częstość występowania i niektóre możliwe mechanizmy oporności na kolistynę wśród wielolekoopornych i intensywnie lekoopornych Pseudomonas aeruginosa

wprowadzenie

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) jest patogenem oportunistycznym, powszechnie występującym w środowisku, takim jak gleba, woda, rośliny i środowisko szpitalne, o znanej wewnętrznej oporności na wiele środków przeciwdrobnoustrojowych i zdolność do wywoływania zakażeń zagrażających życiu. Jest uważany za drugą częstą przyczynę posocznicy na oddziałach intensywnej terapii (ICU) i może powodować zapalenie płuc związane z respiratorem, zakażenia ran i zakażenia dróg moczowych (zum). W wielu badaniach odnotowano wzrost śmiertelności i zachorowalności zakażeń związanych z P. aeruginosa, zwłaszcza tych wykazujących wzorce oporności na wiele leków.1-3

pojawienie się wielolekoopornego (MDR) lub intensywnie lekoopornego (XDR) lub pandrugoopornego (PDR) P. aeruginosa staje się znaczącym problemem zdrowia publicznego, który może prowadzić do opóźnionej terapii przeciwdrobnoustrojowej lub jej niepowodzenia i wzrostu śmiertelności, zwłaszcza wraz z pojawieniem się opornego na karbapenem P. aeruginosa. Tak więc, należy zwrócić uwagę, ponieważ te oporne szczepy mogą wykazywać oporność na wszystkie dostępne środki przeciwdrobnoustrojowe lub wykazywać wrażliwość tylko na toksyczne, takie jak kolistyna lub polimyksyny, nie pozostawiając żadnego wyboru dla zespołu opieki zdrowotnej w leczeniu ciężkich zakażeń związanych z MDR P. Aeruginosa.4

Ostatnio zaobserwowano występowanie oporności na polimyksyny u niektórych gatunków Enterobacteriaceae, takich jak K. pneumoniae, E. coli, Enterobacter aerogenes i Enterobacter cloacae ze względu na szerokie zastosowanie do zwalczania zakażeń w medycynie weterynaryjnej. Oporność na kolistynę stała się głównym wyzwaniem w leczeniu zakażeń zagrażających życiu, zwłaszcza przy współistnieniu genów mcr-1 z innymi genami oporności na wiele leków, takimi jak geny ESBL, MBL, NDM z możliwością pojawienia się oporności panlekowej.5,6

kolistyna, znana jako polimyksyna E, jest jednym z członków rodziny kationowych polipeptydów znanych jako polimyksyny. Ta rodzina antybiotyków charakteryzuje się obecnością lipofilowego łańcucha bocznego acylu tłuszczowego. Obecnie kolistyna jest ponownie wprowadzana do terapii medycznej i uważana za ostateczność w leczeniu ciężkich infekcji spowodowanych Plamami MDR i XDR. Ogólnie rzecz biorąc, działanie polimyksyn na bakterie zależy głównie od oddziaływania elektrostatycznego między dodatnio naładowanym antybiotykiem a ujemnie naładowaną grupą fosforanową lipidu a zlokalizowaną na zewnętrznej błonie po jej związaniu, dyfunduje przez zewnętrzną błonę, przestrzeń peryplazmatyczną i oddziałuje z wewnętrzną błoną. Polimyksyny powodują destabilizację błony zewnętrznej, tworzenie porów, zwiększają przepuszczalność, wyciek do zawartości cytoplazmy, a następnie lizę komórek.7

oporność na kolistynę występuje głównie z powodu modyfikacji chemicznej przez enzymatyczny dodatek fosfoetanoloaminy w grupie 4ʹ-fosforanowej lipidowej grupy a lipopolisacharydu, zmniejszając ładunek netto ujemny błony zewnętrznej, powodując zmniejszenie powinowactwa polimyksyny. Oporność na kolistynę może wynikać z mutacji kodowanej chromosomalnie, jak opisano w K. pneumoniae lub poziomego przenoszenia oporności za pomocą plazmidu przenoszącego Gen oporny na kolistynę (mcr-1).8-11

pojawienie się odporności na kolistynę w różnych krajach Azji, Europy i niektórych krajach Afryki stało się jednym z globalnych problemów. Jak, kolistyna oporność rozpowszechnianie wskazuje jego zdolność do przenoszenia poziomo koniugacyjnych plazmidów lub pionowo chromosomowych mutacji.12,13 również, będąc kolistyną jedną z ostatnich linii leczenia poważnych infekcji, dzięki czemu pojawienie się oporności na kolistynę zagraża światu pojawieniem się nieuleczalnych chorób zakaźnych.14 wykrywanie oporności na kolistynę w Egipcie, który jest krajem znanym z wysokiego obciążenia chorobami zakaźnymi i obecności niskiego lub zerowego ograniczenia stosowania środków przeciwdrobnoustrojowych zarówno w weterynarii, jak i medycynie, co wskazuje na pojawienie się nieuleczalnych chorób w naszym regionie ze względu na możliwość przeniesienia odporności na kolistynę na wysoce oporne bakterie.15

w tym badaniu badamy występowanie oporności na kolistynę wśród MDR i XDR P. aeruginosa izolowany od pacjentów cierpiących na różne infekcje na oddziale intensywnej terapii (OIOM) Szpitala Uniwersyteckiego Minia w Egipcie.

materiały i metody

pobranie izolatów

od pacjentów przyjętych na OIOM w Szpitalu Uniwersyteckim w Minia w Egipcie w ramach rutynowych procedur szpitalno-laboratoryjnych pobrano sto siedemdziesiąt pięć próbek klinicznych różnych źródeł zakażeń. Wszystkie próbki kliniczne hodowano na agarze sojowym tryptykazy (Lab M, UK) w temperaturze 37°C i 42°C przez 24 godziny. Jedną kolonię poddano hodowli na płytkach agarowych MacConkey i agarze cetrymidowym. Wyizolowane kolonie zostały następnie zidentyfikowane zgodnie z morfologią Kolonii, fermentacją laktozy, reakcjami biochemicznymi (w tym ruchliwością siarczkowo–indolową, katalazą, potrójnym cukrem żelazem, ureazą i oksydazą), zdolnością do wzrostu na agarze cetrymidowym i wzrostu w temperaturze 42°C. 16 Kolonii P. aeruginosa oczyszczono przez smugowanie, a czyste kolonie przechowywano w temperaturze 4°C.

testy podatności na antybiotyki

Test podatności na antybiotyki metodą dyfuzji dyskowej Kirby ‘ego-Bauera

test podatności na antybiotyki różnych klas został przeprowadzony metodą dyfuzji dyskowej Kirby’ ego-Bauera.Użyto 17 płyt z antybiotykami: amoksycylina/kwas klawulanowy (AMC) (20/10 mcg), ampicylina/sulbaktam (SAM) (20 mcg), meropenem (MEM) (10 µg), imipenem (IPM) (10 µg), цефепим (FEB) (30 µg), medyczne (CEP) (75 g), polimyksyna b (PB) (300 µg), cyprofloksacyna (CIP) (5 µg ), lewofloksacyny (LEW) (5 µg), gentamycyna (CN) (10 µg), ceftazydym (CAZ) (30 µg), тигециклин (TGC) (15 µg), amikacin (AK) (30 µg), tobramycyna (CF) (10 µg), азтреонам (ATM) (30 µg), także (PRL) (30 µg), karbenicillin (CAR) (100 g) (Оксоид; Бейсингсток, wielka Brytania). Izolaty zostały sklasyfikowane jako wrażliwe, pośrednie i oporne zgodnie ze standardami interpretacji stref hamujących Clinical Laboratory standards Institute (CLSI) 2018.18

oznaczanie MIC antybiotyku kolistyny

metoda rozcieńczania agaru na agarze Mullera-Hintona została wykorzystana do określenia minimalnego stężenia kolistyny hamującej.Oporność na kolistynę rozważano, jeśli MIC wynosi ≥4µg / mL zgodnie ze standardowymi wytycznymi CLSI.

zgodnie z wynikami wrażliwości na antybiotyki Izolaty zaklasyfikowano do MDR, XDR i PDR zgodnie z wcześniej zgłoszonymi kryteriami.20

Combined Disc Diffusion Test (CDT)

wszystkie Izolaty oporne na kolistynę (MIC ≥4) badano przy użyciu 100 mM EDTA (Sigma-Aldrich; St.268 Louis, MO, USA) w celu zahamowania aktywności mcr-1, ponieważ stężenie to nie wykazało aktywności przeciwdrobnoustrojowej. Szczepy bakterii hodowano na agarze Muller-Hinton (Lab M, UK), na którym użyto trzech dysków. Jeden dysk nasycono 10 µL 100 mM EDTA, aby nie hamować wzrostu bakterii przez stosowane stężenie EDTA. Pozostałe dwa dyski to 10 µg kolistyny i 10 µg kolistyny plus 10 µL 100 mM EDTA. Izolaty obserwowano zwiększenie średnicy dysku kolistyny/EDTA o ≥3 mm w strefie hamowania w porównaniu z krążkiem kolistyny.

Zmiana potencjału Zeta

geny mcr kodują enzymy transferazy fosfoetanoloaminowe, które przyłączają enzymatycznie grupę fosfoetanoloaminową (PEtN) do lipidu a zewnętrznej błony bakterii Gram-ujemnych, co prowadzi do zmniejszenia jej ujemnego ładunku netto nadającego oporność na kolistynę.

komórkom bakteryjnym pozwolono rosnąć w obecności i braku 80 µg/mL EDTA. Następnie zawiesinę bakteryjną odwirowywano przy 5000 obr. / min przez 5 min w temperaturze 5°C, następnie granulki przemywano dwukrotnie, po czym granulki zawieszono w 2 mL sterylnego 1 mM roztworu NaCl dostosowanego do 0,5 mętności roztworu wzorcowego. Próbki rozcieńczono do 1: 4 przy użyciu 1 mm NaCl. Potencjał Zeta oznaczono w 2 mL rozcieńczonej próbki. Zmiany potencjału Zeta indukowane przez EDTA obliczono na podstawie stosunku potencjału Zeta (RZP=ZP+EDTA/ZP-EDTA), gdzie ZP+EDTA i ZP-EDTA odpowiadają wartościom potencjału Zeta uzyskanym dla zawiesin bakteryjnych hodowanych w obecności lub braku EDTA 80 µg/mL. RZP o wartości ≥ 2,5 uważane za kryteria identyfikacji szczepów dodatnich mcr-1.21

ekstrakcja DNA

szablon DNA ekstrahowano z nocnej Kultury P. aeruginosa, jak wcześniej opisano.23 zawiesinę osadu bakteryjnego gotowano przez 10 minut, a następnie odwirowano. Supernatant stosowano bezpośrednio w teście PCR.

analiza PCR badanych genów

egzotoksyna A jest ważnym czynnikiem zjadliwości (czynnikiem cytotoksycznym) P. aeruginosa w zakażeniach klinicznych. Czynnik ten hamuje biosyntezę białek, prowadząc do wielkich uszkodzeń tkanek i narządów. Gen toxA, nieodłączna Sekwencja genetyczna zlokalizowana na chromosomie P. aeruginosa, jest używana do potwierdzenia P. aeruginosa przez PCR.

PCR przeprowadzono w całkowitej objętości 25 µL zawierającej 1x bufor PCR, 1 µmol/l każdego startera, 1 µL genomowego DNA (około 150 ng), 200 µmol/l mieszanki dNTPs, 2 mmol/l MgCl2 i 0,05 U/µL polimerazy DNA TAQ. Amplifikacje PCR przeprowadzono dla toxA FW:CTGCGCGGGTCTATGTGCC, RV:GATGCTGGACGGGGTCGAG w zautomatyzowanym cyklerze termicznym (Eppendorf, Hamburg, Niemcy) w następujących warunkach: 30 cykli po 1 min w 94°C, 1,5 min w 63°C i 1 min w 72°C. 24

geny mcr-1 i mcr-2 oznaczono konwencjonalną techniką PCR przy użyciu następujących podkładów: mcr-1 FW (5′-AGTCCGTTTGTTGTGGC-3′), Rv (5′-AGATCCTTGGTCTCGGGC-3′) i mcr-2 Fw (5ʹ-ATGACATCACACTCTTGG-3ʹ), RV (5ʹ-TTACTGGATAAATGCCGCGC-3ʹ).25,26 warunki techniki wynosiły 34 cykle 95°C przez 1 min, 58°C dla mcr-1 i 52°C przez 30 S, 72°C przez 1 Min, a następnie ostateczne przedłużenie 72°C przez 5 min.

oznaczanie hamowania pomp odpływowych przez redukcję MIC przy użyciu inhibitora pompy odpływowej (CCCP)

do oznaczania Mic zastosowano metodę rozcieńczania agaru przy użyciu bulionu Muellera-Hintona dostosowanego do kationów (Sigma-Aldrich, St Louis, USA). Dla badanych izolatów oznaczono Mic CCCP (EPI) i kolistyny. Submic CCCP użyto do określenia jego wpływu na kolistynę MIC; stężenie CCCP (0,5× MIC) było stale utrzymywane w stężeniach Mic podanych powyżej, podczas gdy stężenie antybiotyku było seryjnie zwiększane. Mic izolatów do kolistyny w nieobecności i obecności CCCP oznaczono przy użyciu submic CCCP (końcowe stężenie 10 mg / L), jak już opisano.Uzyskane zmiany Mic po dodaniu CCCP obliczono jako stosunek poziomu Mic antybiotyku wolnego od CCCP do poziomu antybiotyku dodanego do CCCP. Jak wcześniej opisał Osei Sekyere, Amoako28, który zgłosił, że pozytywnym kryterium obecności pomp wypływowych w izolatach było ≥8-krotne zmniejszenie MIC kolistyny po dodaniu CCCP.

wzór białka błony zewnętrznej

pojedynczą kolonię badanych izolatów P. aeruginosa hodowano w 5 mL bulionu LB w temperaturze 37°C przez 2 dni z wytrząsaniem przy 200 obr. / min. Komórki wirowano przy 8000 obr. / min przez 5 min. Granulki bakterii zawieszono w 1 mL buforu do lizy (0,05 M Tris HCL, 2% SDS, 10% glicerolu), ogrzewano w temperaturze 95°C przez 10 minut. Następnie próbki wirowano z prędkością 10 000 obr. / min przez 30 min. Około 50 µL wyekstrahowanego białka zmieszano z buforem próbki (4 mL dejonizowanej wody, 1 mL 0,5 m Tris HCL, 1,6 mL 10% SDS, 0,4 mL 2-merkaptoetanolu, 0,2 mL 1% (w/v) Bromofenolu niebieskiego) (1:1) i oddzielono 12% sodowym siarczanem dodecylu-żelem poliakryloamidowym (SDS-PAGE).

lipopolisacharyd SDS-Poliakrylamidowy profil żelowy dla izolatów wrażliwych na kolistynę i opornych na kolistynę

LPS badanych izolatów ekstrahowano i oczyszczano metodą gorącą wodno-fenolową z użyciem Westphala, Jann30 i analizowano oczyszczony materiał za pomocą SDS-PAGE, a następnie barwiono srebro specyficzne dla węglowodanów.31

wyniki

Izolacja Pseudomonas aeruginosa i podatność na antybiotyki

spośród 175 próbek pobranych od pacjentów cierpiących na różne infekcje, 75 próbek (42,8%) wykazało fenotypowy dodatni wynik dla P. aeruginosa i pozytywny dla genu toxA.

testy wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe wykazały, że wyizolowana P. aeruginosa była całkowicie oporna na amoksycylinę/kwas klawulanowy i zaobserwowano wysoką oporność na ampicylinę/sulbaktam (68%), ceftazydym (63%) i azetreonam (60%). Obserwowano umiarkowaną oporność zarówno na tobramycynę, jak i tygecyklinę (po 50%). Ponadto wykazano niską oporność na imipenem (6%) i meropenem (5,3%) (rycina 1). Zgodnie z wynikami wrażliwości na antybiotyki oporne Izolaty zaklasyfikowano do MDR (96%), XDR (87%), a żaden izolat nie został zaklasyfikowany jako PDR. Ponadto stwierdzono, że spośród 75 izolatów 16 izolatów (21,3%) wykazywało oporność na antybiotyk kolistyny o MIC ≥ 4µg/mL (w zakresie od 8 do 256 µg/mL).

ryc. 1 wzorzec oporności na antybiotyki wszystkich izolowanych izolatów P. aeruginosa.

oznaczanie genów Mcr-1 i Mcr-2

genu Mcr-1 wykryto fenotypowo w izolatach opornych na kolistynę metodą CDT, gdzie różnice między średnicami stref hamowania krążków kolistyny/EDTA i kolistyny mierzono na ≥ 3 mm. wyniki wykazały, że 6 izolatów (37,5%) wykazało wzrost średnicy krążka kolistyny/EDTA o 3 do 10 mm w porównaniu do samego krążka kolistyny (fig.2).

2 wykrywanie fenotypowe izolatów mcr dodatnich metodą combined disc diffusion test (CDT). (A): szczep dodatni mcr-1 wykazał wzrost średnicy strefowej dysków z kolistyną i EDTA ≥ 3 mm w porównaniu do samej kolistyny. (B): ujemny izolat mcr-1 wykazał niewielką zmianę (1 mm) w średnicy strefy hamowania kolistyny i dysku EDTA w porównaniu do samej kolistyny.

Zmiana potencjału Zeta

z drugiej strony, test zmiany potencjału Zeta został przeprowadzony jako wykrywanie fenotypowe genów MCR, ale wyniki nie wykazały znaczącej zmiany potencjału Zeta z wyjątkiem 2 izolatów.

wykrywanie genów oporności

genetyczne wykrywanie genów mcr przy użyciu konwencjonalnej techniki PCR wykazało, że 8 (50%) izolatów było dodatnich dla mcr-1, 6 z nich było dodatnich dla CDT, podczas gdy 100% (16 izolatów) było ujemnych dla mcr-2.

wrażliwość na antybiotyki izolatów opornych na kolistynę

wrażliwość izolatu opornego na kolistynę na inne antybiotyki oznaczono metodą dyfuzji dyskowej Kirby ‘ ego-Bauera, wyniki wykazały, że 100% izolatów było opornych na amoksycylinę/klawulan, podczas gdy oporność na ampicylinę/sulbaktam, cefepim i tobramycynę wynosiła odpowiednio 78,12%, 71,87% i 68,75%. Najskuteczniejszymi lekami były meropenem, imipenem i cyprofloksacyna (Rysunek 3)

ryc. 3 wzorzec oporności na antybiotyki izolatów opornych na kolistynę.

.

oznaczanie hamowania pompy Eflux przez redukcję MIC przy użyciu CCCP

badając wpływ CCCP 0,5 MIC na kolistynę MIC, stwierdzono, że tylko 3/16 izolatów (P6, P8 & P16) (18,75%) wykazało zmniejszenie Mic kolistyny ≥ 8-krotnie (Tabela 1) w obecności CCCP. Z poprzednich wyników wynika, że izolat nie Stwierdzono, że 16 ma mechanizm wypływu i gen mcr-1.

Tabela 1 Izolaty oporne na kolistynę, niektóre możliwe mechanizmy oporności na kolistynę i ich wrażliwość na inne antybiotyki

zewnętrzna membrana SDS-PAGE Profile

Tabela 2 i rysunek 4 pokazują, że pięć pasm o masie cząsteczkowej 66,7, 56,06, 47,8, 40,18 i 23.6 KDa było stabilnych w wrażliwych i opornych izolatach, podczas gdy jeden zespół o masie cząsteczkowej 21 KDa stwierdzono tylko w szczepach opornych na kolistynę, które miały P1 (mcr-1 dodatni) i P12 (mcr-1 ujemny).

Tabela 2 Masa cząsteczkowa i ilość % wyekstrahowanych białek błony zewnętrznej opornych na kolistynę i wrażliwych na kolistynę P. Aeruginosa

ryc. 4 błona zewnętrzna SDS-PAGE szczepów opornych na kolistynę i wrażliwych. Lane 1: Marker białkowy, pas 2 i pas 3: szczepy oporne na kolistynę (P1 & P12), pasy 4-6: szczepy wrażliwe na kolistynę.

lipopolisacharyd (LPS) SDS-PAGE

lipopolisacharyd zabarwiony srebrem SDS-PAGE wykazał, że oporne na kolistynę ujemne Izolaty mcr-1 (P3, P6 i P10) nie wykazywały wzorca pasm LPS (powtórzenia antygenu O lub rdzeń LPS), który ujawniał możliwość ich utraty i oporność tych izolatów na kolistynę. Z drugiej strony, oporny na kolistynę szczep mcr-1 wykazywał powtórzenia O-antygenu (Fig. 5, pas 5), który różni się od O-antygenu powtarzającego wzór szczepu wrażliwego na kolistynę (Fig.5, Pas 4), podczas gdy oba wykazywały rdzeń LPS. Wyniki te mogą wskazywać na obecność zmodyfikowanych LPS w szczepie mcr-1 dodatnim.

rys. 5 wzór opasek LPS. Pasy 1, 2 & 3: oporne na kolistynę szczepy mcr-1 ujemne (odpowiednio P3, P6 & P10), Pas 4: szczepy wrażliwe na kolistynę i pas 5: oporny na kolistynę szczep mcr-1 dodatni (P1). Powtórzenia O-antygenu są w pudełku, a strzałka odnosi się do rdzenia LPS.

dyskusja

Ostatnio, wielolekooporne szczepy bakterii chorobotwórczych pojawiają się tam, gdzie większość dostępnych antybiotyków nie jest skuteczna przeciwko nim.6,32-36 polimyksyny uważano za ostateczność w leczeniu wielolekoopornych infekcji bakteryjnych, dlatego konieczne było zbadanie pojawienia się oporności na kolistynę. Polimyksyny wykazały swoją aktywność poprzez oddziaływanie elektrostatyczne między nimi a ujemnie naładowanymi ugrupowaniami na lipidzie a bakterii Gram-ujemnych, powodując destabilizację błony zewnętrznej i wyciek zawartości cytoplazmy i lizy.37,38

stwierdzono, że najczęstszą przyczyną oporności na polimyksynę jest modyfikacja LPS przez dodanie 4-amino-4-deoksy-l-arabinozy (Lara4N) i fosfoetanoloaminy (kodowanej przez geny typu mcr) lub galaktozaminy do lipidu a rdzenia LPS. W rezultacie spadek ładunku netto ujemnego reszt fosforanowych wpływa na powinowactwo polimyksyny do błony lub na skutek działania dwuskładnikowych układów regulacyjnych (tcss) pmrA / pmrB i phoP / phoQ.39

w naszym badaniu wykryliśmy oporność na kolistynę zgodnie z wynikami Mic, a następnie ich testami na obecność transferazy fosfoetanoloaminowej mcr-1 przy użyciu metod fenotypowych i wykrywaniem mcr-1genu. Metody fenotypowe zależą od tego, że fosfoetanoloamina mcr-1 jest metaloproteiną cynku. Tak więc, każdy spadek cynku zmniejszy Mic kolistyny w izolatach dodatnich dla mcr-1. Jako enzym kodujący mcr-1, metaloproteina cynkowa umożliwia stosowanie EDTA jako chelatora metali w celu zmniejszenia zawartości cynku w pożywce i wpływu na Mic kolistyny i potencjały zeta izolatów mcr-1 dodatnich.40

nasze badanie wykazało wysoką częstość występowania P. aeruginosa (42,8%). MDR P. aeruginosa odpowiadała 96% wszystkich izolatów, A 87% przypadało na XDR. Wysokie rozpowszechnienie opornego na kolistynę P. aeruginosa (21.3%) wykryto, co może być wynikiem niewystarczających środków kontroli infekcji i niewłaściwego stosowania antybiotyków bakteriobójczych w oddziałach intensywnej terapii szpitali w naszym kraju. Ponadto kolistyna jest szeroko stosowana w naszych krajach w promowaniu wzrostu zwierząt, od których lub z których pozyskuje się żywność, zwłaszcza w przemyśle drobiarskim, podczas gdy karbapenemy są stosowane w nagłych przypadkach.Tak więc, karbapenemy wykazywały obserwowalną aktywność wobec badanych organizmów w porównaniu do kolistyny. Z drugiej strony, nasze wyniki były wyższe niż te zgłoszone przez Liassine i al25, którzy donosili, że jeden izolat 300 izolatów różnych gatunków bakterii został zidentyfikowany jako P aeruginosa wykazujący oporność na kolistynę i zawierający Gen mcr-1.

Combined disc diffusion test (CDT) i zmiana potencjału zeta indukowana przez EDTA były stosowane jako metody fenotypowe41,42 do wykrywania genu mcr-1. Wyniki wykazały, że żadne Izolaty nie były dodatnie dla mcr-2, A 8 (50%) izolatów izolatów opornych na kolistynę było dodatnich dla mcr-1, podczas gdy 2 Izolaty tych izolatów wykazały RZP > 2,5. Spośród 8 izolatów mcr-1 dodatnich, 6 izolatów było dodatnich dla CDT, podczas gdy dwa mcr-1 Dodatnie (szczep nr. P15 i P16) były ujemne dla CDT, co może być spowodowane współprodukcją dodatkowego mechanizmu oporności na kolistynę, który zakłóca działanie EDTA.21 As, stwierdzono, że izolat nie P16 (mcr-1 dodatni i CDT ujemny) był dodatni dla efflux.21,43 – 45 ponadto, Izolaty oporne na kolistynę, które były ujemne dla mcr-1, mogą mieć mutacje ze względu na długotrwałe stosowanie środków przeciwdrobnoustrojowych.

ponadto przetestowaliśmy Izolaty odporne na kolistynę pod kątem obecności mechanizmów wypływu przy użyciu CCCP (inhibitor pompy wypływu) oraz różnicy w białku błony zewnętrznej i profilu LPS SDS – PAGE wśród wrażliwych i opornych izolatów. Nasze wyniki wykazały obecność mechanizmu wypływu wśród 3 izolatów, podczas gdy jeden z nich był dodatni mcr-1. Profil białek błony zewnętrznej wykazał jeden zespół o masie cząsteczkowej 21 KDa w opornych izolatach P1 (mcr-1 dodatni) i P12 (oporny na kolistynę mcr-1 ujemny). Ponadto stwierdzono, że oporne na kolistynę szczepy mcr-1 ujemne nie wykazywały wzorca pasm LPS (powtórzenia antygenu O lub rdzenia LPS), ale mcr-1 Dodatnie (P1) i Izolaty wrażliwe na kolistynę wykazały rdzeń LPS, ale inny wzór powtórzeń antygenu o. Machado i wsp. 20 badali rolę pompy wypływu w oporności na kolistynę u Acinetobacter baumanni i odkryli, że aktywność wypływu przyczynia się do heteroresistance A. baumanni bez mutacji. Marjani i wsp. 43 wykazały, że 22,5% wyizolowanych szczepów P. aeruginosa było opornych na kolistynę, co jest zbliżone do naszych wyników, a ponad 50% izolatów opornych na kolistynę było dodatnich dla pomp wypływowych.

chociaż dokładny mechanizm zabijania bakterii przez kolistynę lub polimyksyny nie jest wyraźnie znany, wiadomo, że ich wiązanie z dodatnio naładowanymi peptydami i ujemnie naładowanym lipidem A jest kluczowym etapem. Przetestowaliśmy więc ich profil LPS SDS-PAGE i zaobserwowano znaczącą różnicę między testowanymi szczepami. W badaniu przeprowadzonym przez Moffatta i wsp.46 stwierdzono, że utrata LPS spowodowała pojawienie się oporności na kolistynę A. baumanii, która występuje w wyniku inaktywacji genów biosyntezy lipidów a (lpxA, lpxC lub lpxD). Wzorce białek błony zewnętrznej wykazały obecność pasma o masie cząsteczkowej wynoszącej 21 KDa w izolatach opornych na kolistynę, które mogą odpowiadać OprH, zgodnie z raportami Nicas i Hancocka47, którzy donosili, że ekspresja OprH odgrywa rolę w oporności Pseudomonas na polimyksyny i EDTA, ponieważ OprH zastępuje dwuwartościowe kationy w błonie zewnętrznej, co powoduje blokowanie polikionicznego wychwytu antybiotyku. Poprzednie odkrycie może wyjaśniać, dlaczego szczep nr. P1 (mcr-1 dodatni) był ujemny dla CDT.

wnioski

niniejsze badanie wykazało dużą częstość występowania MDR i XDR P. aeruginosa wykazujących oporność na kolistynę wśród pacjentów przyjętych na OIOM cierpiących na różne infekcje. Ponadto wykazano obecność różnych mechanizmów, które mogą powodować oporność na kolistynę. Wskazuje to na pilną potrzebę zmiany strategii leczenia antybiotykami zarówno dla ludzi, jak i zwierząt.