Getting CLARITY: Hydrożel process creates transparent brain
CLARITY process: interview with Stanford bioinżynier and psychiatra Karl Deisseroth. Długość: 3:58
“badanie nienaruszonych systemów z tego rodzaju rozdzielczością molekularną i globalnym zakresem-aby móc zobaczyć drobny szczegół i duży obraz w tym samym czasie — było głównym niezaspokojonym celem w biologii i celem, który zaczyna się rozwiązywać”, powiedział Deisseroth.
“ten wyczyn inżynierii chemicznej obiecuje zmienić sposób, w jaki badamy anatomię mózgu i jak zmienia ją choroba”, powiedział Thomas Insel, MD, dyrektor Narodowego Instytutu Zdrowia Psychicznego. “Dogłębne badanie naszego najważniejszego trójwymiarowego narządu nie będzie już ograniczane metodami dwuwymiarowymi.”
nienaruszony mózg dorosłej myszy przed i po dwudniowym procesie CLARITY. Na obrazie po prawej stronie drobne struktury mózgu można zobaczyć słabo jako obszary rozmycia nad słowami “liczba”, “niezbadany”, “kontynent” i ” rozciąga się.”
badania w tym badaniu przeprowadzono głównie na mózgu myszy, ale naukowcy wykorzystali jasność na danio pręgowanym i zachowanych próbkach ludzkiego mózgu z podobnymi wynikami, ustanawiając ścieżkę przyszłych badań próbek ludzkich i innych organizmów.
“jasność obiecuje zrewolucjonizować nasze zrozumienie, w jaki sposób lokalne i globalne zmiany w strukturze i aktywności mózgu przekładają się na zachowanie”, powiedział dr Paul Frankland, starszy naukowiec w dziedzinie neurobiologii i zdrowia psychicznego w Instytucie Badawczym Hospital for Sick Children w Toronto, który nie był zaangażowany w badania. Koleżanka franklanda, starszy naukowiec, dr Sheena Josselyn, dodała, że proces ten może zmienić mózg z “tajemniczej czarnej skrzynki” w coś zasadniczo przezroczystego.
tajemnicze miejsce
kopiec zawiłej szarej materii i przewodów, którym jest mózg, jest złożonym i tajemniczym miejscem. Neurolodzy starali się w pełni zrozumieć jego obwody w ich dążeniu do zrozumienia, jak działa mózg i dlaczego czasami nie.
Karl Deisseroth
klarowność jest wynikiem prac badawczych w laboratorium Deisseroth w celu wyodrębnienia nieprzezroczystych elementów — w szczególności lipidów — z mózgu, a jednocześnie utrzymania ważnych cech w stanie nienaruszonym. Lipidy są cząsteczkami tłuszczowymi znajdującymi się w mózgu i ciele. Zwłaszcza w mózgu pomagają tworzyć błony komórkowe i dają mózgowi znaczną część jego struktury. Lipidy stanowią jednak podwójne wyzwanie dla badań biologicznych, ponieważ sprawiają, że mózg jest w dużej mierze nieprzepuszczalny zarówno dla substancji chemicznych, jak i dla światła.
neurolodzy chcieliby wyodrębnić lipidy, aby odsłonić drobną strukturę mózgu bez krojenia lub sekcji, ale z jednej strony: usunięcie tych ważnych strukturalnie cząsteczek powoduje rozpad pozostałej tkanki.
wcześniejsze badania skupiały się zamiast tego na automatyzacji podejścia do krojenia / sekcji lub w leczeniu mózgu cząsteczkami organicznymi, które ułatwiają penetrację tylko światła, ale nie sond Makromolekularnych. Z wyrazistością zespół Deisseroth przyjął zasadniczo inne podejście.
“wykorzystaliśmy inżynierię chemiczną, aby przekształcić tkankę biologiczną w nowy stan, który jest nienaruszony, ale optycznie przezroczysty i przepuszczalny dla makrocząsteczek”, powiedział Chung, pierwszy autor artykułu.
ta nowa forma powstaje przez zastąpienie lipidów mózgu hydrożelem. Hydrożel jest zbudowany z wnętrza samego mózgu w procesie koncepcyjnie podobnym do petryfikacji, wykorzystując to, co jest początkowo wodnistą zawiesiną krótkich, pojedynczych cząsteczek znanych jako monomery hydrożelowe. Nienaruszony, pośmiertny mózg zanurza się w roztworze hydrożelu, a monomery wlewają tkankę. Następnie, gdy” wyzwalany termicznie ” lub podgrzewany lekko do temperatury ciała, monomery zaczynają się gromadzić w długie łańcuchy molekularne znane jako polimery, tworząc siatkę w całym mózgu. Ta siatka trzyma wszystko razem, ale co ważne, nie wiąże się z lipidami.
dzięki tak wzmocnionej tkance zespół jest w stanie energicznie i szybko ekstrahować lipidy w procesie zwanym elektroforezą. Pozostaje trójwymiarowy, przezroczysty mózg ze wszystkimi jego ważnymi strukturami – neuronami, aksonami, dendrytami, synapsami, białkami, kwasami nukleinowymi i tak dalej – nienaruszony i na swoim miejscu.
idzie lepiej
Zachowując pełną ciągłość struktur neuronalnych, klarowność nie tylko pozwala na śledzenie pojedynczych połączeń neuronowych na duże odległości przez mózg, ale także zapewnia sposób na zebranie bogatych, molekularnych informacji opisujących funkcję komórki, która nie jest możliwa przy użyciu innych metod.
“pomyśleliśmy, że gdybyśmy mogli usunąć lipidy w sposób nieniszczący, moglibyśmy uzyskać zarówno światło, jak i makrocząsteczki do wniknięcia głęboko w tkankę, umożliwiając nie tylko obrazowanie 3D, ale także analizę molekularną 3D nienaruszonego mózgu”, powiedział Deisseroth, który jest profesorem D. H. Chen.
wykorzystując fluorescencyjne przeciwciała, o których wiadomo, że wyszukują i przyłączają się tylko do określonych białek, zespół Deisserotha wykazał, że może on celować w określone struktury w mózgu myszy zmodyfikowanym lub “wyjaśnionym” i sprawić, że te struktury i tylko te struktury będą świecić pod oświetleniem. Naukowcy mogą prześledzić obwody neuronowe w całym mózgu lub głęboko zbadać niuanse okablowania obwodów lokalnych. Mogą zobaczyć relacje między komórkami i zbadać struktury subkomórkowe. Mogą nawet przyjrzeć się związkom chemicznym kompleksów białkowych, kwasów nukleinowych i neuroprzekaźników.
trójwymiarowy rendering oczyszczonego mózgu zobrazowany od dołu (brzuszna połowa). Film o mózgu gryzoni jest dostępny tutaj.
“możliwość określenia struktury molekularnej różnych komórek i ich kontaktów poprzez barwienie przeciwciał jest podstawową zdolnością klarowności, oddzieloną od przezroczystości optycznej, co pozwala nam wizualizować relacje między składnikami mózgu w zupełnie nowy sposób”, powiedział Deisseroth, który jest jednym z 15 ekspertów w “dream team”, który nakreśli cele dla $100 milion brain research initiative ogłoszonej 2 kwietnia przez prezydenta Obamę.
i w jeszcze innej znaczącej zdolności z punktu widzenia badań, naukowcy są teraz w stanie zniszczyć oczyszczony mózg, wypłukując przeciwciała fluorescencyjne i powtarzając proces barwienia na nowo przy użyciu różnych przeciwciał do zbadania różnych celów molekularnych w tym samym mózgu. Ten proces barwienia / odbarwiania może być powtarzany wielokrotnie, autorzy wykazali, a różne zestawy danych wyrównane ze sobą.
otwieranie drzwi
przejrzystość umożliwiła wykonanie bardzo szczegółowej, drobno-strukturalnej analizy nienaruszonych mózgów — nawet tkanek ludzkich, które zostały zachowane przez wiele lat-wykazał zespół. Przekształcanie ludzkich mózgów w przezroczyste, ale stabilne próbki z dostępnym okablowaniem i szczegółami molekularnymi może przynieść lepsze zrozumienie strukturalnych podstaw funkcji mózgu i chorób.
trójwymiarowy widok barwionego hipokampa pokazujący neurony wyrażające fluorescencję (zielone), łączące interneurony (czerwone) i wspierające glię (niebieskie).
poza natychmiastowymi i pozornymi korzyściami dla neuronauki, Deisseroth ostrzegł, że jasność zwiększyła naszą zdolność do radzenia sobie z danymi. “Przekształcenie ogromnych ilości danych w użyteczny wgląd stwarza ogromne wyzwania obliczeniowe, którym trzeba będzie sprostać. Będziemy musieli opracować ulepszone podejście obliczeniowe do segmentacji obrazu, rejestracji obrazu 3-D, automatycznego śledzenia i akwizycji obrazu”, powiedział.
rzeczywiście, takie naciski wzrosną, ponieważ jasność może zacząć wspierać głębsze zrozumienie nienaruszonych układów i narządów biologicznych na dużą skalę, być może nawet całych organizmów.
“szczególnie interesujące dla przyszłych badań są relacje wewnątrzsystemowe, nie tylko w mózgu ssaków, ale także w innych tkankach lub chorobach, dla których pełne zrozumienie jest możliwe tylko wtedy, gdy można przeprowadzić dokładną analizę pojedynczych, nienaruszonych systemów”, powiedział Deisseroth. “Przejrzystość może mieć zastosowanie do każdego systemu biologicznego i będzie interesujące zobaczyć, jak inne gałęzie biologii mogą ją wykorzystać.”
inni współautorzy to Studentka Jenelle Wallace; graduate studentsSung-Yon Kim, Kelly Zalocusky, Joanna Mattis, Aleksandra Denisin i Logan Grosenick; asystenci badawczy Sandhiya Kalyanasundaram, Julie Mirzabekov, Sally Pak i Charu Ramakrishnan; uczeni postdoctoral Aaron Andalman, PhD, i Tom Davidson, PhD; były student Hannah Bernstein; i były pracownik Naukowiec Viviana Gradinaru.
badania były wspierane przez Narodowy Instytut Zdrowia Psychicznego (grant MH099647); National Science Foundation; The Simons Foundation; prezydenta i Rektora Uniwersytetu Stanforda; Wiegers, Snyder, Reeves, Gatsby i YU fundacje; DARPA REPAIR program; i Burroughs Wellcome Fund.
Wydział jest wspólnie prowadzony przez Szkołę Inżynierską i szkołę medyczną.
