białko złącza Gap Connexin-43 jest bezpośrednim regulatorem transkrypcji N-cadherin in vivo

manipulacja zarodkiem

dorosły X. laevis utrzymywano w temperaturze 17 °C i stosowano zgodnie z przepisami jednostki służby biologicznej na University College London, zgodnie z wytycznymi brytyjskiego Home Office ustanowionymi w Animals Act 1986 jako 45. Zarodki X. laevis otrzymano i wystawiono zgodnie z wcześniejszymi opisami46,47. W celu specyficznego ukierunkowania na grzebień nerwowy, zarodki wstrzykiwano do blastomerów brzusznych zwierząt w stadium ośmiokomórkowym po jednej stronie dla wszystkich eksperymentów, z wyjątkiem przypadków, gdy stosowano lizaty zarodkowe. W tym przypadku zarodki były wstrzykiwane po obu stronach zwierzęcych zarodków w stadium dwukomórkowym. Mikroiniekcje zarodka przeprowadzono zgodnie z 48. W razie potrzeby jako znaczniki stosowano fluoresceinę-dekstran (FDX; Invitrogen, D1821, 20 ng) lub rodaminę-dekstran (RDX; Invitrogen, D1824, 20 ng). Oligomorpholinos przeciwko X. laevis Cx43 (Cx43MO1; 8-24 ng, 5 ‘- TTCCTAAGGCACTCCAGTCACCCAT-3′, Cx43MO2; 8-24 ng, 5′-aaaaatggtttcttgtggtcga-3′) i BTF3 (BTF3MO, 40 ng, 5′- aacggacggtttaaggcttcct-3′) zostały zsyntetyzowane i dostarczone przez Gene Tools LLC. Zastosowano równomolowe stężenia standardowego morfolino kontrolnego (CTLMO: 3′-ATATTTAACATTGACTCCATTCTCC-5’). Ilości morfolinos odpowiadają ilościom wstrzykniętym po jednej stronie zarodków w stadium ośmiokomórkowym, podczas gdy druga strona była używana jako kontrola wewnętrzna. Gdy zarodki były używane do pobierania lizatów zarodkowych, wstrzykiwano je w fazie dwukomórkowej w obu blastomerach zwierzęcych i stosowano podwójne z wymienionych dawek. Aby przetestować skuteczność Cx43MOs na endogennym mRNA cx43, wykonaliśmy analizę western blot. Oba Cx43MOs skutecznie obniżały poziom białka endogennego Cx43FL i Cx43iso (Fig. 3a, b). W celu potwierdzenia skuteczności BTF3MO, przetestowaliśmy przez immunostaining komórek grzebienia nerwowego ekspresję białka BTF3, która wykazała zmniejszony poziom btf3 w komórkach BTF3MO w porównaniu do ctlmo(Fig. 3A).

przeprowadzono hybrydyzację In situ,jak opisano poprzednio49, 50. Krótko mówiąc, zarodki utrwalano w MEMPFA, a następnie przez noc hybrydyzowano z sondami znakowanymi digoksygeniną, inkubowano z przeciwciałem AP, a aktywność AP rozwijano przy użyciu substratów NBT / BCP. Sondy RNA znakowane digoksygeniną przygotowano dla ślimaka foxd348251, twist52, N-cadherin53, C353, btf3 (Xenbase: XL075i22) i sox1054, sox954. C3 (1 µg/ml), snail2 (0,8 µg/ml), foxD3 (2 µg/ml), sox10 (1 µg/ml), sox9 (1 µg/ml) i twist (0,7 µg/ml) wykorzystano do oceny indukcji grzebienia nerwowego, twist (0.7 µg/ml) do migracji grzebienia nerwowego, N-cadherin (1 µg/mL) do oceny poziomów ekspresji i wzór ekspresji btf3 (0,7 µg/mL). Immunostaining w całości przeprowadzono jak poprzednio opisano55 przy użyciu przeciwciała Cx43 (1: 1000, Sigma, C6219). Krótko mówiąc, zarodki utrwalano w MEPMFA i inkubowano przez noc z przeciwciałem w opisanym rozcieńczeniu.

wybuchy czapek zwierzęcych rozcięto z Xenopus blastulas (etap 8) przy użyciu standardowej techniki48,56 i przygotowano do hybrydyzacji in situ, jak opisano powyżej. W przypadku testów na czapce zwierzęcej, 500 PG mRNA wstrzyknięto do strony zwierzęcej dwóch blastomerów zarodków w stadium dwukomórkowym. Analizę ISH przeprowadzono na 20-25 zarodkach na warunek dla każdego niezależnego eksperymentu.

manipulacja i obrazowanie grzebienia neuronowego

przeszczepy grzebienia neuronowego przeprowadzono zgodnie z wcześniejszymi zgłoszeniami57. Krótko mówiąc, grzebień nerwowy pobrany z etapu 18 fluorescencyjnie oznakowane zarodki zostały rozcięte nożami do brwi i wszczepione do nieoznakowanych zarodków gospodarza. Do eksperymentów in vitro eksplantowane grzebienie nerwowe czaszki rozcięto na etapie 18 przy użyciu standardowej techniki58, 59 i pokryto płytkami powlekanymi fibronektyną (Sigma, F1141), jak opisano poprzednio53. W przypadku testów na pojedyncze komórki komórki grzebienia nerwowego krótko dysocjowano w wolnym od Ca2+/Mg2+medium Danilchick53. Dla każdego warunku, dziesięć zarodków przeszczepione fluorescencyjne znakowane NC analizowano na eksperyment.

Immunostacjonowanie przeprowadzono na eksplantach grzebienia neuronowego, jak poprzednio opisane54, stosując anty-N-cadherin (1:50, rat IgG, Clone MNCD2, DSHB), anty-e-cadherin (1:250, mouse IgG, clone 5D3, DSHB), anti-BTF3 (1:100, Abcam, ab107213), anti-rabbit IgG Alexa488 (1:500, Invitrogen, A11034) and anti-rat IgG Alexa488 (1:500, LifeTechnologies). When required, 4′,6- diamidino-2-phenylindole (DAPI; 1 μg/mL, Sigma, D9542) and/or phalloidin tetramethylrhodamin-b-isothiocyanate (PhR; 1 μg/mL, Sigma, P1951) were used.

Imaging of fixed embryos was performed using a MZFLIII Leica fluorescence stereomicroscope equipped with a DFC420 Leica camera controlled by Leica IM50 software. Obrazowanie migracji grzebienia neuronowego in vitro przeprowadzono przy użyciu kinematografii poklatkowej, jak opisano poprzednio53, 60. Krótko mówiąc, komórki grzebienia nerwowego hodowano w plastikowych lub szklanych płytkach Petriego pokrytych fibronektyną, a mikrokopię poklatkową rozpoczęto po godzinie hodowli in vitro. Do ruchliwości i migracji komórek wykorzystano mikroskopy złożone (mikroskop Nikon Eclipse 80i z aparatem cyfrowym Hamamatsu lub mikroskop Leica DMRXA2 z aparatem cyfrowym Hamamatsu sterowany prostym programem PCI) wyposażone w zmotoryzowane stopnie i suchy obiektyw 10×/0,30 NA. Kultury NC przygotowano w sposób opisany powyżej. Obrazy uzyskiwano co 5 minut przez okres 12 godzin. do obrazowania morfologii komórek użyto mikroskopu TCS SP8 z soczewkami zanurzeniowymi 63 × /0,90 NA i sterowanymi przez oprogramowanie LAS–AF. Ogniwa stałe zostały zobrazowane przy użyciu obiektywu zanurzeniowego oleju 63 × / 1,4 NA i mikroskopu konfokalnego Leica TCS SPE kontrolowanego przez oprogramowanie LAS–AF.

dla lokalizacji konstrukcji lub endogennych poziomów IF, analizowano 10-15 NCC dla każdego warunku na eksperyment.

analiza migracji komórek i morfologii komórek

test chemotaksji przeprowadzono zgodnie ze standardową procedurą 61 z użyciem akrylowych kulek heparyny (Sigma, H5263) pokrytych 1 µg/mL oczyszczonym ludzkim czynnikiem pochodzącym z komórek zrębowych-1 (Sigma, SRP3276). Ruchliwość komórek i chemotaksję analizowano za pomocą narzędzi do analizy ImageJ (https://imagej.nih.gov), jak opisano poprzednio53,60. Krótko mówiąc, każda pojedyncza komórka była ręcznie śledzona za pomocą wtyczki śledzenia ręcznego ImageJ, dane zostały zebrane i przeanalizowane za pomocą wtyczki Chemotaxis ImageJ. Morfologię komórek oceniano przez zastosowanie wskaźnika Circular index (complete circle = 1) i oszacowano za pomocą narzędzi do analizy ImageJ. Dyspersję komórek analizowano za pomocą algorytmu triangulacji Delaunaya (wtyczki ImageJ) i wykreślano jako średni obszar trójkąta, jak opisano poprzednio54. Obszar występujący komórki analizowano w komórkach grzebienia nerwowego na krawędzi eksplantu mierzącego obszar wyrastający z dwóch kolejnych ram czasowych z 4-minutowym interwałem czasowym; te dwie kolejne ramki odejmowano w celu wygenerowania nowego obszaru12. Do analizy chemotaksji komórek i dyspersji komórek analizowano 10-15 wybuchów na warunek dla każdego niezależnego eksperymentu. W odniesieniu do ruchliwości komórek, morfologii komórek i występów komórek analizowano 15-25 NCC na warunek na eksperyment.

biologia molekularna, plazmidy i odczynniki

do syntezy cDNA, całkowity RNA wyizolowano z 10-15 zarodków etap 23-24 lub 10-15 czapek zwierzęcych etap 8 z X. laevis na warunek dla każdego niezależnego eksperymentu i zastosowano trzy techniczne repliki w każdym eksperymentie25. Quantitative PCR (qPCR) was performed on an Applied Biosystems ABI 7900HT machine using the Fast SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems, 4385612) and the following primers: ef-1 forward 5′- ACCCTCCTCTTGGTCGTTT-3′, ef-1 reverse 5′-TTTGGTTTTCGCTGCTTTCT-3′15, ncad forward 5′-CAGGGACCAGTTGAAGCACT-3′, ncad reverse 5′-TGCCGTGGCCTTAAAGTTAT-3′62. n-cad mRNA expression was plotted as relative expression normalized against the housekeeping gene ef-1.

Plasmids: Cx43 constructs were synthesized using the X. laevis Cx43 sequence from cDNA clone (UniGene ID XL.1109) jako szablon. Cx43 pełnej długości (cx43fl, aa 1-379), cx43 carboxy terminally truncated construct (cx43trunc, aa 1-212) i cx43-20K construct (cx43tail, aa 213-379) sklonowano do 5 ‘Amhi/3’ Xhoi wektorów pCS2+ lub pCS2-EGFP. Wektor pCS2-EGFP został uprzejmie dostarczony przez dr Masa Tada. Indukowalna konstrukcja Cx43Tail została przygotowana przez połączenie cx43-20ktail (aa 219-379) z domeną wiążącą ligand ludzki GR (aa 512-777). Cx43-20K został sklonowany do 5 ‘Ecori/3’ Saci i GR do 5 ‘Saci/3’ XHOI pCS2+ i pCS2-EGFP. Konstrukty BTF3 zostały zsyntetyzowane przy użyciu X. Sekwencja laevisa z klonu cDNA (UniGene ID XL. 3536). BTF3FL (aa 1-162)został sklonowany do 5 ‘Ecori/3’ Xhoi pCS2+ lub pCS2-EGFP. Btf3 deletion construct pozbawiony regionu NLS RRKKK (btf3-dNLS, aa 1-158) został sklonowany do 5 ‘Amhi/3’ Clai pCS2+. Dla eksperymentów BiFC (rys. 4b, c), Cx43Tail i Cx43Trunc zostały sklonowane do 5 ‘Amhi/3’ Amhi pCS2-VC155. BTF3FL klonował w 5 ‘Amhi/3’ Amhi pCS2-VN9m. bifc wektory uprzejmie prof James C. Smith. Wszystkie sekwencje konstruktów są weryfikowane przez automatyczne sekwencjonowanie DNA (Source Biosciences, UK). When required, plasmids were linearized and mRNA transcribed as described before25, using sp6MessageMachine (Ambion). The mRNA constructs injected were: membrane GFP (mGFP, 300 pg), membraneRFP (mRFP, 300 pg) nuclearRFP (nRFP, 300 pg), lifeactin-GFP (400 pg), N-cadherin-GFP (500 pg), Cx43FL (500 pg), Cx43Trunc (500 pg), Cx43-20k (500 pg), BTF3FL (500 pg), BTF3-dNLS (500 pg), Cx43-20k-VC (500 pg), Cx43Trunc-VC (500 pg), and BTF3-VN9m (500 pg). The following plasmids were injected as DNA: pcDNA3.2-Cx43-HA (800 pg/embryo,22); pcDNA3.2-Cx43-ML-HA (800 pg/embryo;22); ΔΜ213 Cx43 (800 pg/zarodek,63).

wszystkie analizy na konstrukcjach fluorescencyjnych oceniono przez normalizację do fluorescencji tła i, gdy jest to wymagane, do fluorescencji całkowitej powierzchni komórki.

zastosowano następujące odczynniki: kwas flufenamowy (50 µM dla inkubacji NC explant −100µm dla leczenia zarodków, Sigma, F9005), kwas meklofenamowy (50 µM dla inkubacji NC explant −100µm dla leczenia zarodków, Sigma, M4531), aktynomycynę D (20 µM, Sigma, A1410), CHX (10 µM, Sigma, C7698) i deksametazon rozpuszczony w etanolu (10 µM) dodano do podłoża hodowlanego w etapach 14-15 i utrzymywane aż do stadiów embrionalnych (etap 23). W celu kontrolowania możliwego wycieku indukowanych chimer hodowano siostrzaną partię zarodków bez deksametazonu i przetwarzano w celu hybrydyzacji in situ. Do badania sprzężenia (testing Gap junction channel activity) analizowano 10-15 NCC na warunek na eksperyment.

Immunoprecypitacja, frakcjonowanie i Western blotting

dla każdego warunku 10-15 zarodków użyto do przygotowania lizatów zarodków na eksperyment. Całe zarodki przygotowano Do western blot po homogenizacji w buforze do lizy (20 mM Tris, 100 mM NaCl, 0,01% Triton-X, pH 8,0) z dodatkiem inhibitorów proteazy (Roche, 11836153001)i inhibitorów fosfatazy (Roche, 04906837001) 54,64. W przypadku blotów zachodnich stosowano następujące przeciwciała: Connexin 43 (Sigma, C6219, 1:1000), N-cadherin (DSHB, clone MNCD2, 1:800), E- cadherin (DSHB, clone 5D3, 1:1000), p42/44 MAPK (Cell Signaling, 9102S, 1:2000), α-tubulin (DSHB, clone 12G10, 1:1000), phospho-histone H3 (Millipore, 06579, 1:2000), GFP (Invitrogen, A11122, 1: 2000), HA-tag (Sigma H6908, 1:2000), rabbit IgG HRP-linked (Amersham ECL, NA934, 1:3000), mouse IgG HRP-linked (Amersham ECL, NA931, 1:3000) and rat IgG HRP-linked (Sigma, A9037, 1:2000). Immunoprecipitation was performed using GFP-Trap® kit (Chromotek); krótko, komórki zawieszono w buforze do lizy i odwirowano w temperaturze 20 000×g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, supernatant odzyskano, a objętość skorygowano buforem rozcieńczającym. Kulki wyrównano w buforze rozcieńczającym i zmieszano z wymieszanym lizatem komórkowym. Mieszanka została magnetycznie oczyszczona i przygotowana do Western blot. Izolację frakcji jądrowej zarodków X. laevis przeprowadzono przy użyciu protokołów odwirowywania różnicowego z modyfikacjami64,65. Krótko mówiąc, etap 18 X. laevis zarodki lizuje się przy użyciu igły 22 g i buforu homogenizacyjnego 20 µL (HB: 250 mM sacharozy, 20 mm Hepes, 10 mM KCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM DTT, inhibitory fosfatazy i proteazy) na zarodek. Wszystkie próbki odwirowywano w temperaturze 250×g przez 5 minut w celu usunięcia resztek zarodka. Po zebraniu supernatantu rozprowadzano go do trzech różnych probówek i obracano z trzema różnymi prędkościami (400×g, 600×g) przez 5 minut, aby wyizolować jądra komórkowe. Supernatanty postjądrowe były przechowywane do dalszego przetwarzania. Granulki jądrowe przemyto ponownie w buforze HG i odwirowano z odpowiednią prędkością (400×g, 600×g). Granulki jądrowe następnie zawieszono w 40 µL 10% glicerolu/0,1% SDS/1% Triton-X w HB. Do każdej próbki dodano odpowiednią ilość buforu i próbki poddano obróbce do elektroforezy w żelu akryloamidowym i analizy western blot. W celu uniknięcia błędów ładowania, ta sama membrana została zamazana na kontrolę obciążenia po zdzieraniu, jak opisano wcześniej 54, 64.

dane Western blot analizowano za pomocą narzędzi do analizy ImageJ. Intensywność obrazu została znormalizowana i stosunek białka będącego przedmiotem zainteresowania do kontroli obciążenia (tj., Mapk lub α-tubulina), wykreślano średnie proporcje. Nieobrobione plamy są ujęte jako figury uzupełniające(Fig. 5–7).

Kultury komórkowe

komórki HeLa (Leibniz Institute Collections of Microorganisms and Cell Culture, Dsmz, Niemcy) hodowano w DMEM uzupełnionym 10% surowicą cielęcą płodu (Life Technologies, CA, USA) w temperaturze 37 °C w nawilżonej atmosferze 10% CO2 i transfekowano zgodnie ze wskazaniami przy użyciu Rotifect (Carl Roth, Niemcy) zgodnie z instrukcjami producenta.

zarodkowe fibroblasty Xenopus (XTC, rodzaj prezentu od Ana Losada) hodowano w 67% DMEM/H2O, uzupełniając 10% płodową surowicą cielęcą w temperaturze 25 °C w nawilżonej atmosferze 5% CO2 i transfekowano zgodnie ze wskazaniami za pomocą Viafect (Promega, USA). Plazmidy do transfekcji były zgodne ze wskazaniami i analizowano 10-20 komórek Hela lub XTC dla każdego warunku na eksperyment.

w przypadku eksperymentów siRNA transfekowano kombinację trzech siRNA skierowanych przeciwko BTF3, jak opisano powyżej. Jako sterownik użyto standardowego siRNA (scrambled siRNA od Sigma). Numer katalogowy tych komercyjnych siRNA przeciwko BTF3 to: SASI_Hs01_00124567; SASI_Hs02_00308337; SASI_Hs01_00124566. Komórki pobierano 48 godzin po transfekcji i przetwarzano do eksperymentów qPCR, Western blot lub Immunohistochemestry. Zgodnie z opisem w odpowiednich sekcjach.

wszystkie linie komórkowe zostały zbadane pod kątem zanieczyszczenia mykoplazmą.

immunohistochemizm i barwienie falloidyną

w celu wykrycia białka, komórki ssaków lub eksplanty grzebienia nerwowego utrwalano w 4% formaldehydu w 0,2% PBS-T (PBS + 0,2% Triton X-100) przez 10 minut i blokowano 10% NGS przez 1 godzinę. Pierwotne przeciwciała inkubowano w temperaturze 4 °c w 10% NGS. Zastosowano następujące przeciwciała: 1/100 anty-BTF3 (Abcam, ab107213), 2,5 µg/ml anty-N-cadherin (MNCD2 Developmental Studies Hybridoma Bank) i 1:100 anty-Cx43 (Sigma, C6219) w 10% NGS i inkubowano w 4 °C. Eksplanty przemyto 3 razy PBS + 0,2% Tween-20 i inkubowano w 4 °c z przeciwciałem wtórnym, rozcieńczono w 1:350 w 10% NGS. DAPI rozcieńczono w stosunku 1:1000 i zmieszano z przeciwciałami wtórnymi.

spektrometria Mas

dla współimmunoprecypitacji oznaczonego FLAG Cx43taila do analizy spektrometrycznej mas komórki lizowano i lizaty inkubowano przez noc z anty-HA i zrównoważonymi kulkami o wysokim powinowactwie w temperaturze 4 °C, immunoprecypitaty przemywano i elutowano27. Następnie elucję kwasu 0,1 m glicyną pH 2,5, pH eluatów dostosowano do pH 8,0 z 0,5 m Tris. W przypadku trawienia białek próbki inkubowano przez noc z 2 µg trypsyny (Trypsin Gold, Promega, USA), a następnie dodano 0.1 µg Lys-C (Roche, Niemcy) i inkubację przez dodatkowe 6 godzin. peptydy odsalono na odwróconych końcówkach fazy C-18 (Nest Group, USA), wysuszono w próżni i przechowywano w temperaturze -20 °C do czasu analizy. Wysuszone mieszaniny peptydów odzyskano w 3 µl 30% kwasu mrówkowego i rozcieńczono wodą do 23 µl. Pięć µl trawienia wstrzyknięto do systemu Nano-LC (Eksigent425 2D Nano-LC; Sciex, USA), a peptydy oddzielono metodą chromatografii odwróconej fazy na kolumnach C-18 przygotowanych we własnym zakresie (Reprosil-Pur C18-AQ, 1.9 µm, Dr. Maisch, Niemcy, kolumny Pikofrytowe, 75 µm i.d., New Objctive, USA) w gradiencie liniowym od 100% eluentu A (0,1% kwasu mrówkowego) do 55% eluentu B (60% aktenitrylu, 0,1% kwasu mrówkowego) w ciągu 120 min. Układ LC został skonfigurowany jako wentylowana kolumna, A próbkę obciążono i odsalono przy natężeniu przepływu 400 nl / min, a separację przeprowadzono przy natężeniu przepływu 200 nl / min. System nano-LC został połączony ze spektrometrem mas (Q-Exactive HF, ThermoScientific, Niemcy), który działał w trybie zależnym od danych. Interpretacja danych została przeprowadzona za pomocą Mascot V2.2 (Matrixscience, UK) i Progenesis LC–MS V4.1 (Nonlinear Dynamics, UK). Interpretację danych przeprowadzono za pomocą MaxQuant V1.6.1.0 i Perseus V1.6.1.3 (MPI Biochemia, Niemcy).

Test sprzęgania

łączność wewnątrzkomórkową ze złączem szczeliny badano stosując test sprzęgania barwnika. Tutaj użyto fluorescencyjnego barwnika Calcein-AM (Sigma, 17783). Populację grzebienia neuronowego rozcięto z niezakażonych zarodków inkubowano z Kalceiną barwnikową-AM przez około 10 minut lub do momentu załadowania barwnika do wszystkich komórek. Inną populację grzebienia neuronowego z zarodków wstrzykniętych markerem jądrowym (zastrzyki mRNA nrfp, patrz wyżej) rozcinano oddzielnie. Po dysocjacji obu populacji bez wapnia i magnezu, mieszano je i inkubowano przez 1 godzinę w temperaturze 14 °C w probówce. Po łagodnej wirówce eksplanty grzebienia nerwowego pocięto na kawałki o podobnej wielkości i hodowano jak opisano powyżej, a następnie sfilmowano. Do badania aktywności kanałowej połączeń szczelinowych zastosowano blokery połączeń szczelinowych; kwas meklofenamowy (Sigma, M4531) i kwas flufenamowy (Sigma, F9005). Komunikację komórkową oceniano poprzez oszacowanie stosunku liczby komórek, które wykazują zarówno znaczniki, marker jądrowy i Kalceinę do całkowitej liczby komórek, które mają marker jądrowy.

analiza statystyczna

oszacowanie wielkości próby przeprowadzono zgodnie z wcześniej opublikowanymi pracami i nie zastosowano specjalnej metody statystycznej. Eksperymenty nie były randomizowane, a ze względu na charakter eksperymentów autorzy nie byli zaślepieni na alokację podczas zarówno eksperymentów, jak i analizy wyników. Analizowano tylko żywe zarodki i eksplanty. Do eksperymentów hybrydyzacji in situ nie włączono embrionów, które zostały niewłaściwie wstrzyknięte. Prawidłowa iniekcja była określana poprzez iniekcję znaczników liniowych. Nasze parametry doświadczalne były mierzone losowo po wybraniu żywych i prawidłowo wstrzykniętych zarodków.

porównanie wartości procentowych przeprowadzono przy użyciu tabel awaryjnych66. Normalność zbiorów danych była badana przy użyciu testu Kołmogorowa-Smirnowa, testu D ‘ Agostino i Pearsona oraz testu Shapiro-Wilka przy użyciu Prism6 (GraphPad). Zestawy danych po rozkładzie normalnym porównano z testem t Studenta (dwuogonowe, nierówne wariancje) lub ANOVA z wielokrotnymi porównaniami Dunnetta po teście z użyciem Excela lub Prism6 (GraphPad). Zbiory danych, które nie podążały za rozkładem normalnym, porównano za pomocą testu Manna Whitneya lub nieparametrycznego ANOVA (Kruskal Wallis z wielokrotnymi porównaniami Dunna po teście) za pomocą Excela lub Prism6. Porównania krzyżowe przeprowadzono tylko wtedy, gdy całkowita wartość p ANOVA była mniejsza niż 0,05. We wszystkich legendach rysunkowych N = liczba niezależnych eksperymentów; N = całkowita wielkość próbki.

X. laevis N-cadherin partial promoter identification

aby zidentyfikować podstawowy promotor Xenopus n-CAD, zastosowaliśmy następującą strategię. Podstawowy region promotora z genów N-cadheryny piskląt i ssaków opisano w regionach 5 ‘ – UTR, w pozycji -3000 do -1 bp w odniesieniu do miejsca inicjacji translacji41,67. Korzystając z zasobów projektu genomu X. laevis (https://xenopus.lab.nig.ac.jp/) zidentyfikowaliśmy region 2800 bp w 5 ‘ – UTR genu N-cadheryny X. laevis(dodatkowe rys. 4). Ponieważ nasze dane wskazują, że Cx43Tail, BTF-3 i Pol II tworzą kompleks, używamy elementu tool68 do wyszukiwania potencjalnie aktywnych skrzynek TATA w regionie, który wyizolowaliśmy. Nasza analiza in silico ujawnia region bogaty w TATA box między pozycjami -166 do -618 bp, w stosunku do miejsca rozpoczęcia tłumaczenia (dodatkowe rys. 4). Na koniec projektujemy nakładające się startery, aby wzmocnić fragmenty 200 bp w tym regionie. Sekwencje starterów są wymienione w sekcji chipów, a ich obszary wiązania są wyróżnione na fig. 4.

immunoprecypitacja chromatyny (ChIP)

w przypadku immunoprecypitacji chromatyny (ChiP) zastosowaliśmy standardową procedurę dla zarodków X. laevis69,70. Do każdego niezależnego eksperymentu wykorzystaliśmy dwie techniczne repliki i 250-300 zarodków Xenopus na warunek. Krótko mówiąc, zarodki neurula stages X. laevis były utrwalane przez 15 minut i użyto 3 µg przeciwciała Pol II (Diagenode, c15100055) lub przeciwciała klasy ChIP GFP (Abcam, ab290). Do ekstrakcji DNA posłużyliśmy się standardowym protokółem69, 70. Korzystając z zasobów analizy pierwiastkowej, szukaliśmy domniemanych skrzynek TATA w X. laevis n-cad promoter region (Supplementary Fig. 4). Primers flanking these TATA boxes were designed to analyze ChiP samples by PCR. PCR was performed using the following protocol 95 °C for 30 s, 56 °C for 40 s, and 72 °C for 30 s for 32 cycles. Primers used for ChiP-PCR were:

P5F: 5′-CTTCCAAGAGATGAAGCTCATAT-3′,

P5R: 5′- AACACTCTATATGGCAGATAAC-3′,

P6F: 5′-CCTTTAAATGCATACACTTACC-3′,

P6R: 5′-ACAGAAAAAGCATTTGCTTCCT-3′,

P7F: 5′-CAATCAGATCCTTATATGTCCC-3′,

P7R: 5′ – GCCAAGTTTTCCCTTTGTTGT-3′,

P8F: 5′ – GGAAGCAAATGCTTTTTCTGTC-3′,

P8R: 5 ‘- AGTCTGCTTAGAGACAACG-3 ‘

i ich względne miejsca wiązania przedstawiono na rysunku uzupełniającym. 4B. eksperymenty z chipami oznaczano ilościowo w następujący sposób: uśredniono znormalizowany stosunek intensywności pasma dla każdego warunku i obliczono i wykreślono jako wzbogacenie fałdowe. Intensywność pasma została zarejestrowana za pomocą wtyczki ImageJ gels analysis. Żele rozpakowane pokazano na rysunku uzupełniającym. 7c, d.