Chymotrypsinogen a

C. A. S.: 9035-75-0

reakcja enzymatyczna (obraz zostanie otwarty w nowym oknie)

chymotrypsyna jest endopeptydazą serynową wytwarzaną przez komórki acinarne trzustki. Chymotrypsyna zostaje aktywowana po proteolizie chymotrypsynogenu przez trypsynę. Podczas gdy trypsyna hydrolizuje lizynę i argininę, chymotrypsyna selektywnie rozszczepia wiązania peptydowe utworzone przez pozostałości aromatyczne (tyrozyna, fenyloalanina i tryptofan) (Hedstrom i in. 1992). Dwie dominujące formy chymotrypsyny, a i B, występują w równych ilościach w trzustce bydła. Są to bardzo podobne białka (80% identyczne), ale mają znacząco różne właściwości proteolityczne (Hartley 1964, Meloun et al. 1966, Smillie et al. 1968, oraz Gráf et al. 2004). Poniższe informacje dotyczą przede wszystkim formy a chymotrypsynogenu i chymotrypsyny.

Historia:

na początku XX wieku Vernon zaproponował, że preparaty trzustkowe mogą powodować wewnętrzny aktywator własnych enzymów (Vernon 1901). Vernon ‘ s milk-clotting experiments determined there were conajmniej dwa enzymy present and that one was more stable than the other (Vernon 1902). Pomysł ten nie został jednak powszechnie przyjęty aż do 1934 roku, kiedy Kunitz i Northrop potwierdzili obecność enzymu oprócz trypsyny, nadając mu nazwę chymotrypsyna. Udało im się skrystalizować chymotrypsynę, a także nieaktywny prekursor, chymotrypsynogen (Kunitz i Northrop 1934). W 1938 roku Kunitz wyizolował różne aktywne formy chymotrypsyny, oznaczając je jako alfa, beta i gamma (Kunitz 1938).

na początku lat 40.Fruton i Bergmann dalej badali specyficzność chymotrypsyny, zgłaszając kilka nowych substratów (Fruton i Bergmann 1942). Jacobsen szybko zidentyfikował dodatkowe formy chymotrypsyny, określając je jako delta i pi (Jacobsen 1947). W 1948 Schwert scharakteryzował masę cząsteczkową chymotrypsyny i chymotrypsynogenu.

w 1954 roku Hartley i Kilby przedstawili pierwsze dowody na trójstopniowy mechanizm hydrolizującego amidu chymotrypsyny i estrowych substratów, którzy postawili hipotezę o obecności acylowego enzymu pośredniego, co zostało później udowodnione jako prawdziwe (Henderson 1970). W 1955 Laskowski uzyskał drugi krystaliczny chymotrypsynogen, nadając mu nazwę chymotrypsynogen B. W 1964 Hartley ustalił sekwencję aminokwasową chymotrypsyny A, która została później rafinowana przez Melouna i wsp. w 1966 roku. W 1968, Smillie et al. określono sekwencję aminokwasową chymotrypsyny B, która ujawniła 80% identyczności sekwencji z chymotrypsyną A. w latach 70. i 80. przeprowadzono badania, aby lepiej zrozumieć mechanizm działania i zidentyfikować różnice w sekwencjach aminokwasowych między trypsyną i chymotrypsyną(Steitz i in. 1969, Cohen et al.1981, Asbóth i Polgár 1983 oraz Gráf et al. 1988).

w latach 90.chymotrypsyna została oczyszczona z innych źródeł, w tym z dorsza atlantyckiego (Ásgeirsson i Bjarnason 1991) i wielbłąda (Al-Ajlan i Bailey 1997). Rozpoczęto również prace nad badaniem inhibitorów (Baek et al. 1990) oraz Frigerio et al. wyjaśniono strukturę krystaliczną chymotrypsyny bydlęcej do rozdzielczości 2,0 Å (Frigerio et al. 1992).

ostatnie badania zbadały składanie i denaturację chymotrypsyny w zakresie stężeń (Ghaouar et al. 2010), interakcja chymotrypsyny z substratami nanocząstek (you et al. 2006, oraz Jordan et al. 2009) i zwiększenie stabilności chymotrypsyny poprzez sprzęganie z cząsteczkami PEG (Castellanos et al. 2005, oraz Rodríguez-Martínez et al. 2009).

:

chymotrypsyna jest aktywowana przez rozszczepienie wiązania między argininą a izoleucyną (R15 i i16) przez trypsynę, powodując zmiany strukturalne i tworzenie miejsca wiązania substratu (Sears 2010). Chymotrypsyna różni się od trypsyny tym, że trypsyna rozszczepia peptydy przy resztach argininy i lizyny, podczas gdy chymotrypsyna preferuje duże pozostałości hydrofobowe(Hedstrom et al. 1992). Chymotrypsyna preferencyjnie katalizuje hydrolizę wiązań peptydowych z udziałem l-izomerów tyrozyny, fenyloalaniny i tryptofanu. Łatwo działa również na amidy i estry wrażliwych aminokwasów. Swoistość chymotrypsyny dla dużych pozostałości hydrofobowych można wyjaśnić hydrofobowym wiązaniem S1 POCKED utworzonym przez pozostałości 189 do 195, 214 do 220 i 225 do 228 (Cohen i wsp. 1981).

chociaż struktura miejsca S1 trypsyny i chymotrypsyny wykazuje tylko jedną różnicę (w pozycji 189), ukierunkowana na miejsce mutageneza trypsyny i chymotrypsyny nie dokonała wymiany specyficznych cech, co sugeruje, że mechanizm, dzięki któremu Trypsyna i chymotrypsyna osiągają katalizę specyficzną dla substratu, nie jest w pełni poznany (Steitz et al. 1969, oraz Gráf et al. 1988).

skład:

trzy reszty aminokwasowe triady katalitycznej (H57, D102 i S195) są niezbędne do rozszczepiania wiązań peptydowych i są stabilizowane wiązaniami wodorowymi (Sears 2010, Gráf i in. 2004). G193 i S195 tworzą otwór oksyanionowy i wchodzą w interakcje z grupą karbonylową nożycowego wiązania peptydowego, orientując ją w tetraedryczny związek pośredni (Rühlmann et al. 1973, Huber and Bode 1978 oraz Gráf et al. 2004).

charakterystyka molekularna:

chymotrypsyna A i B mają 80% identyczności sekwencji (Hartley 1964, Meloun et al. 1966, Smillie et al. 1968, oraz Gráf et al. 2004). Aminokwasy triady katalitycznej (H57, D102 i S195) są silnie konserwowane w sekwencjach peptydaz z rodziny S1 (Gráf i in. 2004). Seryna w pozycji 214 jest również silnie zachowana w rodzinie i została zaproponowana jako czwarty członek triady katalitycznej (Ohara et al. 1989, oraz McGrath et al. 1992).

3.3.0):

• Klasa: głównie Beta
• Architektura: beczka Beta
• Topologia: Trypsynopodobna Proteaza Serynowa

Masa cząsteczkowa:

• 25.6 kDa (Wilcox 1970)

optymalne pH: 7,8-8,0 (Rick 1974)

Punkt izoelektryczny:

• 8.52 (Chymotrypsinogen, Theoretical)
• 8.33 (Chymotrypsin, Theoretical)

Extinction Coefficient:

• 51,840 cm-1 M-1 (Theoretical)
• E1%,280 = 20.19 (Chymotrypsinogen, Theoretical)
• E1%,280 = 20.57 (Chymotrypsin, Theoretical)

Active Site Residues:

• Histidine (H57)
• Aspartate (D102)
• Serine (S195)

Activators:

• Cetyltributylammonium bromide (Spreti et al. 2008)
• Dodecyltrimethylammonium bromide (Abuin et al. 2005)
• Hexadecyltrimethylammonium bromide (Celej et al. 2004)
• Tetrabutylammonium bromide (Spreti et al. 2001)

Inhibitors:

• Hydroxymethylpyrroles (Abell and Nabbs 2001)
• Boronic acids (Smoum et al. 2003)
• Courmarin derivatives (Pochet et al. 2000)
• Peptidyl aldehydes (Lesner et al. 2009)
• Peptides from natural sources (Telang et al. 2009, Roussel et al. 2001, and Chopin et al. 2000)
• Peptides containing an unnatural amino acid (Legowska et al. 2009, and Wysocka et al. 2008)

Aplikacje:

• analiza sekwencji
• synteza peptydów
• mapowanie peptydów
• odcisk palca peptydu