Clostridium acetobutylicum
A Microbial Biorealm page on the genus Clostridium acetobutylicum
Classification
Higher order taxa
Bacteria (Domain); Firmicutes (Phylum); Clostridia (Class); Clostridiales (Order); Clostridiaceae (Family); Clostridium (Rodzaj)
gatunki
Clostridium acetobutylicum
Clostridium acetobutylicum ATCC 824 jest uważany za Szczep typu.
NCBI: Taksonomia
opis i znaczenie
Clostridium acetobutylicum jest Gram-dodatnim bacillus (1). C. acetobutylicum najczęściej zamieszkuje glebę, choć występuje w wielu różnych środowiskach. Jest mezofilny z optymalnymi temperaturami 10-65°C. Ponadto organizm jest sacharolityczny (może rozkładać cukier) (1) i zdolny do wytwarzania wielu różnych produktów przydatnych w handlu; w szczególności acetonu, etanolu i butanolu (2).
C. acetobutylicum wymaga warunków beztlenowych, aby rosnąć w stanie wegetatywnym. W Stanach wegetatywnych jest ruchliwy przez wić na całej powierzchni. Może przetrwać tylko do kilku godzin w warunkach tlenowych, w których utworzy endospory, które mogą trwać latami nawet w warunkach tlenowych. Tylko wtedy, gdy zarodniki te znajdują się w sprzyjających warunkach beztlenowych, wzrost wegetatywny będzie kontynuowany (1).
Chaim Weizmann hodował bakterie do produkcji acetonu, etanolu i butanolu w procesie zwanym metodą ABE. Dlatego też C. acetobutylicum jest często nazywane ” organizmem Weizmanna.”Produkty te były następnie wykorzystywane do produkcji trotylu i prochu strzelniczego w czasie I wojny światowej [3]. Po I wojnie światowej proces ABE był szeroko stosowany aż do lat 50-tych, kiedy procesy petrochemiczne stały się bardziej opłacalne ze względu na koszty i dostępność źródeł paliw ropopochodnych. Niedawny kryzys paliw kopalnych pobudził więcej badań nad C. acetobutylicum i wykorzystaniem procesu ABE (2).
oprócz tego, że jest ważną bakterią do zastosowań przemysłowych, C. acetobutylicum jest badane jako model tworzenia endosporów u bakterii. Porównano go z najczęściej badanymi bakteriami endosporowymi, Bacillus subtilis (2). Zrozumienie szlaków powstawania endosporów jest ważne, ponieważ wiele bakterii tworzących endospory jest ludzkimi patogenami, zarówno w rodzaju Bacillus, jak i Clostridium.
najczęściej badanym szczepem jest typ-szczep, ATCC 824. Szczep ten został odkryty i wyizolowany w glebie z ogrodu Connecticut w 1924 roku. Badania wykazały, że szeroko badany ATCC 824 jest ściśle związany ze szczepem Weizmanna stosowanym we wczesnej przemysłowej produkcji acetonu (2).
struktura genomu
Genom Clostridium acetobutylicum ATCC 824 został zsekwencjonowany przy użyciu podejścia shotgun. Jest to modelowy szczep bakterii wytwarzających rozpuszczalniki. Genom składa się z jednego okrągłego chromosomu i okrągłego plazmidu. Chromosom zawiera 3 940 880 par zasad. Istnieje niewielkie odchylenie nici, przy czym około 51,5% genów jest transkrybowanych z nici przedniej i 49,5% z nici komplementarnej (2).
znane geny wspólne dla bakterii obejmują 11 operonów, które kodują rybosomy. Interesujące jest to, że każdy z tych operonów znajduje się w pobliżu oriC (pochodzenia replikacji) i jest zorientowany w kierunku wiodącej nici widelca replikacyjnego. (2). Jest to cecha powszechnie obserwowana znana jako dawka genów, w której wysoko transkrybowane geny są umieszczane w pobliżu oriC. Ze względu na Orientację tych genów, będą one transkrybowane w większej liczbie, podczas gdy DNA jest w trakcie replikacji i istnieją dodatkowe kopie genu obecne w komórce.
ponadto Genom zawiera jeden duży plazmid (zwany megaplasmidem). Ten plazmid wydaje się zawierać prawie wszystkie geny zaangażowane w produkcję rozpuszczalników i jest trafnie nazwany pSOL1. pSOL1 zawiera 192 000 par zasad i kodów dla 178 polipeptydów. Badanie plazmidu nie wykazało odchylenia, w którym nić jest nicią kodującą (2).
gdy Clostridium acetobutylicum jest hodowane w ciągłej hodowli lub poddawane wielu transferom, szczep powoli degeneruje się, ponieważ traci zdolność do produkcji rozpuszczalników. Eksperymenty mające na celu określenie przyczyn degeneracji wykazały, że pSOL1 zawiera cztery geny, które są niezbędne do produkcji alkoholu i acetonu. W trakcie wielu transferów lub dalszego wzrostu wegetatywnego plazmid ten jest tracony. Kolejnym dowodem na utratę tego plazmidu prowadzącą do degeneracji szczepu jest fakt, że mutanty pozbawione tych genów i niezdolne do wytwarzania rozpuszczalnika wznawiają produkcję acetonu i alkoholu po uzupełnieniu genów za pomocą plazmidów (4).
inne, mniej zbadane szczepy C. acetobutylicum, takie jak ATCC 4259, wykazały podobne zwyrodnienie. Plazmid w tym szczepie nosi nazwę pseiz. Ponownie, degeneracja spowodowana seryjnym hodowaniem tego szczepu jest uważana za występującą z powodu ewentualnej utraty pseiz. Warto zwrócić uwagę na ten szczep, ponieważ, co ciekawe, te zdegenerowane szczepy również nie zarodkują. To pobudziło pomysł, że geny zaangażowane w sporulację istnieją również na plazmidzie zarówno w ATCC 4259, jak i szczepie typu, ATCC 824 (4, 2).
metabolizm energetyczny i produkty uboczne
Clostridium acetobutylicum jest chemioorganotropem. Uzyskuje energię poprzez fosforylację substratu w drodze fermentacji. Podobnie jak w przypadku całej fermentacji, substratem są cząsteczki organiczne, które działają jako donor i akceptor elektronów. Wynika z tego, że jest heterotroficzny, a jego źródło węgla pochodzi z cząsteczek organicznych. W szczególności C. acetobutylicum wymaga do przetrwania źródła węglowodanów zdolnego do fermentacji (1).
ponadto C. acetobutylicum jest beztlenowcem obligatoryjnym. Może przetrwać tylko godziny w środowisku tlenowym, zanim przejdzie sporulację jako środek do przetrwania przez znacznie dłuższy czas w środowisku tlenowym. Nie wykazuje aktywności katalazy, enzymu ważnego dla organizmów tlenowych w celu przekształcenia toksycznego produktu ubocznego metabolizmu tlenu, nadtlenku wodoru, w wodę i tlen (5). Zawiera jednak wiele enzymów, które pozwalają mu przetrwać w środowiskach mikrooksycznych, takich jak dysmutaza ponadtlenkowa. Enzymy te są regulowane w obecności tlenu i przyczyniają się do krótkotrwałego przeżycia komórek w środowiskach mikrooksycznych (6).
C. acetobutylicum jest w stanie wykorzystać wiele różnych fermentowalnych węglowodanów jako źródło energii, a także węgla. Genom koduje białka wspomagające rozkład ksylanu, lewanu, pektyny, skrobi i innych polisacharydów (2). Co ciekawe, podczas gdy geny, które zwykle kodują cellusomy, kompleksy białkowe, które rozkładają celulozę krystaliczną, są obecne, organizm nie jest w stanie rosnąć wyłącznie na substratach celulozowych (7).
zainwestowano znaczne badania w szlaki metaboliczne Clostridium acetobutylicum w celu poprawy procesów fermentacji przemysłowej. Szlaki metaboliczne, które wytwarzają przemysłowe użyteczne rozpuszczalniki, są najbardziej zauważalne w C. acetobutylicum. Rozpuszczalniki aceton, octan, butanol, maślan i Etanol pochodzą ze wspólnego prekursora, acetylo-CoA (2). Oprócz tych produktów Wytwarza się CO2 i H2 (1).
innym znaczącym szlakiem metabolicznym jest to, że niektóre Clostridia (w tym C. acetobutylicum) są zdolne do “mocowania” azotu atmosferycznego. Proces wiązania azotu redukuje atmosferyczny N2 do amoniaku, który jest następnie włączany do cząsteczek poprzez biosyntezę. Oznaczono to za pomocą znakowanej formy azotu, 15n2. Po zsekwencjonowaniu C. acetobutylicum ATCC 824, seria genów bardzo podobnych do genów wiążących azot w C. pasteurianum, została znaleziona, co dodatkowo potwierdza zdolność bakterii do wykorzystania azotu atmosferycznego (8).
struktura i rozwój komórki
podczas wczesnego rozwoju komórki C. acetobutylicum plami Gram-dodatnie, jednak może plamić Gram-ujemne w miarę starzenia się Kultury. Podczas wzrostu wegetatywnego komórka ma wić okołoziemską (wić, która pokrywa całą powierzchnię komórki) (1). Zwiększona ruchliwość bakterii została zaangażowana w zwiększoną produkcję rozpuszczalników z powodu chemotaksji. Atraktanty obejmują kwas masłowy i cukier. Godne uwagi środki odstraszające obejmują aceton, butanol i Etanol. Mechanizm ten jest logiczny, pozwalając komórce znaleźć składniki odżywcze i odejść od produktów ubocznych wytwarzanych przez jej własny metabolizm (9).
ponadto różne produkty uboczne są wytwarzane w różnych fazach wzrostu C. acetobutylicum. Podczas wykładniczej fazy wzrostu głównymi produktami są octan i maślan. W tym czasie następuje również wiązanie azotu (8). Jakiś czas po wejściu komórki w fazę stacjonarną (18 godzin), produkcja butanolu i acetonu osiąga szczyt (1). Ta czasowa separacja wiązania azotu i produkcji rozpuszczalnika jest korzystna w celu uniknięcia konkurencji dla reduktorów w dwóch procesach (8).
główny etap rozwoju komórki charakteryzuje się tworzeniem endospory. Endospor jest najbardziej opornym typem komórek znanym. Po pewnych wskazaniach środowiskowych, komórka wegetatywna wytwarza przegrodę subterminalną (1), zdarzenie, które można oglądać za pomocą mikroskopii elektronowej . Przegroda ta w końcu stać się inną komórką, o nazwie forespore, pochłonięty przez pierwotną komórkę, zwaną komórką macierzystą. Forespore składa się z warstwy kory (głównie peptydoglikanu)i białek płaszcza. Te dwie wysoce odporne warstwy otaczają rdzeń, który jest silnie odwodnioną cytoplazmą. Rdzeń jest definiowany przez absolutnie żaden metabolizm zachodzący w komórce. Komórka macierzysta lyses uwalnia dojrzały zarodnik. Ten dojrzały zarodnik jest odporny na wysoką temperaturę, chemikalia i wiele rodzajów promieniowania, dzięki czemu może przetrwać nadzwyczajną liczbę lat. Po innych wskazaniach środowiskowych, takich jak środowisko beztlenowe, komórka kiełkuje i ponownie rozpoczyna cykl wegetatywny (10).
tworzenie zarodników rozpoczyna się, gdy komórka jest narażona na niekorzystne warunki. Warunki tlenowe, tworzenie organicznych produktów ubocznych i rozpraszanie gradientu protonu poza błoną cytoplazmatyczną prowadzą do sporulacji. Jest to przeciwieństwo wzorcowego organizmu powstawania endospor, Bacillus subtilis, który tworzy endospory głównie z powodu ograniczenia składników odżywczych (10).
Ekologia
natomiast Szczep typu C. acetobutylicum wyizolowano z gleby, C. acetobutylicum jest wszechobecne. Został znaleziony w “osadach jeziornych, studniach i jelitach Małży” (1). Ponadto odnotowano go w wielu różnych okazach kału, w tym w odchodach ludzkich, bydlęcych i psich (1). Poszukiwanie literatury ujawnia, że patogenne lub symbiotyczne relacje nie są udokumentowane.
patologia
C. acetobutylicum jest całkowicie łagodna zarówno dla roślin, jak i zwierząt, jednak wiele innych gatunków z rodzaju Clostridium jest znanymi patogenami, w tym: Clostridium difficile, Clostridium botulinum, Clostridium tetani i Clostridium perfringen. W szczególności C. botulinum i C. tetani wytwarzają jedne z najbardziej śmiercionośnych neurotoksyn (11).
C. acetobutylicum zostało znalezione w ludzkim okrężnicy, jednak nie wiadomo, czy jest częścią normalnej ludzkiej flory (3). Ponadto, ponieważ organizm nie wydaje się być toksyczny dla ssaków poprzez wytwarzanie substancji wewnątrzkomórkowych lub zewnątrzkomórkowych, organizm musiałby być obecny w ogromnych ilościach, aby wytworzyć jakiekolwiek zagrożenie (12).
jedynym problemem patologii z C. acetobutylicum jest pozyskanie genów z patogennych Clostridium, takich jak C. tetani lub C. botulinum. Chociaż nie odnotowano przypadków nabycia tych genów przez C. acetobutylicum, w literaturze odnotowano przypadki, w których inne gatunki Clostridium powodowały botulizm u niemowląt z toksynami bardzo podobnymi do obecnych w C. botulinum. Podobieństwo toksyn sugeruje, że normalnie nietoksyczny szczep Clostridium nabył geny kodujące toksyny z C. botulinum, które prawdopodobnie są obecne w plazmidzie (13).
zastosowanie w biotechnologii
Clostridium acetobutylicum odegrało ważną rolę w biotechnologii przez cały XX wiek. Początkowo aceton był potrzebny do produkcji kauczuku syntetycznego. Chaim Weizmann został zatrudniony do pracy nad problemem na Uniwersytecie w Manchesterze, a fermentacja stała się atrakcyjną drogą do zdobycia acetonu niezbędnego do tego procesu. W latach 1912-1914 Weizmann wyizolował szereg szczepów. Najlepiej produkujący później stał się znany jako Clostridium acetobutylicum. Metoda ABE opracowana przez Weizmanna zapewniała przewagę zwiększonej wydajności nad innymi procesami fermentacji. Ponadto może wykorzystywać skrobię kukurydzianą jako substrat, podczas gdy inne procesy wymagały użycia ziemniaków (3).
wybuch I Wojny Światowej w 1914 roku spowodował ogromny wzrost zapotrzebowania na aceton. Byłby to przełomowy punkt w rozwoju procesu ABE wykorzystującego organizm Weizmanna. Aceton miał być używany do produkcji bezdymnego prochu strzelniczego, znanego jako kordytu. W ciągu najbliższych kilku lat proces Weizmanna będzie wykorzystywany w wielu dużych fabrykach przemysłowych w Wielkiej Brytanii. Kiedy Wielka Brytania została odcięta od dostępu do zboża w czasie wojny, proces został przeniesiony do fabryk w Kanadzie. Kiedy Stany Zjednoczone przystąpiły do wojny w 1917 roku, otworzyły również kilka fabryk wykorzystujących metodę Weizmanna. Po zakończeniu wojny zapotrzebowanie na aceton gwałtownie spadło. Jednak fabryki nadal były wykorzystywane do produkcji butanolu, użytecznego rozpuszczalnika w produkcji lakierów dla rozwijającego się przemysłu samochodowego. Wcześniej butanol był produktem odpadowym procesu, gdy koncentracja była na produkcji acetonu. Pod koniec lat 20. zapotrzebowanie na butanol nadal rosło ze względu na rosnący przemysł motoryzacyjny i otwarto wiele nowych zakładów o ogromnych mocach produkcyjnych. Dwa takie zakłady wypuszczają codziennie 100 ton acetonu. Oprócz butanolu produkowano Etanol przemysłowy do różnych celów. Gaz wodorowy wydzielany w tym procesie był używany do uwodorniania olejów stosowanych w żywności. Mniej więcej w tym czasie melasa stała się wiodącym substratem do fermentacji ABE. Była tańsza i bardziej wydajna niż skrobia kukurydziana. Gdy patent na szczep Weizmann wygasł w 1937 roku, otwarto kolejne nowe zakłady w całym kraju i za granicą (3).
jednak pod koniec lat 50. i 60. przemysł naftowy zaczął się wspinać w niewiarygodnym tempie. Ponadto Cena melasy używanej do fermentacji zaczęła gwałtownie rosnąć. Chociaż opracowano bardziej wydajne metody fermentacji, ostatecznie nie mogły one konkurować z petrochemiczną produkcją rozpuszczalników przemysłowych i większość zakładów została zamknięta do 1957 r. [3]. Jednak wraz z ciągłym wzrostem cen ropy naftowej, od tego czasu przeprowadzono badania mające na celu ponowne rozważenie fermentacji jako źródła rozpuszczalników przemysłowych. Niektóre z tych procesów próbowały zwiększyć wydajność procesu za pomocą manipulacji genetycznej (14). Inne badały wykorzystanie jako podłoża produktów odpadowych, takich jak serwatka lub wióry drzewne (15).
obecne badania
C. acetobutylicum był przedmiotem badań jako specyficzny mechanizm dostarczania leków terapeutycznych do nowotworowych regionów ciała. C. acetobutylicum jest koniecznie beztlenowe i dlatego dożylne wstrzyknięcie zarodników spowoduje kiełkowanie tylko w niedotlenienie regionów guzów litych w organizmie. Genetyczna manipulacja C. acetobutylicum w celu wytworzenia enzymów, które aktywują pro leki w obrębie regionu nowotworowego, zapewnia niezwykle specyficzny mechanizm dostarczania do tych miejsc nowotworu (16).
niektóre z najnowszych badań zbadano alternatywne metody produkcji rozpuszczalników przemysłowych, które C. acetobutylicum był używany w ubiegłym wieku do produkcji. W szczególności szczególną uwagę zwrócono na butanol jako możliwe alternatywne źródło paliwa dla samochodów. Butanol i Etanol, oba produkty fermentacji przez C. acetobutylicum, były intensywnie badane. Z tych dwóch butanol ma przewagę nad etanolem jako źródłem paliwa, a także wiele możliwych korzyści w stosunku do obecnych źródeł paliwa, ponieważ może oferować niższe emisje i zwiększoną wydajność. Najważniejszym czynnikiem w kosztach produkcji butanolu jest koszt i dostępność substratu. W związku z tym badania zostały ukierunkowane na nowe metody wykorzystania tanich substratów. W badaniu z 2006 r. zaproponowano fermentację butanolu w nowym opatentowanym procesie zastępującym proces ABE. Polega na wykorzystaniu włókna kukurydzianego (konkretnie ksylema), jako substratu dla C. acetobutylicum, do produkcji taniego butanolu. Główną zaletą tej techniki jest to, że włókno kukurydziane jest produktem ubocznym w wielu procesach rolniczych i zapewnia obfite źródło substratu (17).
kolejnym intensywnym źródłem badań C. acetobutylicum jest produkcja wodoru jako alternatywnego źródła energii. Wodór zawiera dużą ilość energii, która może być niezwykle korzystną alternatywą dla benzyny. W szczególności stosowanie wodoru nie powoduje emisji dwutlenku węgla ani gazów cieplarnianych. Większość wodoru jest obecnie wytwarzana przy użyciu nieodnawialnych źródeł; alternatywny sposób produkcji poprzez fermentację byłby niezwykle cenny, gdyby można było znacznie zwiększyć wydajność. W związku z tym w najnowszych badaniach z udziałem C. acetobutylicum badane są różne metody fermentacji, które można wykorzystać do poprawy wydajności. W szczególności jako możliwość przedstawiono reaktor ze złożem ściekowym wykorzystujący glukozę jako substrat, chociaż wydajność jest zbyt niska, aby można ją było stosować Przemysłowo. Jednak jako możliwy środek produkcji w przyszłości postrzegane jest pewne zastosowanie łoża strumieniowego (18).
Taksonomia: NCBI
(1) Cato, E. P., W. L. George, and S. M. Finegold. 1986. Rodzaj Clostridium, S. 1141-1200. In: P. H. A. Sneath et al. (eds.), Bergey ‘ s Manual of Systematic Bacteriology, Vol. 2. Williams and Wilkins, Baltimore, MD.
(2) Nolling J et al., “Genome sequence and comparative analysis of the solvent-producing bacterium Clostridium acetobutylicum.”, J., 2001 Aug; 183(16): 4823-38.
(3) 1986. Aceton-butanol fermentacja ponownie. Mikrobiol. Obj. 50:484-524.
(4) Cornillot, E., R. V. Nair, E. T. Papoutsakis, and p. Soucaille. 1997. Geny powstawania butanolu i acetonu w Clostridium acetobutylicum ATCC 824 znajdują się na dużym plazmidzie, którego utrata prowadzi do degeneracji szczepu. J. Bakteriol. 179:5442-5447.
(5) Zhang H, Bruns MA, Logan BE.(5) Keis, S., Shaheen, R., and Jones, D.T. “Emended descriptions of Clostridium acetobutylicum and Clostridium beijerinckii, and descriptions of Clostridium saccharoperbutylacetonicum sp. nov. and Clostridium saccharobutylicum sp. nov.” Int. J. Syst. Evol. Microbiol. (2001) 51:2095-2103.
(6) Kawasaki, S., Y. Watamura, M. Ono, T. Watanabe, K. Takeda, and Y. Niimura. 2005. Adaptive responses to oxygen stress in obligatory anaerobes Clostridium acetobutylicum and Clostridium aminovalericum. Appl. Environ. Microbiol. 71:8442-8450.
(7) Fabrice Sabathe, Anne Belaıch, Philippe Soucaille (2002) Characterization of the cellulolytic complex (cellulosome) of Clostridium acetobutylicum FEMS Microbiology Letters 217 (1), 15–22.
(8) Chen, J.S., Toth, J., and Kasap, M. (2001) Nitrogen-fixation genes and nitrogenase activity in Clostridium acetobutylicum and Clostridium beijerinckii. J Ind Microbiol Biotechnol 27: 281–286.
(9) Gutierrez, Noemi A., Maddox, Ian S. Role of Chemotaxis in Solvent Production by Clostridium acetobutylicum Appl. Environ. Microbiol. 1987 53: 1924-1927.
(10) P. Durre and C. Hollergschwandner, Initiation of endospore formation in Clostridium acetobutylicum, Anaerobe 10 (2004), s. 69-74.
(11) 1756-1766 In: M. P. Starr et al. (eds.), The Prokaryotes, Volume II. Springer-Verlag, New York.
(12) Toksyny bakteryjne: tabela śmiertelnych ilości. Mikrobiol. Obj. 46:86-94.
(13) 1988. Porównanie toksyn Clostridium butyricum i Clostridium botulinum typu E. zakażenie i odporność 56:926-929.
(14) 2000. Charakterystyka rekombinowanych szczepów mutanta inaktywującego kinazę maślanową Clostridium acetobutylicum: potrzeba nowych modeli fenomenologicznych dla solventogenezy i hamowania butanolu? Biotechnol. Bioeng. 67:1-11.
(15) 1986. Fermentacja butanolu acetonowego. ADV.Appl. Mikrobiol. 31:61-92.
(16) Nuyts S, Van Mellaert L, Theys J, Landuyt W, Lambin P i Anne J. zarodniki Clostridium do dostarczania specyficznych leków dla guza. Leki Przeciwnowotworowe. 2002 Feb;13(2):115-25.
(17) Nasib Qureshi, Xin-Liang Li, Stephen Hughes, Badal C. Saha i Michael A. Cotta produkcja butanolu z ksylanu Z Włókna kukurydzianego przy użyciu Biotechnolu Clostridium acetobutylicum. Prog.; 2006; 22 (3) s. 673-680.
(18) Zhang H, Bruns MA, Logan BE. Biologiczna produkcja wodoru przez Clostridium acetobutylicum w nienasyconym reaktorze przepływowym. Water Res. 2006 Feb; 40 (4): 728-34.
pod redakcją Marka Howera, studenta Rachel Larsen i kita Pogliano
