genomika porównawcza Clostridium bolteae i Clostridium clostridioforme ujawnia specyficzne dla gatunku właściwości genomiczne i liczne przypuszczalne determinanty oporności na antybiotyki

ogólne cechy genomów ujawniają różnice wewnątrzgatunkowe i międzygatunkowe

łącznie stwierdzono od 1 do 21 generowane z połączenia odczytów z Illumina (134 do 185-krotnego pokrycia) dla sześciu szczepów C. bolteae (Tabela 1). Łącznie wygenerowano 10 do 48 stygów (82 do 264-krotne pokrycie) dla sześciu szczepów C. clostridioforme. Całkowita wielkość genomu różniła się w zależności od gatunku i szczepu. Wielkość C. bolteae wahała się od 6159 kb dla szczepu 90a7 do 6480 kb dla szczepu 90B3 z odpowiednio sekwencjami kodującymi DNA 5833 i 6059 (CDSs) oraz czterema genami 16S rRNA. Rozmiar genomu C. clostridioforme był mniejszy, od 5467 kb dla szczepu 90a3 do 5970 kb dla szczepu 90a6 z odpowiednio 5231 do 5916 CDSs i czterema genami 16S rRNA. Drzewo filogenetyczne oparte na sekwencjach 16S rRNA wykazało, że C. bolteae i C. clostridioforme były blisko spokrewnione z C. hathewayi, C. aldenense, C. citroniae, C. saccharolyticum i C. symbiosum, członkami klastra Clostridium XIVa Firmicutes, jak wcześniej donoszono (dane nie pokazano).

genomy C. bolteae i C. clostridioforme są dużymi genomami, w których przeważa nadmiarowość genetyczna (dane nie pokazane). Nadmiarowe geny uczestniczyły w różnych szlakach metabolicznych, w tym w metabolizmie węgla, transporcie, metabolizmie żelaza i biosyntezie aminokwasów. Różnice w liczbie CDSs między genomami odzwierciedlały różnice w redundancji genetycznej bardziej niż zysk lub utrata poszczególnych funkcji. Ponadto, genomy integrują elementy ruchome tj. transpozony, sekwencje Insercyjne, plazmidy lub fagi (integraza, białko kapsyd,…) wskazujące na boczne transfery genów. Niektóre z nich nosiły geny oporności przeciwdrobnoustrojowej (patrz poniżej).

aby zbadać pangenom dwóch gatunków, porównaliśmy 97 210 CDSs uzyskanych z 12 nowo zsekwencjonowanych genomów z pięcioma innymi genomami (C. bolteae BAA613, C. bolteae WAL-14578, C. clostridioforme CM201.1, C. clostridioforme 2149FAA.1 i C. clostridioforme WAL-7855). Wszystkie CDSs były klastrowane przy użyciu algorytmu BlastClust przy wysokiej rozciągliwości, powyżej 90% odcięcia tożsamości sekwencji i 90% nakładania się długości. Znaleziono 10 530 gromad. Tylko 2294 (21,78 %) klastrów podzielono na dwa gatunki.

używając tylko genomów nowo zsekwencjonowanych, oszacowaliśmy Genom rdzeniowy (gatunkowy) i geny (specyficzne dla szczepu) sześciu C. bolteae i sześciu C. clostridioforme (Tabela 1). W sumie 3714 genów tworzyło główny Genom C. bolteae. Liczba genów specyficznych dla tego gatunku wahała się od 73 do 846. U C. clostridioforme 3660 genów zdefiniowało Genom rdzeniowy. W sumie 2409 klastrów podzielono na dwa gatunki; 1305 genów było specyficznych dla C. bolteae, a 1251 dla C. clostridioforme.

C. bolteae 90A7 i 90b8 miały największą liczbę unikalnych genów dla tego gatunku (odpowiednio 735 i 846). C. clostridioforme 90A8, z 1006 (17 %) unikalnych genów miał największą liczbę genów specyficznych dla szczepu w tym badaniu. Szczepy te integrowały dużą liczbę elementów ruchomych. Niektóre unikalne CDSs zostały oznaczone jako transportery lub regulatory. Nieliczne z nich uczestniczyły w mechanizmach obronnych (geny oporności przeciwdrobnoustrojowej..) lub szlaków metabolicznych. Większość z nich, często otoczona CDSs z fagów lub transpozonów, miała nieznane funkcje (dane nie zostały pokazane).

różnice funkcjonalne między gatunkami w genomach podstawowych

wyzwaniem w naszych badaniach było dostarczenie wiarygodnych informacji z genomów projektowych. Dlatego skupiliśmy naszą analizę na genomach rdzeniowych. Klasyfikacja CDSs według systemu Clusters of Orthologous Groups (COGs) pozwoliła dać przegląd funkcji prezentowanych przez oba gatunki. Główne genomy C. bolteae i C. clostridioforme wzbogacono (ponad 7 % całkowitej liczby dopasowanych COG) w kategoriach COG K, E, G i R w stosunku do transkrypcji (309 I 290 CDSs), transportu i metabolizmu aminokwasów (335 I 276 CDSs), transportu i metabolizmu węglowodanów (431 i 425 CDSs) oraz ogólnej predykcji funkcji (366 I 331cdss) (Tabela 2).

natomiast C. bolteae i C. clostridioforme są spokrewnione fenotypowo, wzór funkcji uzyskiwanych przez zmianę cech zębowych różnił się między tymi dwoma gatunkami (Tabela 2). 30 dodatkowych CDSs transportu i metabolizmu nukleotydów (F), 97 CDSs transportu i metabolizmu aminokwasów (E) i 79 CDSs kodujących mechanizmy transdukcji sygnału (T) było specyficznych dla C. bolteae. 40 CDSs kodujących biogenezę ściany/błony komórkowej/otoczki (M), 50 CDSs dla replikacji, rekombinacji i naprawy (L) i 18 CDSs dla transportu i metabolizmu lipidów (I) było specyficznych dla C. clostridioforme. Różnice między szlakami metabolicznymi w C. clostridioforme i C. bolteae wydają się być wystarczająco duże, aby wspierać wytyczanie gatunku.

wśród szlaków węglowodanowych, C. bolteae i C. clostridioforme posiadały różne systemy asymilacji laktozy, które różnią się stanami fosforylacji, metabolitami pośrednimi i bioenergetyką (dodatkowy plik 1: Tabela S1). U obu gatunków stwierdzono geny kodujące β-galaktozydazę, która hydrolizuje laktozę i glukozę oraz galaktozę. Alternatywny szlak kataboliczny laktozy, zależny od laktozy układ fosfotransferazy (lac / cell-PTS) stwierdzono w prawie wszystkich genomach C. bolteae. OPERON lac / cell-PTS, wcześniej opisany w C. acetobutylicum, składa się z genów dla 6-fosfo-β-galaktozydazy, mutazy fosfogliceratowej i transcripcyjnego przeciwnowotworowego przeciwciała lichenan operon oraz dwóch kopii genów dla składników z rodziny laktoza/celobioza IIC, IIB i IIA. W takim układzie laktoza ulega fosforylacji w węglu C-6, A internalizowany 6-fosforan laktozy ulega rozkładowi w 6-fosforanie galaktozy i glukozie przez 6-fosfo-β-galaktozydazę. Ponadto w C. bolteae 90a7 brakowało genu dla 6-fosfo-β-galaktozydazy i genów dla składników rodziny laktoza/celobioza. Jest prawdopodobne, że układ ten, indukowany przez celobiozę lub laktozę i regulowany przez kilka represji (opisanych u innych bakterii Gram-dodatnich), odpowiada za fenotyp laktozy ujemnej U C. bolteae . Korzystając z naszego systemu adnotacji, wykryliśmy galaktozowy represor operon (GalR) wśród regulatorów z rodziny lacI, U C. clostridioforme (wszystkie, z wyjątkiem 90A8), ale nie U C. bolteae. Eksperymenty laboratoryjne są potrzebne, aby określić, w jaki sposób czynniki transkrypcyjne z dwóch gatunków pośredniczą w preferencjach w wykorzystaniu niektórych węglowodanów nad innymi.

inne charakterystyczne cechy obu gatunków to CDSs kodujące metabolity wtórne biosyntezy i transportu oraz katabolizm, które stwierdzono tylko u C. bolteae (Tabela 2).

Co ciekawe, liczba genów kategorii ruchliwości i wydzielania komórek (N) (34 i 18 CDSs) była różna między tymi dwoma gatunkami. Wśród nich znaleźliśmy CDSs kodujące ruchliwość wici uznane za istotne czynniki zjadliwości dla większości patogenów ruchliwych. Ogółem dwadzieścia cztery geny (46 klastrów + 3 sieroty) reprezentowały OPERON flagellarny w genomach C. bolteae. Wśród nich geny flagellin (fliC) i flagellar cap (fliD), jednej z wielu adhezyn powierzchniowych bakterii, ujawniły specyficzność klastra i mikroewolucję. Geny kodujące fliD reprezentowane były przez jeden klaster i dwa dodatkowe geny w C. bolteae 90A7 i 90b8. Sekwencje FliC z C. bolteae 90A9, 90B3 i 90b8 tworzyły jedną grupę, sekwencje z 90A5 i 90b7 skupiały się w innej grupie, A sekwencje z C. bolteae 90a7 pozostały sierotami (unikalnymi genami) po zgrupowaniu (Fig. 1). Były blisko spokrewnione z sekwencjami flagellin C. citroniae i C. hathewayi, innymi Clostridium spp. z grupy XIVa, izolowany sporadycznie od zakażeń u ludzi. Ponadto C. bolteae 90A9 i 90B3 dzieliły drugi operon z zaledwie 19 genów w syntheny, w tym Gen flagelliny (flaA) blisko spokrewniony z genem C. clostridioforme (63% tożsamości). Opierając się na zachowanych resztach L87, Q88, R89 i Q96, krytycznych dla sygnalizacji TLR5 i polimeryzacji flagelliny, przewiduje się, że białka te mają właściwości prozapalne . U C. clostridioforme dwadzieścia genów (57 innych klastrów) zorganizowanych w jeden operon kodowało aparat flagellarny. Sekwencje FlaA z C. clostridioforme należał do grupy filogenetycznej blisko spokrewnionej z sekwencjami flagellina z eubacterium cellulosovens wyizolowanymi z żwacza. Ogólnie rzecz biorąc, geny flagelliny i organizacja loci związane z flagellą różniły się między gatunkami (dodatkowy plik 2: Tabela S2 i dodatkowy plik 3: Tabela S3), co sugeruje, że ruchliwość, chemotaksja i występowanie potencjalnych interakcji z błoną śluzową okrężnicy są specyficzne dla gatunku .

drzewo filogenetyczne genów flagellin. Wartości w węzłach odpowiadały procentom bootstrap uzyskanym z drzew filogenetycznych w oparciu o wielokrotne wyrównanie sekwencji odpowiednio przez ClustalW, Tcoffee lub Promals. Oznaczono nazwy genów oraz numery sierot lub klastrów

różnice gatunkowe w szlakach syntezy maślanu

porównanie całych sekwencji genomu ujawniło, że szlaki syntezy maślanu, które odgrywają kluczową rolę w zdrowiu jelita grubego u ludzi, były obecne u C. bolteae i C. clostridioforme.

oba gatunki były producentami maślanu na różne i komplementarne sposoby (rys. 2, dodatkowy plik 4: Tabela S4). Wszystkie C. clostridioforme, z wyjątkiem 90A8, nosiły locus kodujący szlak acetylo-CoA (z acetylo-CoA do butyrylo-CoA), w tym geny dehydrogenazy beta-hydroksylobutyrylocoa (hbd), tiolazy (thl), krotonazy (CRO), dehydrogenazy butyrylo-CoA (bcd) i dwóch białek przenoszenia elektronów (ETF Alfa, ETF beta) (dodatkowy plik 4: Tabela S4). Tylko, C. bolteae 90A8 i C. clostridioforme 2149FAA.1 zawierała kolejny przypuszczalny bcd (74.9% tożsamości) w ich genomach (dane nie pokazane). Locus skład i układ były podobne do Faecalibacterium prausnitzii, głównego producenta maślanu ludzkiego jelita grubego . U C. bolteae nie stwierdzono szlaku acetylo-CoA. Oba gatunki dzieliły geny dla dwóch dehydrogenazy hydroksy-glutarylo-CoA (HgCoAd) i dekarboksylazy glutakonylo-Coa (Gcd) ze szlaku Glutaranowego, które mogą prowadzić do krotonylo-COA i butyrylo-Coa poprzez geny bcd .

różne drogi syntezy maślanu potencjalnie obecne w genomach C. clostridioforme i C. bolteae. W liniach ciągłych: Znalezione w C. bolteae i C. clostridioforme; w liniach pogrubionych przerywanych: znalezione tylko w C. clostridioforme ; w liniach drobnych przerywanych: znalezione tylko w C. bolteae 90A5 i 90b7 (więcej szczegółów w dodatkowym pliku 4: Tabela S4). Wyświetlane są geny (nazwy białek). Ato, acetylotransferaza acetylo-CoA; BCD, deshydrogenaza butyrylo-Coa; Buk, kinaza maślanowa; But, maślan-acetooctan Coa-transferaza; CRO, krotonaza ; Etf, białko transferu elektronów; GCD, dekarboksylaza glutakonylo-CoA ; HBD, reduktaza Acetoacetylo-CoA ; 4Hbt, 4-hydroksymaślanowa transferaza CoA ; HgCoAd, dehydrogenaza 3-hydroksymaślanowa Coa ; Ptb, butyrylotranferaza fosforanowa; Thl, tiolaza

ostateczna konwersja z butyrylo-CoA do maślanu może być przeprowadzona przez kinazę maślanową (buk) i fosfotransbutyrylazę (ptb) obecną w obu gatunkach (dodatkowy plik 4: Tabela S4). Grupa sekwencji buka z C. clostridioforme rozgałęziała się w sąsiedztwie sekwencji buka z C. citroniae na drzewie filogenetycznym (plik dodatkowy 5: Rysunek S1). Sekwencje buka z C. bolteae tworzyły odrębne grupy monofiletyczne i sekwencje rozmieszczone wśród drzew filogenetycznych, co sugeruje polimorfizm i / lub funkcjonalne odmiany enzymu u tego gatunku. Inne geny dla transferaz ze szlaku lizyny (podjednostka ato—alfa i beta ; transferaza but—octanu Coa), wykryte w pobliżu miejsca maślanu w sześciu genomach C. clostridioforme, mogą być zaangażowane jako enzymy końcowe. Geny ze szlaku 4-aminomaślanowego (4hbt) mogą być inną alternatywą dla końcowego etapu w C. bolteae 90A5, 90B7, WAL14578 i BAA613 .

transferaza butyrylo-Coa:octan Coa (but) szlaku acetylo-CoA, ostatni etap produkcji maślanu dominujący w Clostridium XIVa, nie stwierdzono ani w genomach wspólnego rdzenia, ani w genomach badanych C. bolteae . W jelitach ludzkich, wcześniejsze badania izolatów jelita grubego zdrowych osób wykazały, że ale szlak dominuje . Potrzebne są dalsze badania w celu oceny wpływu produkcji maślanu poprzez szlak Glutaranowy na zdrowie komórek okrężnicy, w szczególności w autyzmie, gdzie C. plemię “bolteae” jest przesadzone .

Identyfikacja determinantów oporności na antybiotyki

geny oporności na leki, które nie zostały rozpoznane przez automatyczną adnotację, zostały zidentyfikowane w badaniach sekwencji homologicznych nad ARDB. Geny oporności przewidywano na poziomie do 40% identyczności (50% dodatnich podstawień) na 70% długości powyżej wartości odcięcia Zwykle zalecanej (patrz lista w tabeli 3). Następnie porównano zawartość genów i genetyczną organizację loci oporności drobnoustrojów sześciu C. bolteae i sześciu C. clostridioforme z wcześniejszymi danymi uzyskanymi z C. clostridioforme CM201.1 w naszym laboratorium.

ponieważ przewidywania oparte na sekwencji mogą potencjalnie zidentyfikować czynniki determinujące, które nie prowadzą do oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe, przeprowadzono badanie wrażliwości w celu uzyskania informacji na temat przewidywanej odpowiedzi bakterii na antybiotyki. Szczepy uwzględnione w tym badaniu wykazały wzorce oporności, w tym ampicylinę, makrolidy, linkomycynę i chinolony, obecnie powszechne u beztlenowców (Tabela 4). Zarówno dane genomowe (CDSs i adnotacje), jak i testy wrażliwości fenotypowej były brane pod uwagę w celu zidentyfikowania determinantów oporności na antybiotyki (tabele 3 i 4). Przeprowadzono również wstępne testy klonowania niektórych genów w celu sprawdzenia ich zdolności do nadawania oporności na antybiotyki (patrz poniżej).

geny oporności na antybiotyki stosowane w leczeniu zakażeń beztlenowych

zidentyfikowano łącznie 76 klastrów i 21 genów specyficznych dla szczepów potencjalnie zaangażowanych w oporność na środki przeciwdrobnoustrojowe (Tabela 3). Obejmuje od 42 do 50 CDSs U C. bolteae i od 48 do 58 CDSs U C. clostridioforme. Od 27 do 42 CDSs na genomy były związane z mechanizmami oporności na leki na beta-laktamy, glikopeptydy, makrolidy, linkozamidy i metronidazol.

siedem klastrów biorących udział w oporności na beta-laktam dzieli się lub stanowi część genomu rdzenia obu gatunków (Fig. 3). W dwunastu genomach rozpoznano trzy rodzaje beta-laktamaz, w tym beta-laktamazę klasy A, beta-laktamazę klasy C, beta-laktamazę Klasy D i kilka metalo-enzymów. Wszystkie badane szczepy, wybrane ze względu na ich oporność na ampicylinę, dzieliły Gen blaCLO1, wcześniej znaleziony w C. clostridioforme CM201.1 (niepublikowany), ale struktura integracyjnego pierwiastka sprzężonego (ICE) obserwowana w CM201.1 nie została znaleziona w nowych sekwencjonowanych genomach. Gen blaCLO1 nadaje oporność na aminopenicyliny i karboksypenicyliny w E. coli, a jego aktywność jest hamowana przez klawulanian i sulbaktam. W beta-laktamazach C. bolteae 90a9, 90B3 i 90a8 zaobserwowano dziewięć zmian aminokwasowych. Ta blisko spokrewniona beta-laktamaza została otoczona sekwencjami insercyjnymi (IS66) i przypuszczalnym genem beta-laktamazy Klasy D (COG 2602) opisanym również w Clostridium sp M62/1 z projektu ludzkiej mikroflory jelitowej (HMP project). Geny dla beta-laktamaz klasy C, wcześniej Znalezione w chromosomach bakterii jelitowych (COG2680), były również obecne w C. plemię bolteae i C. clostridioforme.

Dystrybucja genów oporności na antybiotyki dzieliła się pomiędzy i wewnątrz rdzenia C. bolteae i C. clostridioforme. Geny pokrywające się co najmniej 90% długości i 90% podobieństwa były uważane za homologi. Geny oporności przewidywano na wartości do 40% identyczności (50% dodatnich podstawień) na 70% długości w badaniach sekwencji homologicznych na ARDB. Dla wszystkich C. clostridioforme i niektórych C. bolteae 23s rRNA methyltransferase CFR-like

duża liczba przewidywanych genów (32 CDSs) była zaangażowana w oporność na glikopeptydy (dodatkowy plik 6: rysunek S2). C. clostridioforme 90a8 był pojedynczym szczepem z wszystkimi genami wymaganymi do oporności na glikopeptyd w zgodzie z fenotypem (MIC > 256 mg / l). Oporność na wankomycynę w tym szczepie przypisywano operonowi typu VanB przenoszonemu przez pierwiastek podobny do Tn1549. Niestety, delecja dziesięciu nukleotydów w genie relaksazy Tn1549 prowadzi do niezdolności 90A8 do przeniesienia oporności na wankomycynę in vitro . Inne genomy C. clostridioforme obejmowały część Operonu opornego na wankomycynę typu VanD, ale gen ligazy vanD D-Ala-Lac został zakłócony przez kodon stop prowadzący do ściętego białka (dodatkowy plik 6: rysunek S2). Ponadto brakowało vanH i vanY, które kodują odpowiednio dehydrogenazę d-mleczanową i KARBOKSYPEPTYDAZĘ DD. Podobnie genomy C. bolteae zawierały cztery CDSs, homolog vanRG vanUG vanG vanYG, które tworzyły niekompletny i niefunkcjonalny operon z powodu braku genu racemazy serynowej. Duża liczba CDSs kodujących oporność na glikopeptydy (w tym vanD lub vanG, o których wiadomo, że są chromosomowe i niezbywalne), znaleziona w genomach C. bolteae i C. clostridioforme, sugeruje, że są one częścią całych przodków operonów, które wyewoluowały przy braku selektywnej presji antybiotykowej . Obecność niekompletnego van operon jest intrygująca, ale podobne obserwacje występują u innych beztlenowców żyjących w mikrobiomach, takich jak Clostridium difficile 630 czy Ruminococcus spp., zostały zgłoszone .

homologi do genu adenylotransferazy nadającego oporność na linkozamidy były obecne w genomie rdzenia obu gatunków (Fig. 3). Geny LnuA C. clostridioforme i C. bolteae miały od 70 do 72% identyczności z ortologami znajdującymi się odpowiednio u C. hathewayi i C. citroniae. C. clostridioforme 90B1 i 90a6 nosiły dodatkowy gen lnu (68% tożsamości z LnuA90A5), bez śladów elementów ruchomych. Oporność na linkomycynę jest powszechna u C. bolteae i C. clostridioforme, często związana z opornością na klindamycynę. Białka LnuA obu gatunków wykazują od 51 do 54% tożsamości z LnuA z gronkowca, co sugeruje wspólną funkcjonalność, ale rola genów lnu jest trudna do ustalenia ze względu na obecność innych domniemanych mechanizmów . Podobnie, wszystkie szczepy były oporne na erytromycynę, podczas gdy dwa geny homolog do genu metylazy rybosomu erytromycyny, ermB, przewidywano tylko w genomach C. clostridioforme 90A4 i 90a8. Nadmierna ekspresja wielolekowych pomp wypływowych i makrolidów oraz różnych układów wypływowych specyficznych dla makrolidu-Linkozamidu-Streptograminy B, takich jak MacB, Mefa, VgaA, MsrA/MsrB i CcmA (Tabela 3, dodatkowy plik 7: Rysunek S3), występujących w badanych genomach, może prowadzić do oporności na makrolidy i linkozamid . Ponadto w genomach rdzeniowych każdego z gatunków znaleziono dwa klastry CDSs kodujące acetylotransferazy ksenobiotyczne związane z VatB (48% tożsamości) (Fig. 3). VatB inaktywuje wirginiamycynę, ale tutaj oporność nie została wykryta w testach wrażliwości antybakteryjnej (Tabela 4).

klaster homologów CDSs do genów oporności na metronidazol (nim) wykryto w genomach rdzeniowych obu gatunków, a metronidazol był bardzo aktywny na badanych gatunkach . W Bacteroides fragilis wykazano, że zwiększona ekspresja genów nim, gdy w dalszym ciągu od elementów IS prowadzi do oporności na metronidazol . Wobec braku genów nim, mechanizm nadawania oporności metronidazolowej C. bolteae i C. clostridioforme pozostaje do ustalenia.

nieoczekiwana obserwacja nowych genów oporności

W odniesieniu do innych oporności na leki, dane z genomu ujawniły geny związane z mechanizmami oporności na chloramfenikol i ryfampicynę (Tabela 3). W większości genomów każdego gatunku znaleźliśmy CDSs kodujące acetylotransferazę chloramfenikolową grupy A, która może inaktywować chloramfenikol. Jednak tylko C. bolteae 90B3 i 90b8 były oporne na chloramfenikol. Genom szczepu 90b8 zawierał drugą kopię genu kota przenoszonego przez transpozon podobny do Tn4451 (odpowiednio 96 i 90% identyczności z Tn4451 i Tn4453). Genom 90B3 zawierał homolog CDS do genu CFR kodującego transferazę metylową 23s rRNA w dużym stopniu rozprzestrzeniającą się w bakteriach Gram-dodatnich. Zgodnie z oczekiwaniami, szczep 90B3 był również oporny na florfenikol, tiamulinę i linezolid (MIC = 16 mg/l). Inne 23s metylotransferazy rRNA (podobne do Cfr) cdss wykryto w środowisku bogatym w elementy transpozycyjne (TN 6103-6110-CTn4 ) w genomach C. clostridioforme i C. bolteae 90A5 i 90b7, ale metylacja rRNA nie wydaje się wpływać na wrażliwość na chloramfenikol (Fig. 3).

analiza danych genomowych pozwoliła rozpoznać homologi CDSs do genów ryfampicyny-ADP-rybozylotransferazy (arr) u C. bolteae, ale nie U C. clostridioforme. Nie znaleziono żadnych ruchomych elementów ani śladów ruchomych elementów wokół genów arr sugerujących, że były one rodzime dla tego gatunku. Ta nowa sekwencja Arr rozgałęziała się w pobliżu białek Arr z C. saccharoperbutyloacetonicum i niektórych cyjanobakterii na drzewie filogenetycznym (dodatkowy plik 8: rysunek S4). Odróżniały się one od białek Arr-2 Enterobacteriaceae oraz od białek Arr Mycobacterium i Streptomyces spp.. Wszystkie szczepy, z wyjątkiem 90A7, były wrażliwe na ryfampicynę. W przypadku braku mutacji w rpoB (wiadomo, że są odpowiedzialne za oporność na ryfampicynę), oporność na C. bolteae 90A7 (MIC: 32 mg / l) było prawdopodobnie wynikiem pozytywnej selekcji mutacji w Aar Cbol90A7. Wrażliwość na ryfampicynę innych C. bolteae była prawdopodobnie spowodowana brakiem promotorów przed arr (zgodnie z analizą in silico) lub podstawieniami nukleotydów w arr prowadzącymi do wymiany aminokwasów i czynnościowej inaktywacji (dane nie pokazane).

W odniesieniu do oporności wszystkich szczepów na moksyfloksacynę i cyprofloksacynę, wszystkie szczepy C. bolteae wykazały kilka podstawień w” regionie determinującym oporność na chinolony ” (qrdr) gyrB. Nie znaleźliśmy w tym regionie żadnych substytucji dla gyry, ani nie opisaliśmy tego w białku odpornego na chinolony szczepu epidemicznego, C. difficile 027 . Dlatego też GyrB był prawdopodobnie preferowanym celem uzyskania oporności na chinolony u tych dwóch gatunków. Ponadto we wszystkich szczepach obecnych było kilka CDSs kodujących transportery z membraną wewnętrzną AcrB. Transportery te są częścią pompy wypływu wielolekowego z podziałem oporności-nodulacji, o której wiadomo, że zwiększa wypływ chinolonów u niektórych bakterii Gram-ujemnych . Konieczne są dalsze badania w celu określenia ich wpływu na utratę wrażliwości Clostridium spp. do fluorochinolonów.

ogólnie, podobne profile oporności na antybiotyki u C. bolteae i C. clostridioforme mogą wynikać z różnych mechanizmów.

geny oporności na antybiotyki mniej aktywne lub nieaktywne wobec Clostridium spp

genomy C. bolteae i C.clostridioforme posiadał jedną lub dwie kopie genu fosfatazy undekaprenylopirofosforanowej bacA i 2 do 5 kopii genów pompy wypływu, BCRA, biorących udział w oporności na bacytracyny, w zgodzie z ich niską wrażliwością . Znaleźliśmy również jeden klaster Homologu CDSs do genu reduktazy dihydrofolianowej, dfrA20 (41% tożsamości / 97% długości) Pasteurella multocida w genomie rdzenia obu gatunków, który mógłby wyjaśnić słabą aktywność trimetoprimu na naszych Clostridium spp. . Ponadto C. clostridioforme 90a6 zawierał CDS identyczny z dfrA z Enterococcus faecium. Gen ten wykryty w środowisku bogatym w elementy mobilne jest zgodny z nowym przykładem poziomego przenoszenia między Enterococcus spp. i Clostridiales.

Co ciekawe, genomy C. bolteae lub C. clostridioforme zawierały różne geny oporności przeciwko antybiotykom naturalnie nieaktywnym u tych gatunków. Pięć CDSs było homologami genów fosforylujących, acetylowanych lub adenylylowanych aminoglikozydów. Cztery z tych domniemanych genów oporności wykryto w środowisku elementów ruchomych. Trzy geny, AADE, sat4 i aph(3′)-III, nadające oporność odpowiednio na streptotrycynę, streptomycynę i kanamycynę, zostały znalezione jako część transpozonu wyznaczonego przez dwie kopie IS1182 w C. clostridioforme 90A3 (dwie kopie), 90a6 i 90B1. Wykryty aph(3′)-III był identyczny z APH(3′)-III, częścią opornego na wiele leków plazmidu PF856 z E. faecium , również związanego z domeną wewnętrzną (99% tożsamości) elementu sscmec z Staphylococcus aureus HT20040085. Podobnie, genu Ant(6′)-Ia aminoglikozydowej 6-adenylotransferazy, nadającego oporność na streptomycynę, towarzyszył C. clostridioforme 90A1, 90a3 (2 egzemplarze), 90a4, 90a6 (2 egzemplarze) i C. bolteae 90A7. Gen adenylotransferazy Aad (9′)-b, który pośredniczy w oporności na streptomycynę/spektinomycynę, stwierdzono w C. bolteae 90B3. W genomie C. clostridioforme 90B1 obecne były również dwie kopie Acetylo transferazy AAC(6′)-im. Homologi AAC (6′)-Im, które nadają oporność na tobramycynę i oporność na amikacynę, znaleziono również w E. coli (96% tożsamości), Coprococcus sp, C. difficile i Enterococcus faecium (dane nie pokazane). Ponadto wśród wszystkich szczepów zaobserwowano również trzy CDSs kodujące kinazę aminoglikozydową (APH), o której wiadomo, że jest szeroko rozpowszechniona w bakteriach Gram-dodatnich .

liczne geny oporności na tetracykliny Wykryto również u C. bolteae i C. clostridioforme. Obejmują one zarówno geny wypływu, takie jak tet40, jak i determinanty ochrony rybosomów, takie jak tetO, tetW i tet32, wcześniej zgłaszane jako krążące w mikroflorze jelitowej wśród odległych spokrewnionych bakterii .