immunologicznego, … ponieważ różne testy immunologiczne mogą mieć różne optymalne warunki, a różne cele białkowe i różne typy komórek mogą mieć różne wymagania dla optymalnej wydajności testu, udostępniamy 5 różnych buforów do lizy komórek. Zapewniają one różne warunki lizy komórek. Nie oznacza to jednak, że dodatkowe składniki mogą być dodawane w szczególnych przypadkach, takich jak dodatkowe rodzaje detergentów, w celu poprawy dalszej skuteczności testu.

P: czy w buforach lizy komórek CETSA® są inhibitory proteazy?

A: bufory lizy komórek CETSA® 1, 4 i 5 zawierają pewne chelatory kationów dwuwartościowych, które powinny hamować proteazy wymagające takich dwuwartościowych kationów do swojej aktywności (na przykład metaloproteinazy matrycowe). Poza tym, żadne inne inhibitory proteazy nie są włączone do buforów lizy komórek CETSA®, ponieważ na ogół nie są one potrzebne do wykonywania testów alfa CETSA®. Jednak w przypadku określonych typów komórek lub próbek tkanek można dodać typowe inhibitory proteinazy, takie jak leupeptyna.

P: Jakie są typowe temperatury topnienia?

A: temperatura topnienia (Tm) jest zdefiniowana jako temperatura, w której połowa populacji docelowego białka została skażona (tj. w Alpha CETSA®, w której połowa sygnału Alfa została utracona). W zależności od celu temperatura topnienia wynosi najczęściej od 40 ° C do 60°C, a średnia temperatura topnienia wynosi 52°C. niektóre białka, takie jak białka związane z błoną, są zwykle bardziej stabilne i mogą mieć wyższą temperaturę topnienia. Dane z testu CETSA® dla białek o temperaturze topnienia powyżej 65°C mogą mieć wpływ na fakt, że przepuszczalność błony i integralność komórek są zaburzone podczas podgrzewania komórek, co wpływa na fizjologiczne znaczenie testu.

z naszego doświadczenia wynika, że temperatura topnienia jest specyficzna dla celu i zależy od matrycy testowej i użytego bufora lizy.

P: czy oczekuje się, że TM będzie taki sam podczas pracy z nienaruszonymi komórkami i uszkodzonymi komórkami?

A: niekoniecznie, jak podczas zakłócania komórek, interakcje białko-białko, które stabilizują białka, mogą zostać utracone, co może prowadzić do zmiany temperatury topnienia w porównaniu do nienaruszonych komórek. Przykład: dane testu Alpha CETSA® MEK1.

P: jaką temperaturę ogrzewania powinienem wybrać do testowania związków?

A: W przypadku związków stabilizujących zaleca się wybór najniższej temperatury z największym oknem testowym, ponieważ oczekuje się, że będzie to najbardziej czułe badanie (niższe wartości EC50). W przypadku związków destabilizujących zaleca się wybór najwyższej temperatury z największym oknem testowym. Temperatury powyżej 65°C mogą mieć wpływ na przepuszczalność komórek i zmniejszać znaczenie danych.

P: Czy powinienem oczekiwać takiej samej temperatury topnienia w CETSA ® Classic (Western Blot)I Alpha Cetsa®?

Odp: niekoniecznie: pozorna temperatura topnienia może się różnić w obu metodach, ponieważ metody wykrywania są różne.

P: czy ważne jest, aby mieć ścisłą kontrolę czasu nagrzewania próbki?

A: tak jest to niezwykle ważne, aby kontrolować, ponieważ dłuższe czasy nagrzewania mogą skutkować przesunięciem krzywej dawka-odpowiedź w prawo (patrz poniżej komentarze dotyczące czasu przebywania). Standardowy czas nagrzewania wynosi 3 minuty.

związki o krótkim czasie przebywania (tj. wysoka Stała szybkości dysocjacji koff; czas przebywania t równy 1/koff) będzie szybciej dysocjować od celu, gdy jest ogrzewany, w porównaniu do związków o długim czasie przebywania. Z tego powodu oczekuje się, że wartość EC50 lub ITDRF50 będzie rosła wraz ze wzrostem czasu nagrzewania. Więcej wyjaśnień na temat teorii CETSA ® można znaleźć w Seashore-Ludlow B, Axelsson H, Almqvist H, Dahlgren B, Jonsson m, Lundbäck T. (2018) ilościowa interpretacja wewnątrzkomórkowego wiązania leków i kinetyki z wykorzystaniem komórkowego testu przesunięcia termicznego. Biochemistry 57: 6715-6725. https://dx.doi.org/10.1021/acs.biochem.8b01057. Teoretycznie możliwe jest wykrywanie różnych czasów przebywania związków w celu, przy różnym czasie nagrzewania, ale nie ma jeszcze opublikowanych raportów na ten temat.

P: Instrukcja zaleca chłodzenie na lodzie lub przez 3 minuty w temperaturze 25°c po szoku cieplnym. Czy ten etap chłodzenia jest ważny i czy ważna jest ścisła kontrola czasu chłodzenia?

A: Szybkie Chłodzenie próbki zapewnia dobrą kontrolę fazy szoku cieplnego. Samo umożliwienie chłodzenia temperatury bez pomocy z pewnością spowodowałoby różne szybkości chłodzenia w różnych odwiertach i wpłynęłoby na ilość szoku cieplnego dostarczanego do systemu. Faza chłodzenia nie jest tak krytyczna jak Faza ogrzewania, ale powinna być prowadzona szybko i konsekwentnie.

P: Czy Mogę użyć zestawów PerkinElmer “Biomarker” i “SureFire” (non-cetsa® ) do wykonania testu Cetsa®?

A: teoretycznie każdy test białka całkowitego może być odpowiedni do zastosowania w protokole CETSA®, chociaż każdy system musi być zoptymalizowany i zwalidowany. Jednak metoda CETSA® jest opatentowana i potrzebne będzie pozwolenie od Pelago Bioscience. Ponadto firma PerkinElmer wspiera jedynie użycie wyznaczonych zestawów docelowych. Korzystanie z zestawu narzędzi jest wspierane przez Pelago Bioscience i jest dostępne tylko dla posiadaczy licencji.

P: czy można odczytać sygnał Alfa bezpośrednio z płytki PCR używanej do podgrzewania próbek?

R: Zapewniłoby to korzyści pod względem liczby etapów pipetowania, zużycia próbki i łatwości automatyzacji, ale możliwość zastosowania płytek PCR do pełnego procesu – od obróbki próbki do wykrywania – nie jest jeszcze zademonstrowana. Płyty PCR są często bardzo elastyczne, co prowadzi do niejednolitego sygnału nad płytą lub nie mają odpowiednich wymiarów, aby umożliwić ich obsługę przez czytniki płyt. W takich płytach PCR problemem może być również rozmowa między studniami a studniami.

P: czy zamiast ciepła można stosować denaturację chemiczną (np. przy użyciu mocznika lub guanidyny)?

A: Zaletą stosowania temperatury do dostarczania szoku cieplnego jest to, że odbywa się to w wysoce kontrolowany sposób, który może być stały między próbkami i ograniczony w dobrze kontrolowanych ramach czasowych. Chemiczny proces denaturacji może działać w oczyszczonym ekstrakcie białkowym; ale w złożonym środowisku komórkowym, zmiany w objętości komórek, zdolności buforowania, zawartości lipidów itp.mogą oznaczać, że różne linie komórkowe wykazują różne cechy denaturacji dla danego białka.

ponieważ denaturacja (czas nagrzewania) jest krytyczna, może to być dość trudne do kontrolowania przy użyciu denaturacji chemicznej. Ponadto ciepło może być stosowane bez zakłócania komórek, co pozwala na testowanie w rzeczywistym kontekście komórkowym. Nie byłoby to w przypadku denaturacji chemicznej, ponieważ komórki musiałyby zostać zakłócone, aby umożliwić docelowy dostęp do środka denaturatującego, a tym samym utratę stężeń wewnątrzkomórkowych, związków białkowych itp.. Dlatego nie zalecamy zastępowania szoku cieplnego przez denaturację chemiczną.

test immunologiczny Alfa CETSA®

Q: Czy przy opracowywaniu testu CETSA® potrzebne są przeciwciała monoklonalne lub czy można stosować również przeciwciała poliklonalne?

A: można stosować zarówno przeciwciała monoklonalne, jak i poliklonalne, w zależności od jakości przeciwciał. Przeciwciała monoklonalne stanowią przewagę pod względem stabilnego dostarczania odczynnika, podobnie jak w przypadku każdej innej metody wykrywania wykorzystującej przeciwciała.

P: czy przy stosowaniu przeciwciał poliklonalnych następna partia będzie działać w ten sam sposób w teście CETSA®?

A: Z naszego doświadczenia nigdy nie mieliśmy do czynienia z sytuacją, w której następna partia przeciwciała poliklonalnego zachowywała się inaczej w teście CETSA® w porównaniu do poprzednich partii. Jednakże test CETSA® musi zostać ponownie zwalidowany z kolejną partią przeciwciała poliklonalnego.

P: Czy istnieją inne zalecenia dotyczące doboru przeciwciał?

A: jeśli dostępne, przeciwciała powinny być tak dobrane, aby pokrywały różne epitopy białka docelowego,aby zmaksymalizować szanse na znalezienie odpowiedniej pary przeciwciał, która będzie działać w teście Alpha CETSA®.

preferowane są pary przeciwciał dające bardziej strome krzywe (wyższe zbocze wzgórza) i mniej tła, ponieważ zwykle dostarczają one bardziej specyficzny sygnał. Niskie zbocze wzgórza może być oznaką zdolności pary przeciwciał do rozpoznawania ponownie złożonego białka.

P: czy przeciwciała Alpha cetsa® są skierowane tylko przeciwko endogennemu białku docelowemu, czy też endogennemu białkowi docelowemu plus wiąże się z małą cząsteczką?

A: opierając się na zestawach opracowanych do tej pory, przeciwciała są skierowane wyłącznie przeciwko celowi białkowemu.

Q: Czy mogę oczekiwać, że powinowactwo przeciwciała wykrywającego będzie różne między małą cząsteczką związaną i niezwiązaną z białkiem docelowym?

A: małe cząsteczki wpływające na fałdowanie białek w miejscach epitopów są rzeczywiście narażone na zmianę wiązania przeciwciał. Zjawisko to nazywa się ” epiturbancją “i może być ograniczeniem przeciwciał opartych na cetsa®. Epiturbancja na ogół nie jest obserwowana w formacie testu Cetsa® Classic (Western Blotting), ponieważ w tym przypadku białko jest całkowicie denaturowane przed etapem wykrywania przeciwciał.

P: Czy Można używać tylko IgG z zestawami narzędzi cetsa® toolbox?

A: Rzeczywiście, przeciwciała na koralikach anty-króliczych i anty-mysich są specyficzne dla IgG i nie rozpoznają innych klas przeciwciał (tj. nie należy wybierać IgA, IgM itp.).

P: czy jest jakaś zaleta w stosowaniu Alpha CETSA® w porównaniu do CETSA® Classic (Western Blotting)?

A: poza większą czułością testu Alpha CETSA® oraz względami przepustowości i automatyzacji, ze względu na możliwe trudności w analizie białek błonowych w metodzie Cetsa® Classic, Alpha Cetsa® może działać lepiej dla takich celów, ponieważ nie wymaga żadnego etapu oddzielania.

Analiza i interpretacja danych CETSA®

P: Jakie fałszywe trafienia można uzyskać w CETSA®?

A: stabilność termiczna niektórych białek może mieć wpływ po obróbce związku, nawet jeśli nie są one bezpośrednio związane przez badany związek. Te pośrednie efekty mogą być wynikiem np. fosforylacji białek, rekrutacji białek przez białko partnera lub ogólnej zmiany stanu redoks komórki. Przeprowadzenie testu CETSA® równolegle na nienaruszonych komórkach i na uszkodzonych komórkach może rozróżniać efekty bezpośrednie i pośrednie, ponieważ takie pośrednie efekty nie są spodziewane, gdy komórki są zaburzone i procesy metaboliczne są zatrzymane.

w Alpha CETSA® można napotkać interferencję testu związku, ponieważ związki są obecne na etapie wykrywania przy stosunkowo wysokim stężeniu. Może to dać mylące wyniki i ważne jest, aby wykonać ekran licznika w celu identyfikacji tych związków.

P: Jak można interpretować destabilizację celu?

A: Destabilizacja może wynikać z zakłócenia wiązania związku kompleksu białkowego, który stabilizował białko docelowe. Z naszego doświadczenia wynika, że białka błonowe mają zazwyczaj wyższą temperaturę topnienia i są raczej destabilizowane niż stabilizowane przez wiązanie związków. W przypadku kinaz może to również wynikać z wypierania ATP. W takim przypadku przydatne może być porównanie wyników testów CETSA® wykonanych na nienaruszonych komórkach (fizjologiczne stężenia ATP) i uszkodzonych komórkach (utrata ATP). W przypadku niektórych celów (patrz instrukcja ErbB2 Alpha cetsa® kit) zaobserwowaliśmy, że nieodwracalne inhibitory destabilizowały cel, podczas gdy odwracalny inhibitor stabilizował cel.

P: czy istnieje sposób na uniknięcie efektu epiturbancji?

a: dodanie niewielkiej ilości detergentu, takiego jak 0,01% SDS, może zapobiec zjawisku epiturbancji. Wytłumaczeniem może być to, że SDS zapewnia dostęp do przeciwciała nawet w obecności związku. Niektóre bufory do lizy komórek CETSA® zawierają niewielką ilość SDS i dlatego mogą uniknąć epiturbancji w stosunku do innych buforów do lizy. Nie możemy wykluczyć, że w niektórych przypadkach konieczne może być dodanie większej liczby kart SDS.

należy zauważyć, że taki efekt epiturbancji nie jest ograniczony do testów CETSA®, ale można go również spotkać w każdym badaniu immunologicznym.

Q: Counter-screen / Jak sprawdzić, czy mój wynik cetsa® jest fałszywy?

A: w CETSA® istnieje prosta metoda pozwalająca określić, czy związek działa na samą stabilizację białka docelowego (de), czy też ingeruje w metodę wykrywania: można porównać między (1) dodawaniem związków do komórek, a następnie inkubacją i obróbką cieplną oraz (2) ogrzewaniem komórek najpierw i dodawaniem związku dopiero po. Jeśli aktywność związku znajduje się tylko w teście 1, to jest on naprawdę aktywny w celu. Jeśli aktywność związku znajduje się w 1 i 2, to pokazuje, że zakłóca ona w jakiś sposób technologię wykrywania (patrz Przewodnik interakcji białko-białko Perkinelmera dla listy potencjalnych zakłóceń Alfa).

P: Jakie fałszywie negatywne trafienia można uzyskać w CETSA®?

A: Jeśli związek nie osiąga celu w kontekście komórkowym, może wyglądać dodatnio w testach biochemicznych i nadal być ujemny w CETSA® . Nie jest to fałszywie ujemny, ale po prostu odzwierciedlający fakt, że związek nie jest w stanie uzyskać dostępu do celu w rzeczywistych warunkach komórkowych, co jest częścią mocy metody.

P: Jak porównać wartości CETSA® z testami funkcjonalnymi / czy istnieje znaczenie amplitudy thermoshift?

A: Analizując dane CETSA®, należy pamiętać, że zasada testu jest zupełnie inna niż typowych testów funkcjonalnych, takich jak patrząc na fosforylację białek, stężenia jonów, cAMP i inne markery transdukcji sygnału lub analizę fenotypową w Przesiewaniu o wysokiej zawartości, a zatem dane muszą być odpowiednio interpretowane.

Amplituda termociągu nie jest miarą powinowactwa związku.

wartości EC50 lub ITDRF50 są specyficzne dla pewnych warunków badania (temperatura, czas ogrzewania, …). Nie różni się to od testów funkcjonalnych, gdzie wartości EC50 są na przykład specyficzne dla czasów stymulacji.

P: czy w testach CETSA® można odróżnić antagonistów od agonistów?

A: zwykle nie jest to informacja wydobywana z testów CETSA®, ale publikacja z Shaw et al. | Align = “center” | 2,41598-017-18650-x. doniesienia, że tylko agoniści byli w stanie ustabilizować receptor androgenowy w teście cetsa®, podczas gdy antagonista nie miał bezpośredniego wpływu w teście cetsa®, ale mógł być wykryty jako konkurent działania agonistów w teście cetsa®. Dlatego w tym konkretnym przypadku test CETSA® był w stanie rozróżnić agonistów i antagonistów receptora androgenowego. Nie oznacza to, że jest to możliwe dla każdego celu, ponieważ istnieje wiele przykładów, w których test CETSA® bezpośrednio wykrywa zarówno agonistów, jak i antagonistów.

Q: Czy CETSA® może być stosowany do wykrywania toksyczności związku?

a: oczekuje się, że związki wywierające pewien toksyczny wpływ na komórkę doprowadzą do zmiany poziomu niektórych białek (poprzez degradację i/lub efekty transkrypcyjne) oraz do zmian termostabilności niektórych białek (poprzez modyfikacje potranslacyjne lub ogólną zmianę stanu redoks komórek). Pelago bada możliwość generowania ” odcisków palców CETSA®”, które mogą być powiązane z różnymi rodzajami toksyczności, z danych CETSA® MS. Może to również generować wiedzę na temat celów, których leki nie powinny osiągać, aby uniknąć takiej toksyczności. Jeśli konkretny cel wydaje się być związany z toksycznością, zastosowanie Alpha CETSA® może stać się metodą z wyboru dla przemysłu farmaceutycznego.

P: Czy do normalizacji testów CETSA® można użyć białka domowego?

A: normalizacja zazwyczaj nie jest potrzebna w testach CETSA®, ponieważ ważnym wynikiem testu jest wartość EC50. Jednak w niektórych przypadkach, na przykład podczas pracy z próbkami tkanek, ilość materiału zaangażowanego w jeden punkt danych może się znacznie różnić i może być pożądana normalizacja. W CETSA® Classic (Western blotting) SOD1 jest powszechnie stosowany jako jego temperatura topnienia 80°C sprawia, że jest dobrym niezmiennym punktem odniesienia dla każdego celu, a jego masa cząsteczkowa 18 kDa ułatwia wykrycie na zachodnich plamach. GAPDH nie jest zalecany ze względu na niższą temperaturę topnienia (55 °C), co uniemożliwia kontrolę celów o wyższej temperaturze topnienia.

jeśli chcesz znormalizować test Alpha CETSA®, można spróbować kofilin (istnieje AlphaLISA SureFire ultra kit dla całkowitej kofiliny, ze wstępnymi danymi CETSA®, ale nie ma jeszcze w pełni zatwierdzonego zestawu)