Cytotoksyczność zależna od dopełniacza

Terapeutyczneedytuj

rozwój przeciwnowotworowych przeciwciał terapeutycznych polega na analizie in vitro ich funkcji efektorowych, w tym zdolności do wywoływania CDC do zabijania komórek docelowych. Klasyczne podejście polega na inkubacji przeciwciał z komórkami docelowymi i źródłem dopełniacza (surowicą). Następnie śmierć komórki jest określana za pomocą kilku podejść:

• metoda radioaktywna: komórki docelowe są znakowane 51Cr przed testem CDC, chrom jest uwalniany podczas lizy komórek i mierzy się ilość radioaktywności.
• pomiar aktywności metabolicznej żywych komórek (barwienie żywych komórek): po inkubacji komórek docelowych z przeciwciałami i dopełniaczem dodaje się barwnik przepuszczający błonę osocza (np. kalcein-AM lub resazurynę). Żywe komórki metabolizują go w nieprzepuszczalny produkt fluorescencyjny, który może być wykryty przez cytometrię przepływową. Ten produkt nie może być utworzony w metabolicznie nieaktywnych martwych komórkach.
• pomiar aktywności uwalnianych enzymów wewnątrzkomórkowych: enzym uwalniający martwe komórki (np. LDH lub GAPDH) i dodanie jego podłoża prowadzi do zmiany barwy, która jest zwykle określana jako zmiana absorbancji lub luminiscencji.
• barwienie martwych komórek: (fluorescencyjny) barwnik dostaje się do martwych komórek przez uszkodzoną błonę plazmatyczną. Na przykład jodek propidium wiąże się z DNA martwych komórek, a sygnał fluorescencyjny jest mierzony za pomocą cytometrii przepływowej.

HLA typing and crossmatch testEdit

testy CDC są używane do znalezienia odpowiedniego dawcy do przeszczepienia narządu lub szpiku kostnego, a mianowicie dawcy z pasującym fenotypem układu zgodności histologicznej HLA. Początkowo typowanie HLA jest wykonywane dla pacjentów i dawców w celu określenia ich fenotypów HLA. Gdy potencjalnie odpowiednia para zostanie znaleziona, wykonuje się test crossmatch, aby wykluczyć, że pacjent wytwarza specyficzne dla dawcy przeciwciała anty-HLA, które mogą powodować odrzucenie przeszczepu.

typowanie HLA metodą CDC (innymi słowy typowanie serologiczne) wykorzystuje szereg przeciwciał anty-HLA pochodzących ze scharakteryzowanych allogenicznych antysurowic lub przeciwciał monoklonalnych. Przeciwciała te są inkubowane jeden po drugim z limfocytami pacjenta lub dawcy i źródłem dopełniacza. Ilość martwych komórek (a tym samym wynik dodatni) mierzy się poprzez barwienie martwych lub żywych komórek. Obecnie typowanie CDC jest zastępowane przez typowanie molekularne, które może identyfikować sekwencje nukleotydowe cząsteczek HLA za pomocą PCR.

test CDC jest zwykle używany do wykonywania testu crossmatch. Podstawowa wersja polega na inkubacji surowicy pacjenta z limfocytami dawcy i drugiej inkubacji po dodaniu dopełniacza królika. Obecność martwych komórek (pozytywny wynik testu) oznacza, że dawca nie jest odpowiedni dla tego konkretnego pacjenta. Dostępne są modyfikacje zwiększające czułość badania, w tym wydłużenie minimalnego czasu inkubacji, dodanie globuliny przeciwludzkiej (AHG), usunięcie niezwiązanych przeciwciał przed dodaniem dopełniacza, oddzielenie podgrupy limfocytów T i limfocytów B. Oprócz CDC crossmatch dostępny jest crossmatch przepływowo-cytometryczny, który jest bardziej wrażliwy i może wykryć nawet przeciwciała nieaktywujące dopełniacza.