Cistron

Biogeneza PTX

pięć podjednostek PTX jest kodowanych przez sąsiadujące ze sobą cistrony w obrębie jednego Operonu policistronicznego , którego ekspresja jest regulowana przez system BvgA/S. Za pomocą tego dwuskładnikowego układu wytwarzanie toksyn może być modulowane przez obecność MgSO4 lub kwasu nikotynowego lub podczas wzrostu w niskich temperaturach (patrz przegląd ). BvgS jest białkiem obejmującym błonę wewnętrzną, wyrażającym wiele aktywności kinaz. W stanie aktywnym aktywuje BvgA poprzez fosforylację. Fosforylowany bvga, cytoplazmatyczny regulator transkrypcji, wiąże się następnie z miejscami operatorskimi regionu promotora genu PTX, gdzie wchodzi w interakcję z polimerazą RNA i aktywuje transkrypcję. Chociaż zidentyfikowano modulatory zakłócające sygnalizację BvgS, nie jest znany żaden ligand BvgS wymagany do uruchomienia sygnalizacji, co sugeruje, że BvgS jest domyślnie aktywowany .

po transkrypcji poszczególne podjednostki są wytwarzane jako preproteiny zawierające rozszczepialne peptydy sygnałowe. Po translokacji przez błonę wewnętrzną (najprawdopodobniej drogą zależną od Sec), peptydy sygnałowe są usuwane. Chociaż peptydy sygnałowe wykazują typowe cechy substratów dla peptydazy wiodącej I, ich rozszczepienie przez peptydazę wiodącą Escherichia coli i jest bardzo nieefektywne. Koekspresja genu lep B. pertussis w E. coli znacznie zwiększa dojrzewanie podjednostek PTX . W przestrzeni peryplazmicznej, wewnątrz podjednostkowe wiązania dwusiarczkowe są tworzone, a holotoksyna jest następnie montowana przed wydzielaniem przez błonę zewnętrzną. PTX zawiera łącznie 11 wewnątrz podjednostkowych wiązań dwusiarczkowych, jedno w S1, dwa w każdym S4 i S5 oraz trzy w każdym S2 i S3 . Wszystkie cysteiny obecne w PTX biorą udział w łańcuchowych wiązaniach dwusiarczkowych . Tworzenie dwusiarczków jest ważne dla biogenezy toksyn, ponieważ zmiana obu cysteiny w S1 uniemożliwia łączenie się tej podjednostki z oligomerem B. Prawidłowe tworzenie dwusiarczków opiera się na systemie DsbA/DsbC, który okazał się niezbędny do montażu i wydzielania PTX . Jednak mutacje w dsbC, kodujące jedną z trzech izomeraz disiarczkowych, najwyraźniej nie mają wpływu na montaż toksyny, chociaż upośledzają jej wydzielanie, co sugeruje, że DsbC działa na składnik, który jest szczególnie wymagany do wydzielania PTX.

sekrecja nie jest wymagana do biologicznej aktywności PTX, ale pełny montaż holotoksyny jest ważny dla wydajnego sekrecji, ponieważ szczepy zaprojektowane do wytwarzania tylko S1 lub tylko Oligomeru B wykazują defekt w sekrecji . Jednakże w pełni funkcjonalny oligomer B może być wydzielany do pewnego stopnia w przypadku braku S1, co wskazuje, że obecność S1 nie jest bezwzględnym wymogiem dla wydzielania oligomeru B. W przeciwieństwie do tego, sam S1 nie może być wydzielany w przypadku braku Oligomeru B, co sugeruje, że determinanty wydzielania znajdują się w oligomerze B, chociaż obecność S1 może z pewnością zwiększyć wydajność wydzielania. Niektóre mutacje w genie S1 mają silny szkodliwy wpływ na wydzielanie , szczególnie w obszarze wokół Arg-57, co sugeruje, że ten region S1 odgrywa rolę w wydzielaniu PTX. W przypadku braku Oligomeru B, S1 najprawdopodobniej przenika do błony zewnętrznej, być może poprzez swoją C-końcową, hydrofobową domenę. Może to być miejsce montażu z oligomerem B przed wydzieleniem przez błonę zewnętrzną .

etapy molekularne w montażu holotoksyn są nadal słabo poznane. Pojedyncze podjednostki w zmutowanych szczepach, które nie produkują innych podjednostek, ulegają szybkiej degradacji. Pewne kombinacje podjednostek wydają się wzajemnie się stabilizować . Na przykład stabilność podjednostki S2 jest znacznie zwiększona przez obecność S4 i odwrotnie, co jest zgodne z tworzeniem dimerów S2–S4 ujawnionym przez strukturę krystaliczną holotoksyny. Możliwe jest również, że podzespoły dimeru S2–S4 z podjednostką S1 powstają w przypadku braku S3 i S5. Nie stwierdzono wydzielania dimeru S2–S4 W B. krztuśca, natomiast dodanie S1 do tego dimeru może spowodować pewien poziom wydzielania.

transport PTX przez błonę zewnętrzną B. krztuśca opiera się na układzie wydzielania typu IV (t4ss) złożonym z dziewięciu różnych białek, nazwanych PtlA przez PtlI . Białka te są homologiczne do tych z T4SSs z innych bakterii, w tym Agrobacterium tumefaciens, Bartonella tribocorum, Brucella suis, Helicobacter pylori, Legionella pneumophila i Rickettsia prowasekii . Geny ptl leżą bezpośrednio poniżej pięciu strukturalnych genów PTX i są pod kontrolą promotora ptx . Wydaje się jednak, że białka Ptl są produkowane na niższych poziomach niż podjednostki PTX, o czym świadczą translacyjne Fuzje genu phoA z różnymi genami ptx i ptl . Produkcja niektórych białek Ptl wydaje się ograniczać wydzielanie PTX. Szacuje się, że podczas wykładniczego wzrostu bakterie wydzielają trzy cząsteczki toksyny/min/ komórkę bakteryjną , a podjednostki kumulują się w przestrzeni peryplazmicznej, zarówno jako pojedyncze podjednostki, jak i połączone w holotoksyny. Akumulacji podjednostek występuje podczas wykładniczego wzrostu, mimo że poziom niektórych białek Ptl wzrasta do Między 30 a 1000 cząsteczek na komórkę. Tak więc wydzielanie zamiast produkcji toksyn lub ich montaż może ograniczać szybkość. Co ciekawe, w przypadku braku białek Ptl niektóre kombinacje podjednostek, takie jak dimer S2-S4 w obecności S1 , mogą być wydzielane, chociaż wydzielanie holotoksyny silnie zależy od obecności białek Ptl.

uważa się , że białka Ptl tworzą kompleks obejmujący zarówno wewnętrzną, jak i zewnętrzną błonę, a wszystkie z nich (co najmniej PtlA-H) wydają się być wymagane do wydzielania toksyn, co zbadano przez mutacje w każdym pojedynczym Genie ptl . Niektóre mutacje wprowadzone w trans do dzikich szczepów ptl+ spowodowały dominujący fenotyp wydzielania ujemnego, potwierdzając, że co najmniej PtlC do PtlH są częścią kompleksu multimerycznego. Kluczowym etapem wydzielania PTX jest oczywiście jego zdolność do przekraczania warstwy peptydoglikanu, a PtlE wykazuje ekspresję aktywności peptydogycanazy . To białko o długości 276 pozostałości zawiera w miejscu aktywnym podobieństwa z innymi glikohydrolazami, a podstawienia alaniny w tym miejscu znacznie zmniejszają aktywność peptydoglikanazy rekombinowanego PtlE. Te same substytucje w naturalnym PtlE również znoszą wydzielanie PTX przez B. krztusiec, silnie sugerując, że PtlE jest peptydoglikanazą wymaganą do przejścia toksyny przez warstwę peptydoglikanową.

wydzielanie PTX również najprawdopodobniej wymaga energii. Dwa białka Ptl, PtlC i PtlH, zawierają przypuszczalne miejsca wiązania adenozynotrifosforanu (ATP) i mogą w ten sposób dostarczać energii niezbędnej do wydzielania toksyn. Wykazano , że oba białka są niezbędne do wydzielania, a w obu przypadkach przypuszczalne miejsca wiązania ATP są niezbędne do funkcjonowania. Dla obu, dominujący negatywny fenotyp obserwuje się, gdy zmutowane allele współwystępują z allelem dzikiego typu, co sugeruje, że oba działają jako multimery lub są częścią kompleksu wydzielania. Wykazano, że PtlH wiąże się z błoną wewnętrzną, a mutacje w miejscu wiązania ATP PtlH wpływają na jego lokalizację komórkową i znoszą jego interakcje z innymi białkami Ptl . Dokładna rola PtlC nie jest jeszcze znana. PtlD jest również białkiem błony wewnętrznej i zawiera pięć domen transbłonowych. Jest on wymagany dla stabilności PtlE, PtlF i PtlH poprzez jego pozostałości C-terminal 72. Jednak ten C-końcowy region nie jest wystarczający do wydzielania toksyn . PtlF wykazuje cechy białek błony zewnętrznej (OMPs), ale może być również związany z błoną wewnętrzną. W Warunkach niewykształcających PtlF i PtlI migrują jako kompleks podczas elektroforezy w żelu poliakryloamidowym siarczanu dodecylu sodu, co wskazuje, że PtlI wiąże się z PtlF przez tworzenie wiązania dwusiarczkowego . Prawidłowe tworzenie wiązania dwusiarczkowego między PtlI i PtlF może zależeć od DsbC, ponieważ mutacje w genie dsbC wpływają na wydzielanie bez wpływu na montaż toksyn .