Frontiers in Immunology

wprowadzenie

komórki dendrytyczne (DC) są profesjonalnymi komórkami prezentującymi antygen (APC), które odgrywają kluczową rolę w indukcji i regulacji odpowiedzi immunologicznej, w tym indukcji odpowiedzi cytotoksycznych limfocytów T (CTL). Są one ważnym ogniskiem w opracowywaniu szczepionek przeciwko nowotworom i wielu patogenom, w tym HIV i malarii, gdzie wymagane są odpowiedzi CTL w celu ochrony i zwalczania chorób. DC loaded ex vivo z antygenem nowotworowym (Ag) były podawane jako szczepionki pacjentom z rakiem przez ponad 15 lat. Są dobrze tolerowane i wywołują odpowiedzi immunologiczne, w tym pewne regresje kliniczne, ale wyraźnie można je poprawić (1). Sieć DC zarówno u myszy, jak i u ludzi jest niejednorodna, a wyspecjalizowane podgrupy DC napędzają specyficzne funkcje immunologiczne (2). Nowe osiągnięcia w naszym rozumieniu biologii DC zidentyfikowały podzbiór DC charakteryzujący się ekspresją nowych markerów CLEC9A (DNGR-1) (3, 4) i XCR1 (5, 6) jako ważny dla indukcji odpowiedzi CTL (7). Strategie szczepionek, które dostarczają Ag i aktywatory bezpośrednio do CLEC9A + XCR1+ DC in vivo, obiecują przezwyciężyć wiele problemów logistycznych związanych ze szczepionkami pochodzącymi in vitro, umożliwiając precyzję i specyficzność pożądanej odpowiedzi immunologicznej (8). Tutaj omawiamy biologiczne właściwości CLEC9A + XCR1 + DC, które czynią je tak atrakcyjnymi celami dla szczepionek CTL i nowe podejścia do szczepionek w celu ich ukierunkowania in vivo.

CLEC9A + XCR1 + DC są niezbędne do indukcji CTL

pojawiająca się złożoność sieci DC i optymalny podzbiór DC do target jest pierwszym ważnym czynnikiem przy projektowaniu nowych szczepionek ukierunkowanych na DC in vivo. U ludzi i myszy istnieje wiele podzbiorów DC, które różnią się lokalizacją, fenotypem i wyspecjalizowaną funkcją (2). Można je ogólnie zaklasyfikować jako (i) zapalne DC pochodzące od monocytów (Mo), które rozwijają się z monocytów i są szybko rekrutowane do miejsc stanu zapalnego; (ii) plazmacytoidowe DC (pDC), które są głównymi producentami interferonów typu i (IFN) w odpowiedzi na podwiązanie TLR 7/9 i są kluczowe dla odporności przeciwwirusowej; oraz (iii) konwencjonalne DC (cDC), które można dalej podzielić w zależności od lokalizacji na “rezydujące w limfoidach” i “migrujące” DC (2). DC rezydujący w limfoidach wychwytuje Ag bezpośrednio w tkankach limfatycznych, podczas gdy DC migrujący rezyduje w narządach obwodowych (np. płuco, skóra, i jelito) gdzie chwytają Ag następnie migrują do tkanki limfoidalnej dzielić ich Ag z innymi limfoidalnych rezydent DC, lub przedstawić Ag bezpośrednio do komórek T. W obu lokalizacjach cDC można dodatkowo posegregować na podzbiory ze specjalnymi funkcjami. Coraz więcej dowodów wskazuje na rolę podgrupy cd11b+ cDC myszy w indukcji odpowiedzi limfocytów T CD4+, chociaż podobna rola dla równoważnego ludzkiego podgrupy CD1c + DC nie została jeszcze ustalona (2, 9). Jednak to podgrupa zdefiniowana przez ekspresję receptora lektynopodobnego typu C, CLEC9A i receptora chemokin, XCR1, jest kluczowa dla indukcji odpowiedzi CTL przeciwko nowotworom, wirusom i innym patogennym infekcjom (2, 7).

CLEC9A + XCR1 + DC zostały pierwotnie zidentyfikowane u myszy przez ekspresję markerów CD8a na limfoidalnym rezydencie DC lub CD103 na migrującym DC i są powszechnie określane jako cd8a+ limfoid i CD103 + migrujący DC. U ludzi CLEC9A + XCR1 + DC, powszechnie określane jako CD141 + DC, występują zarówno w tkankach limfatycznych, jak i nie-limfatycznych, w tym w skórze, jelitach, wątrobie i płucach (6, 10-13). CLEC9A i XCR1 ulegają ekspresji wyłącznie przez ten unikalny podzbiór DC w tkankach limfatycznych i nie-limfatycznych obu gatunków, z wyjątkiem niskich poziomów ekspresji Clec9A przez pDC myszy. Ponieważ połączone markery są obecnie najbardziej specyficznym sposobem definiowania tych DC u obu gatunków, w dalszej części opisujemy je jako CLEC9A+XCR1 + DC. Oprócz CLEC9A i XCR1, te DC mają udział w ekspresji białka podobnego do nektyny, Necl2 (14) i TLR3 i są głównymi producentami IFN-λ Po ligacji TLR3 (15). Co ważne, wyróżniają się one w prezentacji krzyżowej, mechanizmie, który umożliwia przetwarzanie egzogennego Ag, takiego jak pozyskiwany z nowotworów i zakażonych wirusowo komórek, i przedstawienie go na MHC I w celu rozpoznania przez CTLs (16).

co sprawia, że CLEC9A + XCR1 + DC jest tak skuteczny przy gruntowaniu CTL?

chociaż inne typy komórek, w tym makrofagi, komórki B i inne podgrupy DC, mogą występować krzyżowo w szczególnych okolicznościach in vitro (17-20), istnieją istotne dowody na to, że CLEC9A+XCR1+ DC są z natury bardziej wydajne w tym procesie in vitro i In vivo (6, 7, 10, 11, 16). Dokładne mechanizmy molekularne nie są poznane, ale rozległe wysiłki zostały jeszcze ujawnione wyspecjalizowane maszyny do prezentacji krzyżowej unikalne dla CLEC9A + XCR1 + DC (16). Istnieje jednak kilka cech tych DC, które łącznie wyjaśniają ich wyższą zdolność do gruntowania krzyżowego pomimo podobnej zdolności absorpcyjnej Ag w porównaniu z innymi podzbiorami DC. Po pierwsze, CLEC9A + XCR1 + DC utrzymują mniej kwaśne pH w endosomach i fagosomach, sprzyjając krzyżowej prezentacji wczesnych pęcherzyków endocytarnych (21) i ułatwiając krzyżową prezentację Ag ukierunkowaną na późne endosomy/lizosomy (20, 22). Po drugie, CLEC9A + XCR1 + DC są bardziej wydajne w translokacji Ag z endosomów / fagosomów do cytozolu w celu uzyskania dostępu do klasycznego szlaku przetwarzania MHC i (23). Po trzecie, CLEC9A, receptor dla włókien aktyny wystawiony na martwe komórki, odgrywa kluczową rolę w dostarczaniu Ag przechwyconego z martwej komórki do gruntowania krzyżowego (24-27). Po czwarte, CLEC9A + XCR1 + DC wyrażają wysokie poziomy TLR3, znanego wzmacniacza gruntowania krzyżowego (28). Wreszcie, konstytutywna aktywacja niefolded-protein-response sensor, IRE-1α, i czynnik transkrypcyjny XBP – 1 Ostatnio pokazywał regulować krzyżową prezentację specyficznie przez CLEC9A+XCR1+ DC (29). Istnieją również dowody na to, że XCR1 i Necl2 biorą udział w aktywacji CTL, chociaż nie bezpośrednio poprzez zwiększenie drogi krzyżowej prezentacji (5, 6, 14). Cechy te stanowią silne uzasadnienie do opracowania technologii, które w szczególności dostarczają Ag do Drogi Krzyżowej prezentacji CLEC9A + XCR1 + DC in vivo.

celowanie w CLEC9A+XCR1+DC in vivo

przeciwciała (Ab) specyficzne dla receptorów powierzchniowych DC, w szczególności receptorów wychwytu Ag, można wykorzystać do dostarczania Ag bezpośrednio do DC in vivo (30). Wybór receptora zależy od jego specyficzności dla podgrupy DC, która ma być ukierunkowana oprócz szlaku przetwarzania i prezentacji Ag stosowanego przez receptor po internalizacji. Różne receptory lektynowe typu C (CLR) zostały wykorzystane w tym celu, a to jest przeglądane gdzie indziej (1, 30), ale dla dostarczania Ag do CLEC9A+XCR1+ DC u myszy, Dec-205 był głównym celem. Podanie Ag za pośrednictwem DEC-205 Ab indukuje zarówno odpowiedź limfocytów T CD4+, jak i CD8+ w obecności adiuwanta i jest lepsze od szczepionek DC obciążonych ex vivo w zapobieganiu wzrostowi guza . Badania kliniczne fazy I/II ukierunkowane na Ny-eso-1 Ag w leczeniu wielu litych nowotworów złośliwych wykazujących ekspresję tego Ag są w toku z wykorzystaniem CDX-1401, w pełni humanizowanego Ab przeciwko DEC-205 (CellDex Therapeutics). U ludzi, DEC-205 jest szeroko wyrażany na wszystkich DC, oprócz komórek B, komórek T i komórek NK. Chociaż wykazano, że CLEC9A+XCR1+ DC, CD1c+ DC, pDC i MoDC przetwarzają i prezentują Ag dostarczone przez DEC-205 do komórek T CD4+ i CD8+ in vitro (20, 31-33), ograniczone bezpośrednie porównania sugerują, że CLEC9A+ XCR1+ DC jest bardziej skuteczny w prezentacji krzyżowej (20). Jest to prawdopodobnie spowodowane preferencyjnym handlem DEC – 205 do późnych endosomów, co zazwyczaj sprzyja przetwarzaniu Ag drogą MHC II (34), jednocześnie umożliwiając krzyżową prezentację przez CLEC9A+XCR1+ DC (20).

atrakcyjnym podejściem jest bardziej szczegółowe dostarczenie Ag do CLEC9A + XCR1 + DC przy użyciu Ab lub ligandów specyficznych dla CLEC9A (3, 4) lub XCR1 (35). Badania wykorzystujące Clec9A do dostarczania Ag u myszy obserwują skuteczne odpowiedzi limfocytów T CD8+ i, co zaskakujące, lepszą odporność limfocytów T CD4 + w porównaniu bezpośrednio z DEC-205, nawet przy braku adiuwantu (3, 4, 36). Kluczowe powody skuteczności celowania w Clec9A obejmują handel wewnątrzkomórkowy, ponieważ Clec9A dostarcza Ag do wczesnych i wtórnych endosomów (27) oraz utrzymywanie się anty-Clec9A Ab w surowicy, co skutkuje przedłużoną prezentacją Ag (36). Określenie oddziaływań molekularnych CLEC9A po internalizacji oraz tego, w jaki sposób wpływa to na agrofag i przetwarzanie, niewątpliwie rzuci światło na podstawy skuteczności celowania w Clec9A.

anty-ludzki CLEC9A Ab może dostarczyć Ag do ludzkiego CLEC9A+XCR1+ DC w celu przetworzenia i prezentacji zarówno do linii limfocytów T CD4+, jak i CD8+ in vitro (37). Zapewnia to dowód zasady i silne uzasadnienie dalszego rozwoju anty-ludzkiego CLEC9A Ab dla szczepionek i bardziej kompleksowo porównać z DEC-205 Ab i innymi podejściami, które dotyczą wielu podgrup DC. Badania takie były ograniczone z powodu trudności w uzyskaniu wystarczającej liczby ludzkich CLEC9A + XCR1 + DC do szczegółowej analizy funkcjonalnej, ale są obecnie możliwe do zrealizowania dzięki opracowaniu nowych humanizowanych modeli mysich, w których rozwijają się funkcjonalne ludzkie CLEC9A + XCR1 + DC i mogą być ukierunkowane za pomocą CLEC9A lub Dec-205 Abs in vivo (38).

adiuwanty do aktywacji CLEC9A+XCR1+DC

wczesne badania kliniczne DC i badania na myszach badające Clec9A lub Dec-205 ukierunkowane na Ab wyraźnie wykazały zapotrzebowanie na aktywację DC w celu wywołania optymalnej odpowiedzi CTL (31, 39). Ligandy TLR są jednymi z najbardziej obiecujących adiuwantów obecnie ocenianych w klinice, a ekspresja różnicowa TLR przez podgrupy DC może głęboko wpłynąć na wybór adiuwanta. Jest to szczególnie ważne w przedklinicznej ocenie szczepionek ukierunkowanych na CLEC9A + XCR1 + DC, ponieważ ekspresja TLR różni się w podgrupach DC myszy i ludzi. Ligand TLR9, CpG, był szeroko stosowany jako adiuwant u myszy, w tym z Clec9A Ab (36) i był oceniany klinicznie, z ograniczonym działaniem niepożądanym, jako adiuwant w chemioterapii nowotworów i szczepionkach ex vivo DC (40). Podczas gdy TLR9 jest szeroko wyrażany u myszy, w tym przez CLEC9A+XCR1+ DC, u ludzi jest ograniczony do PDC (39). Jednak aktywacja ludzkiego pDC przez CpG indukuje duże ilości IFN typu I, które mogą potencjalnie odgrywać ważną funkcję obserwatora dla aktywacji CLEC9A + XCR1 + DC i następnie indukcji odpowiedzi przeciwnowotworowych (41, 42). W przeciwieństwie do ich mysich odpowiedników, ludzki CLEC9A+XCR1+ DC również nie ma ekspresji TLR4, ale wyraża TLR8, który nie działa u myszy (39).

ligand TLR7/8, r848 lub resiquimod, został zatwierdzony przez FDA do stosowania miejscowego i jest obecnie poddawany badaniom klinicznym z użyciem DEC-205 (CDX-1401, CellDex) (43). Aktywuje również CD1c + DC przez TLR8 i pDC przez TLR7. Jego potencjał do stosowania w szczepionkach pozostaje do ustalenia, a badania na myszach wskazują, że jego krótki okres półtrwania i postać preparatu mogą nie być idealne do miejscowego aktywowania DC w celu inicjowania adaptacyjnych odpowiedzi immunologicznych, oraz że jest on związany z ciężkimi działaniami niepożądanymi obserwowanymi w badaniach klinicznych (43).

ligand TLR3, polyI:C, pojawia się jako atrakcyjny adiuwant do połączenia z DC ukierunkowanym Ab, ponieważ ekspresja TLR3 jest zachowana w ludzkim i mysim CLEC9A+XCR1+ DC. PolyI:Stwierdzono, że C jest optymalnym adiuwantem stosowanym w połączeniu z Dec-205 ukierunkowanym na Ab u myszy (44). Pochodne Poli I: C Hiltonol i Ampligen są dobrze tolerowane u ludzi i indukują odpowiedź IFN typu i naśladującą odpowiedź infekcji wirusowej (45). Są one obecnie oceniane w badaniach klinicznych w połączeniu z Dec-205 kierowania Ab (CellDex Therapeutics; NCT00948961).

wniosek

nadal istnieje wielka potrzeba opracowania szczepionek, które wywołują skuteczne odpowiedzi przeciwwirusowe i przeciwnowotworowe CTL. Odkrycie CLEC9A + XCR1 + DC u myszy i ludzi, jako podgrupy specjalizującej się w Krzyżowej prezentacji Ag i krzyżowym CTL, ujawniło obiecujące nowe możliwości projektowania szczepionek. Jednak wkład innych podzbiorów DC w skuteczność tego procesu jest nadal do ustalenia. W związku z tym pozostają pytania: czy bardziej skuteczne jest dostarczanie Ag do CLEC9A + XCR1 + DC, które są najlepiej wyposażone do prezentacji krzyżowej, czy też współdostawienie do innych podzbiorów DC zapewni pomoc? Które receptory najlepiej dostarczą Ag do wymaganych przedziałów wewnątrzkomórkowych, a które adiuwanty najlepiej wzmocnią odpowiedzi immunologiczne? Dotychczasowe badania sugerują, że celowanie w CLEC9A+XCR1+ DC in vivo, wraz z adiuwantami w celu specyficznej aktywacji tych DC, oferuje wielką obietnicę. Postęp humanizowanych modeli myszy pozwalający na rozwój CLEC9A + XCR1 + DC i innych podzbiorów DC, pozwoli odpowiedzieć na te i inne pytania oraz ułatwi tłumaczenie z ławki na łóżko.

Oświadczenie o konflikcie interesów

Mireille H. Lahoud i Kirsteen M. Tullett znajduje się na liście wynalazców wniosków patentowych dotyczących Clec9A. Kristen J. Radford nie ma żadnych konfliktów interesów do zgłaszania.

podziękowania

Mireille H. Lahoud i Kristen J. Radford są wspierane przez granty projektowe z National Health and Medical Research Council of Australia (Nhmrc 604306 i 1025201) i Prostate Cancer Foundation of Australia (PG2110). Kristen J. Radford posiada stypendium NHMRC CDF level 2. Kirsteen M. Tullett jest stypendystą University of Queensland International PhD Scholarship. Prace te były możliwe dzięki wsparciu infrastruktury operacyjnej rządu stanu wiktoriańskiego i rządowi australijskiemu Nhmrc Independent Research Institute Infrastructure Support Scheme.