Hybrydyzacja Kolonii
hybrydyzacja Kolonii rozpoczyna się od hodowli słabo zaludnionych kolonii bakteryjnych na płycie agaru odżywczego. Kolonie te są symetrycznie replikowane na filtrze nitrocelulozowym przez bezpośredni kontakt, po czym komórki na błonie filtra są lizowane, a ich DNA jest denaturowane, co pozwala na wiązanie się z filtrem. Te klastry DNA są następnie hybrydyzowane do pożądanego radioaktywnie znakowanego RNA lub sondy DNA (wybranej specjalnie wcześniej) i przesiewane za pomocą autoradiografii. Klastry DNA, które wykazują pożądany Gen, są następnie dopasowywane do odpowiednich (żywych) kolonii bakteryjnych, które mogą być izolowane w celu dalszego wzrostu i eksperymentów.
definicja hybrydyzacji Kolonii: – hybrydyzacja Kolonii to “technika analizy Blot”, w której komórki bakteryjne są przenoszone ze stałego pożywki do materiału absorbującego. Hybrydyzacja Kolonii może być zdefiniowana jako metoda izolacji określonych sekwencji DNA lub genów z komórek bakteryjnych zawierających Hybrydowy DNA, za pomocą nitrocelulozowego filtra membranowego. Medium przenoszące przechodzi następnie kilka procesów chemicznych i fizycznych.
medium przenoszące hybrydyzacji Kolonii:-nitrocelulozowy papier filtracyjny jest medium przenoszącym hybrydyzacji kolonii, które tworzy repliki płyty głównej. Nitroceluloza działa jak błona, która zawiera dokładne kopie genu do płytki wzorcowej. Nitrocelulozowy papier filtracyjny działa jako”podkładka bibułowa”.
hybrydyzacja Kolonii obejmuje następujące etapy:
przygotowanie płyty głównej:- Najpierw zaszczepić zawiesinę komórek bakteryjnych na stałym podłożu agarowym, aby przygotować płytę główną. Po zaszczepieniu liczba kolonii bakteryjnych rozwinie się z różnymi plazmidami, które odnoszą się do “płytki wzorcowej lub referencyjnej”.
Tworzenie replik nad filtrem nitrocelulozowym: – następnie przenieść komórki bakteryjne z płytki głównej na membranę lub filtr za pomocą “filtra nitrocelulozowego”. Nacisnąć nitrocelulozowy papier filtracyjny na powierzchnię płyty głównej. Ta kompresja membrany filtra utworzy repliki lub kopie komórek bakteryjnych, jak na płytce głównej.
obróbka medium filtracyjnego za pomocą SDS: – następnie potraktuj nitrocelulozową bibułę filtracyjną detergentem, takim jak SDS (siarczan dodecylu sodu), aby zsynchronizować komórki bakteryjne.
obróbka podłoża filtracyjnego alkaliami: – potraktować podłoże filtracyjne alkaliami jak wodorotlenek sodu w celu oddzielenia DNA na pojedyncze nici.
utrwalanie DNA na podłożu filtracyjnym:- Aby przymocować DNA do nitrocelulozowego papieru filtracyjnego, albo piec papier filtracyjny w temperaturze 80 stopni Celsjusza lub wystawić na działanie światła UV.
dodanie sondy radioaktywnej: – Hybrydyzować nitrocelulozowy papier filtracyjny zawierający odciski plazmidu DNA przez dodanie radioaktywnej sondy RNA. Ta radioaktywna sonda RNA koduje pożądany Gen sekwencji z komórek bakteryjnych.
mycie i Autoradiografia: – umyć papier filtracyjny w celu usunięcia niezwiązanych cząstek sondy. Następnie wystawić nitrocelulozowy papier filtracyjny na film rentgenowski metodą zwaną “Autoradiografią”. Kolonia, która pojawi się po autoradiografii, będzie określana jako “Autoradiogram”, który nosi interesujące geny.
Identyfikacja pożądanego genu: – następnie porównaj opracowany autoradiogram z płytką główną, aby zidentyfikować kolonie zawierające interesujący Gen.
komórki, które zawierają pożądany Gen, mogą rosnąć w ciekłym środowisku i mogą dalej przetwarzać izolację rekombinowanego plazmidu DNA.
wnioski:- Dlatego możemy stwierdzić, że metoda hybrydyzacji kolonii jest “techniką przesiewową”, która wykorzystuje sondę radioaktywną. Znakowana radioaktywnie sonda następnie przesiewa lub izoluje konkretny gen z liczby kolonii bakteryjnych.
