Diagnosing inflammation and infection in the urinary system via proteomics

Sample sources to evaluate urinary proteomic data for Urinary diagnostic purposes

pobranie 120 próbek moczu profilowanych w tym badaniu nie ograniczało się do rozpoznania, oceny postępu lub leczenia określonej choroby. Badanie moczu (UA) próbek zostało zlecone przez lekarzy prowadzących z różnych powodów, w tym ostrego urazu, krwawienia z pochwy, zawrotów głowy/nudności, hiperlipidemii, cukrzycy typu II i powiązanych powikłań, bólu brzucha/nudności, nieokreślonego nadciśnienia tętniczego, nadciśnienia pęcherza moczowego, idiopatycznej wielomoczy i podejrzenia zum. Ponieważ ZUM jest bardzo rozpowszechnioną chorobą zakaźną związaną z niektórymi wyżej wymienionymi objawami klinicznymi (np. bólem brzucha/nudnościami) i czynnikami ryzyka (np. cukrzycą), spodziewaliśmy się częstego diagnozowania bakteriurii lub zum od tych próbek. Analizy proteomiczne ograniczono do próbek, w których raporty z analizy moczu zapewniały wstępne wsparcie dla bakteryjnie wywołanych zum(patrz metody). Nie analizowaliśmy próbek moczu w przypadkach, w których udostępniono konkretną diagnozę bezobjawowej bakteriurii. Uzyskano obszerne dane UA dla wszystkich 120 próbek. Badanie obejmowało badania przy użyciu przyrządu pomiarowego, badanie mikroskopowe osadów w moczu pod kątem różnych typów komórek i śluzu oraz – w 46% przypadków-dane dotyczące hodowli moczu (UC). Przeanalizowano również dane dotyczące wyglądu moczu, takie jak mętność, kolor oraz kolor i objętość granulek moczu. Wyniki analizy moczu pozwoliły na kompleksowe porównanie konwencjonalnych metod diagnozowania chorób dróg moczowych z danymi z badań metaproteomicznych (dodatkowy plik 3: Tabela A3).

neutrofile, dominujący efektory wrodzonej odpowiedzi immunologicznej w drogach moczowych, odpowiadają za wysoki poziom stanu zapalnego w wielu próbkach

dane Proteomiczne dały mocne dowody na ważną rolę neutrofili jako efektorów i przekaźników stanu zapalnego w drogach moczowych. Neutrofile uwalniają cząsteczki przeciwdrobnoustrojowe i zapalne z granulek wydzielniczych, które produkują i zabijają inwazyjne patogeny w fagolizosomach po ich fagocytozie. W hierarchicznej analizie klastrów zoptymalizowanej pod kątem przykładowego rzędu liści (HCLSO) zidentyfikowano cztery przykładowe klastry o profilach obfitości białka u ludzi zdominowanych przez neutrofile (23 ze 111 przypadków; klastry NAD1 na fig.1) i dwa klastry o ilościach białka specyficznego dla neutrofili porównywalnych z ilościami związanymi z cytoszkieletem (25 przypadków; klastry NAD2 na fig. 1). Białka cytoszkieletowe są silnie wyrażone w komórkach nabłonkowych wyściełających układ moczowo-płciowy i stanowią większość proteomu osadu moczowego w przypadku braku warunków patofizjologicznych w drogach moczowych. Trzydzieści pięć z 48 profili nad klastra było dodatnich dla identyfikatorów uropatogenu, w tym G. vaginalis, wskazując na fakt, że dominującą przyczyną zapalenia u odpowiednich pacjentów była bakteriuria i odpowiedź immunologiczna wobec inwazyjnych drobnoustrojów. Powodem odległości między klastrami NAD w drzewie wiązania była znaczna zmienność liczby zidentyfikowanych białek ludzkich w zakresie od 200 do 1500 identyfikatorów na próbkę.

hierarchiczna analiza klastrów profili proteomicznych osadu moczowego dla 110 próbek. Hierarchiczne klastrowanie przeprowadzono na ilościowych zestawach danych białek ludzkich przy użyciu metody TPA w oprogramowaniu MaxQuant. Zbiory danych zostały poddane analizie korelacji Pearsona z optymalizacją kolejności liści próbki i kompletnym klastrowaniem połączeń przy użyciu narzędzia programowego MeV . Wyeliminowaliśmy mapę ciepła obfitości białka z wyświetlanego drzewa hierarchicznego próbek. Dolna część panelu po lewej stronie łączy się z górną częścią panelu po prawej stronie, ponieważ dotyczy powiązań drzew. Przykładowe nazwy klastrów, pokazane po prawej stronie grafiki wraz z ich akronimami, zostały szczegółowo omówione w tekście. Kolorowe paski wskazują typ, rozmiar i położenie każdego klastra próbki w drzewie.

liczba leukocytów

kluczową motywacją do tego badania było określenie, w jaki sposób dane proteomiczne pochodzące z osadów moczu w porównaniu do konwencjonalnych testów w celu określenia ilościowego poziomu zapalenia w próbkach moczu. Oznaczono ilości 35 białek, o których wiadomo, że są silnie wyrażone w aktywowanych neutrofilach (dodatkowy plik 2: Tabela A2) w stosunku do całkowitej obfitości białka dla każdej próbki UP, jak pokazano na niebieskich segmentach wykresu pokazanego na rysunku 2. Nie nieoczekiwanie 85% przypadków należących do wyżej wymienionych klastrów NAD1 znajdowało się w części wykresu z ponad 30% zawartością białka neutrofilowego (po lewej stronie). 35 białek obejmowało pięć grup funkcyjnych: białka z rodziny S100 wiążące wapń S100-A8, S100-A9 i S100-A12, które przyczyniają się do 40-50% całkowitej zawartości białka cytozolowego w neutrofilach; białka uwalniane podczas stanu zapalnego z granulek neutrofili, w tym mieloperoksydaza (MPO), katepsyna G (CTSG), defenzyna-1 (DEFA1), elastaza (ELANE), lizosom (LYZ), laktotransferyna (LTF) i katelicydyna (CAMP) ; białka zaangażowane w tworzenie, handel i fuzję granulek z fagolizosomami, w tym grancalciną (GCA), plastyną-2 (lcp1), aneksyną A3 (ANXA3) i tetraspaniny (antygen cd63); białka wpływające na migrację neutrofili w środowisku REORGANIZUJĄCEJ się macierzy pozakomórkowej, takie jak integryna am/β2, żelatynaza (MMP9) i kolagenaza neutrofili (mmp8); i oksydaza NADPH, enzym z wieloma podjednostkami, w tym cytochromem b-245 (CYBA, Fig.3), zlokalizowany w błonie fagolizosomów komórek fagocytarnych i odpowiedzialny za wybuch oksydacyjny, który bezpośrednio zabija patogeny. Wiele z tych białek, zwłaszcza defenzyna-1, było bardzo obfite w próbkach z dowodami na UTI (np. SA_112 i PM_20, Fig. 3). Patogenami bakteryjnymi w obu przypadkach były S. aureus (SA) I p. mirabilis (PM) i, nie nieoczekiwanie, znajdowały się po lewej stronie na wykresie fig.2 i sąsiadowały ze sobą w gromadzie NAD1 (Fig. 1). Zdajemy sobie sprawę, że dane te odzwierciedlają przybliżoną ilość neutrofili, biorąc pod uwagę fakt, że białka takie jak defenzyna-1, LTF, S100-A8 i S100-A9 są również uwalniane do dróg moczowych przez komórki urotelialne. Jednak hierarchiczna analiza klastrowania zoptymalizowana pod kątem kolejności liści białka (HCLPO) wykazała, że białka te klastrowały się ze sobą, wspierając pojęcie dominującej roli neutrofili w ich produkcji (dodatkowy plik 4: Rysunek A1). Peroksydaza eozynofili (EPX) i białko kationowe eozynofili (ECP), które są również efektorami odpowiedzi na patogeny, były o rząd wielkości mniej obfite niż białka pochodzące z neutrofili, nie wspierając w ten sposób głównej roli eozynofili w odpowiedzi zapalnej. Czynnik hamujący migrację specyficzną makrofagów (ang. macrophages-specific migration inhibitor factor, MIF) występował w jeszcze mniejszych ilościach, co wskazuje na Bliski brak makrofagów jako uczestników ostrej odpowiedzi immunologicznej po inwazji patogenów w drogach moczowych.

profile białkowe pokazujące ilościowy udział neutrofili, układu dopełniacza i erytrocytów w całkowitym proteomie próbek osadów moczowych. Wykres pokazuje sumaryczną ilość białka w stosunku do całkowitego proteomu dla trzech biologicznych kategorii białek. Oś x wymienia identyfikatory próbek up związanych ze 110 osobami. Trzy kategorie reprezentują białka wytwarzane przez aktywowane neutrofile (niebieskie), białka silnie wyrażone w erytrocytach i uwalniane po urazie naczyniowym (zielone) oraz białka związane z aktywnością układu dopełniacza i koagulacją (czerwone). Metodą stosowaną do oznaczania ilościowego wszystkich białek jest metoda iBAQ w oprogramowaniu MaxQuant. Kolejność próbek opiera się na obfitości białka neutrofilów, zmniejszając się od lewej do prawej. Aby umożliwić bezpośrednie porównania w celu oceny stanu zapalnego, na grafice powyżej każdego paska przedstawiającego próbkę zamieszczono wynik testu LE. Pod osią x dodatkowy pasek przedstawia, które próbki były związane z identyfikatorem patogenu powodującego UTI (segmenty koloru pomarańczowego), bakterie komensalne (segmenty koloru zielonego) lub brak identyfikatorów bakteryjnych (brak koloru).

obfitość wybranych białek neutrofilowych w próbkach UP. Trzynaście białek wymienionych w legendzie po prawej stronie to białka granulek neutrofili. Trzy inne białka to fibrynogen-β (FGB; zaangażowany w koagulację), podjednostka α-hemoglobiny (HBA1; wskazujące na uszkodzenie naczyń) i uromoduliny (UMOD; obfite w moczu zdrowych dawców). Próbki SA_112 i PM_20 reprezentowały UTIs wywołane odpowiednio przez S. aureus (SA) i P. mirabilis (PM). Profil LG_23 (Lactobacillus) wskazywał na brak stanu zapalnego i reprezentował kolonizację cewki moczowej, być może także niewielkie zanieczyszczenie pochwy próbką moczu. KP_10 (K. pneumoniae) wydawało się reprezentować zakażenie pochwy, ponieważ krwawienie z pochwy zostało klinicznie zdiagnozowane u pacjenta. Profile białkowe EC_13 (UPEC) i KP_55 sugerowały Bliski brak zapalenia, a zatem najprawdopodobniej kolonizację cewki moczowej. Białka oznaczano ilościowo metodą iBAQ, w każdym przypadku dzielono przez zsumowane wartości iBAQ dla całego proteomu UP.

wynik NAD

reprezentacja ilości białka neutrofilów na wykresie fig. 2 pochodzi z wyników NAD (aktywacja i degranulacja neutrofilów) również podanych w (dodatkowy plik 3: Tabela A3). Rysunek 2 zawiera wyniki LE w zakresie od ujemnego (N) do śladowego (T), 1, 2 i 3 dla każdej próbki. Ogólnie rzecz biorąc, obserwuje się silną korelację obficie białek neutrofilów i wyników LE. Wskaźnik le mierzy aktywność esterazy leukocytów, prawdopodobnie reprezentującą głównie elastazę (ELANE) i mieloblastynę (PRTN3), dwie proteazy neutrofilowe, oznaczane ilościowo dla ośmiu próbek na fig.3. Wszystkie profile po lewej stronie wykresu (fig. 2) i pięćdziesiąt trzy z 60 próbek o zawartości białka neutrofilów większej niż 30% (iBAQ) miały wynik LE równy 2 lub 3. 29 Z 40 próbek o zawartości białka neutrofilów mniejszej niż 23% (iBAQ) miało wynik LE w zakresie od ujemnego do 1. W zaledwie czterech z jedenastu przypadków, w których wskaźnik LE wynosił ≥ 2, ale zawartość białka neutrofilów była stosunkowo niska, mikroskopijna liczba leukocytów była większa niż 11 komórek na pole dużej mocy (HPF), próg stosowany do określenia pyurii. W porównaniu z liczbą leukocytów ustalono wartość progową na poziomie 11 komórek/HPF przy ponad 30% (iBAQ) zawartości białka neutrofilów: 14 z 60 przypadków miało liczbę ≤ 10 (dodatkowy plik 3: Tabela A3). Podsumowując, ocena zawartości granulocytów obojętnochłonnych w osadach moczu za pomocą proteomiki wydaje się być co najmniej tak dokładna jak test LE w diagnostyce stanu zapalnego w drogach moczowych. Mierzy on sumę obfitości 35 białek wzbogaconych w neutrofile i może być mniej podatny na fałszywie dodatnie wyniki w porównaniu do testu LE.

obfitość zawartości białka erytrocytów służy jako wskaźnik diagnostyczny urazu naczyniowego

uszkodzenie naczyń w drogach moczowych, zwykle związane z zapaleniem, ocenia się za pomocą testów na obecność hemoglobiny i mikroskopowego liczenia czerwonych krwinek w konwencjonalnej analizie moczu. Biorąc pod uwagę wysokie wzbogacenie różnych białek w erytrocytach, byliśmy w stanie opracować podejście proteomiczne równoważne konwencjonalnym testom krwiomoczu. Oznaczono łączną ilość 32 białek krwinek czerwonych, w tym podjednostek hemoglobiny, białka transportującego aniony pasma 3, białka błony integralnej pasma 7 i anhydrazy węglanowej-1, w stosunku do całkowitej zawartości białka w każdej próbce UP, pokazaną przez zielone segmenty wykresu pokazane na fig.2. Te ilości białka są wymienione jako wyniki ERY w (dodatkowy plik 3: Tabela A3) dla każdej próbki. Nie było dowodów na dobrą korelację wyników testu NAD lub LE z wynikami ERY, co sugeruje, że nawet w przypadkach wykrycia patogenu (pokazanego przez zabarwienie poziomego paska na dole wykresu na fig.2), naciek neutrofili w drogach moczowych nie zawsze pociąga za sobą znaczny krwiomocz i uszkodzenie tkanek. Ustalając progi krwiomoczu na poziomie 2+ dla testu dipstick i 4,5% dla ERY wynik był zgodny wśród 81% wszystkich przypadków. W 21 przypadkach, w których wyniki nie zgadzały się, oceniano mikroskopową liczbę krwinek czerwonych. Wykorzystując liczbę większą niż 10 komórek na pole wysokiej mocy (HPF) jako dowód krwiomoczu, odkryliśmy, że w dwóch trzecich przypadków analiza mikroskopowa była zgodna z danymi proteomicznymi. Wnioskujemy, że proteomiczne wyniki ERY zapewniają dobre ilościowe oszacowanie krwiomoczu w moczu.

próbki moczu wzbogacone w białka związane z aktywnością dopełniacza i koagulacją

zaobserwowaliśmy, że analiza HCLPO zastosowana do wszystkich profili proteomicznych moczu skupiła 21 białek o funkcyjnej roli w szlakach krzepnięcia i/lub układzie dopełniacza (plik dodatkowy 4: Rysunek A1). Uzasadnienie wspólnego pomiaru obfitości białek odnoszących się do tych szlaków zapalnych oparto również na doniesieniach o rozległych interakcjach funkcjonalnych . Zidentyfikowaliśmy 42 białka związane z aktywnością układu dopełniacza i koagulacją (CAC), których zsumowane ilości są uwzględnione jako wynik CAC dla każdej próbki w górę (dodatkowy plik 3: Tabela A3). Układ dopełniacza przyczynia się do reakcji ostrej fazy i odporności wrodzonej, a różne składniki są pro – lub przeciwzapalne. Centralnym składnikiem jest składnik dopełniacza C3. C3 dojrzewa do opsoniny C3B i anafilatoksyny c3a i jest wydzielany do osocza krwi i dróg moczowych po wytworzeniu w komórkach kanalików nerkowych . C3 odgrywa rolę w zakażeniu górnych dróg moczowych oraz wychwytywaniu i zatrzymywaniu UPEC w komórkach uroepitelialnych, prawdopodobnie związanych z klinicznym problemem nawracającego zum . Mimo że ilości białek związanych z aktywnością dopełniacza i koagulacją nie były tak wysokie jak białka neutrofilowe, analiza HCLSO wygenerowała dwa skupiska próbek, sąsiadujące w drzewie i o łącznej liczbie 12 próbek, charakteryzujące się stosunkowo dużą obfitością takich białek (skupiska CAC na fig.1). Klastry CAC ujawniły niewielką liczbę przypadków z identyfikatorem patogenu (3 z 12). Wyniki CAC zostały przedstawione na rysunku 2 przedstawionym przez czerwone segmenty paska każdej próbki (kolumny). Wysokie całkowite ilości białek CAC nie korelowały dobrze z wysokimi ilościami białek neutrofilowych, co sugeruje, że działania zapalne pośredniczone przez układ dopełniacza (np. C3 I C4) i koagulację (np. fibrynogen) mogą być oddzielnie regulowane w przypadku inwazji patogenu lub innych naprężeń, na które narażony był układ moczowy u pacjentów. Duże ilości białka CAC i ERY obserwowano częściej w tandemie. Wiele białek krzepnięcia i dopełniacza jest rzeczywiście obfite w osoczu krwi. Ten płyn ustrojowy wycieka do światła dróg moczowych po urazie naczyniowym. W laboratoriach klinicznych rzadko stosuje się testy moczu odpowiadające pomiarom wyników CAC.

wytrącanie soli kwasu moczowego i powiązanych profili proteomicznych osadu moczu

oględziny 12 próbek UP w klastrach CAC wykazały, że dziewięć próbek moczu było silnie mętnych, a dziesięć granulek moczu stosunkowo dużych o różowym do jasnobrązowego zabarwieniu. Cechy te były związane z wysokim nasyceniem kwasem moczowym i wytrącaniem soli kwasu moczowego, zwłaszcza przy pH poniżej 6, w moczu. Wytrącanie kwasu moczowego może być prekursorem powstawania kamieni moczowych . Rozsądne jest założenie, że mętne pojawienie się próbek przyczyniło się do błędnego zidentyfikowania osadów jako bakterii podczas mikroskopii. Dostępny był tylko jeden zapis kliniczny opisujący występowanie kamieni nerkowych (GV_64). Chociaż profil proteomiczny u tego pacjenta nie był częścią klastra CAC, cechy wizualne próbki wskazywały również mętność i różowo-jasnobrązowy kolor osadu moczu. Zakładamy, że białka stosunkowo obfite w rozpuszczalnej frakcji moczu wiążą się z osadami soli, a zatem przyczyniają się do różnych wzorców obfitości białka w odpowiednich próbkach UP. Rzeczywiście, białka ogólnie rozpuszczalne w moczu i zwykle o niskiej obfitości w granulkach moczu były zwiększone w obfitości w niektórych próbkach klastra CAC w stosunku do kontroli bez dowodów na ZUM i wytrącania soli (LG_21). Przykładami takich białek są γ-łańcuch IgG, AMBP (BIKUNINA) i γ-łańcuch fibrynogenu, jak pokazano na fig. Białka defenzyny – 1 oraz podjednostki HbA1 i HBD hemoglobiny były najsilniej zwiększone pod względem liczebności w porównaniu z danymi dla LG_21. Chociaż wiadomo, że większość białek pokazanych na fig. 4 zwiększa się w moczu i osoczu w wyniku miejscowego uszkodzenia i przyczynia się do reakcji ostrej fazy, dane te wykazały dużą zmienność ilościową. Na podstawie tych danych nie można wywnioskować znaczenia patologicznego, w szczególności uszkodzenia dróg moczowych. Profile proteomiczne zostały niedawno zgłoszone dla matrycy kamieni moczowych . Wśród najczęściej obserwowanych białek w macierzy kamiennej były łańcuchy ciężkie IgG, podjednostki fibrynogenu, S100-A8, lizozym C i LTF, białka również pokazane na rysunku 4. Potrzebne są dalsze badania w celu oceny wartości analizy proteomicznej w celu identyfikacji biomarkerów z próbek moczu zawierających wytrąca się sól, np. w celu oceny ryzyka powstawania kamieni nerkowych.

obfitość wybranych białek w próbkach z objawami wytrącania soli w moczu. Próbki up rozpoczynające się od nm_ (no microbes) nie wykazały dowodów kolonizacji bakteryjnej, ale osady moczu miały wygląd wizualny sugerujący wytrącanie się soli kwasu moczowego i były obecne w dwóch skupiskach CAC. LG_21 (Lactobacillus) reprezentował brak stanu zapalnego. U pacjenta związanego z próbką GV_64 (G. vaginalis) zdiagnozowano kamicę nerkową. Oprócz białek opisanych w legendzie na fig. 3, Inne to składnik dopełniacza C3 (C3), Ceruloplazmina (CP), inhibitor aktywatora plazminogenu-3 (PAI-3), AMBP (BIKUNINA), podjednostka δ hemoglobiny (HBD) i łańcuch γ immunoglobuliny (IG gamma). Wszystkie te białka są zaangażowane w reakcję ostrej fazy, która jest zazwyczaj inicjowana przez uszkodzenie tkanek i inwazję patogenów. Profile próbek wykazują dużą zmienność ilości białka, chociaż w niektórych próbkach wyraźnie zwiększono ilość białek ostrej fazy w porównaniu do kontrolnego LG_21.

kolonizacja cewki moczowej przez bakterie komensalne nie wywołujące odpowiedzi immunologicznej gospodarza

wysoce równoległe technologie sekwencjonowania DNA ujawniły, że mocz nie jest całkowicie sterylny, a pojęcie mikrobiomu moczowego ewoluowało jako interesujący temat badawczy . Jest prawdopodobne, że zewnętrzne części cewki moczowej, zwłaszcza u kobiet, są skolonizowane przez bakterie ze źródeł krocza i pochwy. Jest również oczywiste, że nieoptymalne pobieranie moczu clean-catch od pacjentek może skutkować zanieczyszczeniem moczu białkami i bakteriami komensalnymi z jamy pochwy. Przedstawione tutaj dane można wyjaśnić, ale nie rozróżniają dwóch wyżej wymienionych scenariuszy. Około 25% profili proteomów uzyskiwanych w moczu zostało wzbogaconych o białka wydzielane do moczu w fizjologicznie prawidłowym środowisku (np. uromodulina i cytokeratyny) lub obficie wytwarzane przez komórki nabłonkowe wydzielane przez powierzchnie śluzowe wyściełające drogi moczowe i pochwy. W analizie HCLSO zidentyfikowano cztery klastry (rycina 1), jeden duży klaster z 15 próbkami UP, pochodzący od kobiet z tylko dwoma wyjątkami. Profile wykazały dużą obfitość białek cytoszkieletowych (np. α-aktyn i aneksyn), białek desmosomalnych (np. desmoplakiny i periplakiny) i zrogowaciałych białek obwiedni komórkowej (np. cytokeratyn, kornuliny i małego białka bogatego w prolinę 3). Białka należące do dwóch pierwszych kategorii są obecne w większości typów komórek, w tym w komórkach urotelialnych, podczas gdy stratyfikowany płaskonabłonkowy nabłonek zlokalizowany w cewce moczowej i przewodzie pochwowym obficie wytwarza białka ze wszystkich tych kategorii . Badanie mikroskopowe osadów moczu potwierdziło zwiększoną zawartość płaskonabłonkowych komórek nabłonkowych z wynikiem ≥ 2+ dla większości próbek obecnych w czterech klastrach (dodatkowy plik 3: Tabela A3), określanych jako uromodulina i płaskonabłonkowe klastry komórek nabłonkowych z bakteriami pochwy (USEV) od tego momentu. Uromodulina, białko przyczyniające się do równowagi wodno-elektrolitowej w drogach moczowych , była również obfita w próbkach gromady USEV. Bakterie pochwy (Lactobacillus i G. vaginalis) zidentyfikowano z 22 z 30 próbek, a bakterii nie było w 5 z tych próbek. Dane proteomiczne potwierdziły bardzo niski poziom stanu zapalnego dla klastrów USEV w 74% przypadków zgodnie z wynikami NAD, co wynika z pozycji próbek na rysunku 2. Reprezentatywnym profilem klastra USEV jest LG-23, z wynikiem NAD wynoszącym 20% i małą obfitością białek związanych z zapaleniem, z wyjątkiem defenzyny – 1 i S100A8 (Fig.3). W porównaniu z profilami dla SA_112 i PM_20 wszystkie białka przyczyniające się do zapalenia były mniej obfite w LG_23. G. vaginalis może być oportunistycznym patogenem w drogach moczowych i pochwy. Grupowanie profili białek gospodarza w klastrach USEV, wybranych dla identyfikatorów Lactobacillus, G. vaginalis lub obu gatunków, wskazywało na brak silnej odpowiedzi immunologicznej wobec tych gatunków bakterii. Wnioskujemy, że analiza proteomiczna ma wartość diagnostyczną, dostarczając dowodów na brak infekcji w drogach moczowo-płciowych kobiet.

kolonizacja cewki moczowej przez patogeny oportunistyczne

klastry USEV obejmowały trzy przypadki, w których zidentyfikowano wspólne patogeny dróg moczowych, UPEC i K. pneumoniae. Oba przypadki (EC_13 i KP_55) wykazały niski wynik nad i ERY, co było zgodne z brakiem zapalenia wywołanego neutrofilami i urazem naczyniowym. Względna obfitość białek pokazanych na fig. 3 dla tych dwóch przypadków i ich podobieństwo do wzorca obserwowanego dla LG_23 wspierały pogląd, że odpowiedzi immunologiczne charakterystyczne dla zum nie były wywoływane po kolonizacji przez bakterie. Brak wiedzy na temat odpowiedzi immunologicznej ASB na poziomie molekularnym nie pozwala ocenić, czy te przypadki reprezentują bezobjawową bakteriurię (asb). Podsumowując, dane te wspierają tezę, że profile proteomiczne mogą identyfikować przypadki kolonizacji cewki moczowej przez uropatogeny bez aktywacji wrodzonego układu odpornościowego.

zanieczyszczenie pochwy z dowodami infekcji układu moczowo-płciowego

analiza HCLSO wygenerowała klaster próbki UP, który nazwaliśmy klastrem zanieczyszczenia pochwy (VCO), pokazanym na fig.1. Profile klastra VCO charakteryzowały się dużą obfitością białek obwiedni komórek cytoszkieletowych, desmosomalnych i zrogowaciałych, ale małą lub umiarkowaną ilością uromoduliny, co sugeruje, że zawartość białka w pochwie była zwiększona w tych próbkach. Obliczono wynik VCO, stosunek ilościowy pięciu białek wyrażonych w tkance nabłonka szyjkowo-pochwowego o stosunkowo wysokiej swoistości według bazy danych TiGER w porównaniu z uromoduliną. Białkami tymi były kornifelina, kornulina, Serpina B3, galektyna-7 i proteoglikan mucyna-5B. Cząsteczki prozapalne specyficzne dla neutrofili, takie jak białko S100 – A12 i lizozym (LYZ) oraz białka wskazujące na uszkodzenie naczyń lub reagujące na nie (odpowiednio HBA1 i fibrynogen-β), były bardziej obfite w klastrze VCO w porównaniu do klastra USEv, jak pokazano dla KP_10 w porównaniu do LG_23 na fig. Klaster VCO zawierał 14 próbek, wszystkie z wyjątkiem jednej pochodzącej od pacjentek, z których połowa była powiązana z ID dla uropatogenu. W pięciu próbkach zidentyfikowano G. vaginalis lub Lactobacillus. Dowody kliniczne sugerowały krwawienie z pochwy u chorego w próbce KP_10, potwierdzające rozpoznanie zakażenia układu moczowo-płciowego lub pochwy K. pneumoniae. Wyniki VCO są zawarte w dodatkowym pliku 3: Tabela A3. Test sumy Rang Wilcoxona porównujący wyniki VCO klastrów VCO i USEV dał wartość p równą 0,017, co sugeruje, że wynik jest przydatny do rozróżnienia braku lub nieznacznego od dużego zanieczyszczenia pochwy w próbkach moczu. Nie można dokonać jednoznacznej oceny przydatności wyniku VCO do odróżnienia zum od zakażenia pochwy.

Analiza Proteomiczna osadów moczu identyfikuje drobnoustroje o poziomach czułości i swoistości porównywalnych do tych z hodowli moczu

zidentyfikowaliśmy bakterie z 76 próbek w górę, a Candida albicans z jednej próbki w górę (63% wszystkich analizowanych przypadków). Posiew moczu przeprowadzono tylko w 55 przypadkach, z których 44% zidentyfikowało co najmniej jeden patogen, 24% organizmy komensalne, a 17% nie wykazywało wzrostu drobnoustrojów (dodatkowy plik 3: Tabela A3). W kontekście identyfikacji patogenów dane proteomiczne i wyniki UC nie zawsze były zgodne(Tabela 1). Kilka powodów wydaje się przyczyniać do nieporozumień. Wyzwania interpretacji danych metaproteomicznych w oparciu o zidentyfikowane białka mikrobiologiczne są następujące. Po pierwsze, identyfikatory białek dla mniej popularnych uropatogenów mogą zostać pominięte z powodu braku ich sekwencji białkowych w wyszukiwanej bazie danych. Gatunki bakterii reprezentowane w bazie danych zostały zidentyfikowane za pomocą analizy proteomicznej (K. pneumoniae i E. faecalis) w dwóch przypadkach, ale dane UC sugerowały obecność filogenetycznie bliskich gatunków Enterobacter aerogenes i E. faecium, odpowiednio. Po drugie, drobnoustroje obecne w niskiej obfitości w moczu są trudniejsze do zidentyfikowania w obecności bardzo obfitych drobnoustrojów, zwłaszcza jeśli gatunki drobnoustrojów dzielą rozległą tożsamość sekwencyjną między proteinami ortologicznymi. Profile EC_85 i KP_11 w (dodatkowy plik 5: zbiór danych A1) ilustrują ten problem, a w szczególności dotyczą rodziny Enterobacteriaceae, która powoduje większość wszystkich zum. Niedokładne adnotacje genomowe, np. brakujące geny dla jednego gatunku (obecne w próbce UP) powodują identyfikację białek ortologicznych prawidłowo przypisanych do genomu pokrewnego gatunku (ale nieobecnych w próbce UP). Małe peptydy tryptyczne są identyfikowane w analizie proteomicznej, co sprawia, że nieprawidłowe przypisanie białek przez algorytm wyszukiwania jest bardziej prawdopodobne w przypadkach tożsamości o wysokiej sekwencji. Po trzecie, ID bakterii obecnych w niskiej liczbie w moczu, poniżej ~ 10 000 komórek / mL, w połączeniu z wysokim tłem proteomicznym gospodarza może zostać pominięte, ponieważ białka gospodarza i drobnoustrojów nie są oddzielnie badane przez LC-MS / MS. niska liczba CFU dla organizmów bakteryjnych zgodnie z danymi UC wykazała niższy wskaźnik dopasowania z Proteomicznymi identyfikatorami niż wysoka liczba CFU(dodatkowy plik 3: Tabela A3). W kontraście, proteomic identyfikacje drobnoustroje mieć The zaleta że one kultura-niezależny i że one dostarczać informacja na wirulencja, antybiotykooporność, napotykający stres, i wzrost stan dla utożsamiać patogen. Dwa przykłady ujawniające takie kompleksowe dane znajdują się w (dodatkowy plik 5: Dataset A1). W jednym zbiorze danych (EC_85) profilowano białka UPEC, G. vaginalis i Lactobacillus. W innym zbiorze danych (KP_11) przyczyną zum była K. pneumoniae. Tabela 1 zawiera przegląd porównania testu azotynowego, identyfikującego Enterobacteriaceae w moczu w oparciu o ich zdolność do redukcji azotanów i wyniki UC z danymi proteomicznymi. 90% pozytywnych testów azotynowych rzeczywiście dotyczyło przypadków bakteriurii z UPEC lub K. pneumoniae jako czynnikiem sprawczym i były niezmiennie identyfikowane z metodami proteomicznymi i UC. W przeciwieństwie do analizy proteomicznej, testy azotynowe okazały się nie być wystarczająco czułe, aby zidentyfikować Enterobacteriaceae w dziesięciu przypadkach. Testy azotynowe nie były pozytywne w 21 przypadkach, w których ID z analiz proteomicznych było G. vaginalis. Jeśli chodzi o różnice w ID patogenu za pomocą metod proteomicznych w porównaniu z UC, paciorkowce β-hemolityczne zostały zidentyfikowane w eksperymentach UC w trzech przypadkach, podczas gdy dane proteomiczne sugerowały obecność G. vaginalis. Jak pokazano w tabeli 1, liczba pasujących identyfikatorów dla UPEC i, w mniejszym stopniu K. pneumoniae, była wysoka. Podsumowując, metoda proteomiczna wykazała wyższą czułość niż test azotynowy oraz poziomy czułości i swoistości porównywalne z UC. Wysoki gospodarz proteomiczny tło w mocz próbka zmniejszać wrażliwość dla drobnoustrojowy identyfikacja.