in Vitro ocena srebra koloidalnego pod kątem funkcji immunologicznej: aktywność Antylymphoproliferacyjna

Streszczenie

srebro koloidalne (AgC) jest obecnie używane przez ludzi i może być internalizowane poprzez inhalację, wstrzyknięcie, spożycie i kontakt ze skórą. Istnieją jednak ograniczone informacje na temat aktywności immunologicznej; potrzebne są dalsze badania z użyciem srebra koloidalnego. W niniejszym badaniu, skutki AgC (17.5 ng/mL) w zakresie parametrów immunologicznych (proliferacja i immunofenotypowanie) z wykorzystaniem jednojądrzastych komórek ludzkiej krwi obwodowej (PBMC) i makrofagów (fagocytoza) oraz cytotoksyczności w liniach komórek nowotworowych białaczki i chłoniaka (1,75 do 17,5 ng/mL). Stwierdzono, że AgC znacząco () zmniejsza wytwarzanie i proliferację interleukiny-2 (IL-2) indukowaną przez fitohemaglutyninę lub konkanawalinę A w PBMC, nie wpływając na żywotność komórek, ale wykazując działanie cytotoksyczne na komórki nowotworowe. Wytwarzanie cytokin IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, INF-γ i Il-17a oraz fenotypów CD3+, CD3−CD19+, CD3+CD4+, CD3+CD8+ i CD16+CD56+ PBMC nie miało wpływu na AgC. Niniejsze badanie pokazuje, że srebro koloidalne jest nieszkodliwe i nietoksyczne dla komórek układu odpornościowego, a jego zdolność do zakłócania odpowiedzi immunologicznej poprzez zmniejszenie proliferacji komórek po stymulowaniu mitogenami wykazała potencjał antylimfoproliferacyjny AgC.

1. Wprowadzenie

bioaktywność substancji została przebadana w celu identyfikacji właściwości związanych z działaniem przeciwnowotworowym lub antyproliferacyjnym . Produkty o tej aktywności zostały wykorzystane w praktyce klinicznej do leczenia raka lub chorób związanych z zapaleniem, takich jak autoimmunizacja. Wyroby ze srebra są używane od tysięcy lat do celów higienicznych i jako środki przeciwdrobnoustrojowe. Od 1964 r .srebro koloidalne (AgC) jest zarejestrowane jako materiał biobójczy w Stanach Zjednoczonych ; w Meksyku AgC jest powszechnie stosowany jako środek dezynfekujący wody i żywności przeznaczonej do spożycia przez ludzi. Ogólnie rzecz biorąc, produkty te są mieszaniną nanocząstek metalicznych o stanie utlenienia zerowym (Ag+0) i soli srebra o stanie utlenienia Ag+1, +2 lub +3 . Istnieją badania wskazujące, że właściwości antybakteryjne i przeciwnowotworowe zależą od Stanów utleniania srebra . Nanocząstki srebra (AgNPs) i jony srebra (Ag+) mają różne poziomy toksyczności ze względu na ich powierzchowne interakcje z ładunkiem. Jony srebra są bardziej toksyczne, ponieważ mogą oddziaływać z ujemnymi grupami białek, wytwarzając zmiany strukturalne na błonie komórkowej i białkach cytoplazmatycznych, podczas gdy AgNPs może oddziaływać z DNA, powodując uszkodzenia i blokowanie strukturalne; niektóre badania sugerują, że te nanostruktury mogą powodować zwiększoną toksyczność w długich czasach ekspozycji ze względu na fakt, że AgNPs w roztworach wodnych może utleniać i uwalniać jony srebra; skuteczne zastosowanie koloidalnych roztworów srebra można wyjaśnić tym mechanizmem działania . Działanie przeciwnowotworowe AgC na komórkach nowotworowych MCF-7 jest prawdopodobnie spowodowane indukowaną apoptozą poprzez zmniejszenie dehydrogenazy mleczanowej i zwiększenie aktywności dysmutazy ponadtlenkowej; w przeciwieństwie do tego, w PBMC, aktywność dehydrogenazy mleczanowej zmniejszyła się wraz z AgC, ale nie korelowała ze śmiercią komórki . Istnieje niewiele informacji naukowych na temat parametrów immunologicznych i nowotworowych u ludzi dotyczących wpływu srebra koloidalnego, jako mieszanki nanocząstek i jonów, w porównaniu do badań nad nanocząstkami srebra. Celem niniejszego badania było zbadanie właściwości antyproliferacyjnych srebra koloidalnego i jego wpływu na immunofenotypowanie komórkowe, produkcję cytokin i fagocytozę PBMC.

2. Materiały i metody

2.1. Srebro koloidalne (AgC)

srebro koloidalne stabilizowane Grenetyną zostało zakupione od MICRODYN (México) jako 0,35% roztwór podstawowy. Sterylizowano go przez filtrację (filtr 0,2 µm, Millipore, USA) i rozcieńczono do stężenia 10,5 µg/mL RPMI-1640, uzupełniono 10% FBS do testów in vitro.

2.2. Odczynniki

Fitohemaglutynina (stosowana w dawkach 5 µg/mL) i konkanawalina A (stosowana w dawkach 5 µg / mL) zostały zakupione w firmie Sigma-Aldrich (St.Louis, MO, USA). Doksorubicynę (LEMERY S. A. de C. V., México) przechowywano w postaci roztworu podstawowego 3,4 mM w RPMI 1640 w temperaturze pokojowej, a LPS (E. coli 0111:B4, Sigma-Aldrich) otrzymywano w dawce 10 ng/mL w leczeniu jednojądrzastych komórek ludzkiej krwi obwodowej.

2.3. Charakterystyka AgC

morfologię srebra koloidalnego badano za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego sem (Nova NanoSEM200 FEI). Roztwór koloidalny (50 µL) umieszcza się na taśmie węglowej i suszy w temperaturze pokojowej. Pomiary wielkości i rozkładu nanocząstek oznaczono za pomocą dynamicznego rozpraszania światła (DLS) wykonywanego przez nanozyzer NS 90 Malvern Instruments (Malvern Instruments, Wielka Brytania); rozkłady wielkości podane przez DLS były zgłaszane jako procent intensywności, a wyniki przedstawiono jako średnią wartość co najmniej trzech pomiarów. Plazmon rezonansowy mierzony UV-vis obserwowano w zakresie od 300 do 600 nm przy użyciu spektrofotometru NanoDrop 2000 (Thermo Fisher Scientific).

2.4. Izolację jednojądrzastych komórek krwi obwodowej (PBMC)

krwi zdrowych ochotników uzyskano strzykawkami z heparyną i umieszczono w sterylnych probówkach polipropylenowych. Następnie wyizolowano PBMC z Histopaque 1,077 odwirowaniem gradientu gęstości przy 400 g przez 30 minut w temperaturze 25°C (Sigma-Aldrich). PBMC przemyto dwukrotnie pożywką RPMI 1640 uzupełnioną 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% roztworem antybiotykowo-antymikotycznym (zwanym kompletnym pożywką rpmi) w 250 g przez 10 minut w temperaturze 25°C.

2,5. Żywotność komórek

PBMC dostosowano do 1 × 106 komórek/mL w pełnym pożywce RPMI i dodano 17,5 ng/mL srebra koloidalnego i inkubowano przez 72 godziny w 37°C i 5% atmosferze CO2. Następnie supernatant usunięto przez odwirowanie w temperaturze 250 g. następnie komórki przemyto dwukrotnie kompletnym pożywką RPMI. Żywotność komórek określono metodą redukcji MTT metodą kolorymetryczną, a gęstości optyczne wynikające z produkcji formazanu odczytano przy 570 nm. Żywotność komórek wyrażono jako procent żywotności w porównaniu z grupą kontrolną nieleczoną. Wyniki podano jako średnią ± SD trzech niezależnych eksperymentów.

linie komórek nowotworowych k562 (przewlekła białaczka szpikowa), MOLT-4 (ostra białaczka limfoblastyczna), Ramos (chłoniak Burkitta) i L5178Y (chłoniak) zostały zakupione z kolekcji American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA) i utrzymywane w pełnym pożywce RPMI. Komórki hodowano w temperaturze 37°C i 5% atmosfery CO2. Linie komórek nowotworowych (5 × 103 komórki/studzienkę) platerowano na 96-studzienkowych płytkach i inkubowano przez 24 godziny w 37°C w 5% atmosferze CO2.

po inkubacji usunięto podłoże hodowlane i dodano srebro koloidalne w stężeniach od 1,75 do 17,5 ng/mL. Następnie płytki inkubowano przez 5 godzin w temperaturze 37°C i 5% atmosferze CO2. Następnie supernatant usunięto i komórki przemyto dwukrotnie pożywką RPMI 1640. Żywotność komórek oznaczono metodą wykluczenia błękitu trypanu, a cytotoksyczność wyrażono jako hamowanie wzrostu komórek 50% (LD50) i 100% (LD100) w porównaniu z nieleczoną kontrolą. Wyniki podano jako średnią ± SD trzech niezależnych eksperymentów.

2.6. Test cytokin

Supernatanty z PBMC leczonych AgC analizowano pod kątem poziomów cytokin. IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IFN-γ, TNF-α i Il-17A oznaczano za pomocą cytometrii przepływowej (Accuri C6, BD Bioscience, CA, USA), stosując zestaw cytokin CBA Th1/Th2/Th17 BD™ (BD Bioscience, Bedford, MA, USA), zgodnie z instrukcjami producenta. Analiza CBA Flex Set została przeprowadzona przy użyciu oprogramowania fcap array v1 .0 (Soft Flow Inc., USA). Wartości białka zostały przekształcone do standardów białka NIBSC / WHO w celu dalszych porównań.

2.7. Proliferację i test IL-2

PBMC wyizolowano przez odwirowanie gradientu gęstości Histopaque, przemyto trzy razy PBS i zawieszono w rozcieńczalniku C w dawce 106 komórek / mL. Zawiesinę komórkową następnie rozcieńczono tą samą objętością 2,5 mM barwnika PKH26 (Sigma, St. Louis, MO)przygotowanego w rozcieńczalniku C, inkubowano przez 3 minuty w temperaturze pokojowej, następnie dodano do równej objętości FBS i inkubowano w temperaturze pokojowej przez kolejne 2 minuty, aby zatrzymać etykietowanie, zgodnie z “Rymaniol et al., 2003 .”Następnie skorygowano PBMC w stężeniach 1 × 106 komórek/mL, potraktowano srebrem koloidalnym w stężeniu 17,5 ng/mL, PHA lub Con A i inkubowano przez 72 godziny w temperaturze 37°C i 5% atmosferze CO2; proliferację komórkową oznaczono za pomocą cytometrii przepływowej. Ilości zawartości IL-2 w supernatantach PBMC mierzono za pomocą zestawu ELISA wysokiej czułości ludzkiej IL-2 (granica wykrywalności 0,4 pg/mL) i stosowano zgodnie z instrukcją producenta (eBiosciences, Wiedeń, Austria).

2.8. Oznaczanie produkcji azotynów/azotanów

poziomy azotynów i azotanów mierzono kolorymetryczną reakcją Griesa z wykorzystaniem reduktazy azotanowej (zestaw do oznaczania azotanów/azotynów kolorymetrycznych Cayman, USA) zgodnie z instrukcjami producenta. Stężenie azotynów/azotanów w surowicy wyrażono jako nM / 200 µL.

2.9. Analiza cytometrii przepływowej antygenów powierzchniowych komórek

PBMC dostosowano w stężeniach 1 × 106 komórek / mL i potraktowano srebrem koloidalnym w stężeniu 17,5 ng / mL, a płytki inkubowano przez 72 godziny w 37°C i 5% atmosferze CO2. Następnie komórki pobierano przez odwirowanie w 600 g przez 10 minut i dodano jeden zestaw przeciwciał CD3+ FITC/CD8+, PE/CD45+ i PerCP/CD4 APC lub inny zestaw przeciwciał CD3+ FITC/CD16+, CD56 PE/CD45 i PerCP/CD19 APC (BD Multitest IMK Kit) i inkubowano przez 15 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Erytrocyty następnie lizowano przez dodanie 450 µL roztworu do lizowania 1x BD FACS™ i inkubowano przez 15 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Próbki były następnie gotowe do analizy na cytometrze. Akwizycja została przeprowadzona na instrumencie Accuri C6 BD przy użyciu oprogramowania BD Multiset z oprogramowaniem BD Worklist Manager. Zautomatyzowane bramkowanie zostało użyte do łatwej analizy każdej podgrupy populacji.

2.10. Pobór FITC-dekstranu

komórki dendrytyczne (DCs) zostały wytworzone z PBMC i mogły przylegać do kolb kulturowych z filtrem 0,22 µm (TPP, Niemcy). Po 2 godzinach w temperaturze 37°C komórki nieadherentne usunięto, a przylegające monocyty hodowano następnie przez 5 dni w RPMI-1640 uzupełnionym 10% FBS i 800 J./mL rhuGM-CSF (Peprotech, México) i 50 ng/mL IL-4 (Peprotech, México). Następnie komórki potraktowano srebrem koloidalnym w stężeniu 17,5 ng / mL i inkubowano przez 72 godziny w temperaturze 37°C i 5% atmosferze CO2. Endocytozę DCs oceniano przez inkubację 1 × 106 komórek z 1 mg/mL FITC-dekstranu (BD) przez 30 minut w temperaturze 37°C. Po umyciu komórki analizowano metodą cytometrii przepływowej. Grupa kontrolna obejmowała probówki inkubowane z FITC-Dekstranem w temperaturze 4°c w celu zahamowania procesu endocytarnego i wychwytu podstawowego przeprowadzonego w punkcie zerowym. Wychwyt określono ilościowo za pomocą analizy FACS (10 000 komórek na punkt) . Żywotność została określona przez technikę wykluczenia błękitu trypana.

2.11. Analiza statystyczna

wyniki oceniono na podstawie ANOVA i porównano medianę poziomów cytokin pomiędzy zabiegami przy użyciu testu Manna-Whitneya.

3. Wyniki

3.1. Charakterystyka srebra koloidalnego

charakterystyka srebra koloidalnego rozpuszczonego w wodzie i pożywce do hodowli komórkowej analizowano za pomocą dynamicznego rozpraszania światła (DLS); srebro koloidalne rozpuszczone w wodzie wykazało średnią wielkość 100 nm ze wskaźnikiem polidyspersyjności 0,2; srebro koloidalne rozpuszczone w pożywce do hodowli komórkowej wykazało średnią wielkość 155 nm i wskaźnik polidyspersyjności 0,23 (Fig.1(A) i 1(b)). Zdjęcie sem pokazało populację cząstek rozpuszczonych w wodzie o wielkości cząstek od 50 do 190 nm (Fig. 1 (c) i 1(d)); srebro koloidalne rozpuszczone w pożywce do hodowli komórkowej wykazało połączenie nanocząstek i niektórych soli srebra (Fig. 1 (e) i 1 (f)); jednak średnia wielkość uzyskana przez DLS korelowała z histogramem cząstek i charakterystycznym rezonansem plazmonowym(Fig.1(g), 1(h) i 1 (i)). Analiza srebra koloidalnego sugeruje, że roztwór ten ma kształt półsferyczny i niejednorodną populację, utworzoną przez nanocząstki i skupisko utworzone przez sole srebra. Po scharakteryzowaniu AgC przystąpiliśmy do oceny różnych efektów biologicznych.

Rysunek 1

rozkład wielkości srebra koloidalnego. (a) DLS srebra koloidalnego rozpuszczonego w wodzie wykazały średnią wielkość 100 nm ze wskaźnikiem polidyspersyjności 0,2. B) pomiary DLS srebra koloidalnego rozpuszczonego w pożywce do hodowli komórkowej o średniej wielkości 155 nm i wskaźniku polidyspersyjności 0,23. (c, d) sem obraz cząstek rozpuszczonych w wodzie. (e, f) obraz SEM srebra koloidalnego rozpuszczonego w pożywce do hodowli komórkowej. (G, h) Histogram cząstek rozpuszczonych odpowiednio w wodzie i pożywce hodowlanej. (i) widma UV-vis srebra koloidalnego. J) sole srebra utworzone w próbkach srebra koloidalnego rozpuszczonego w pożywce hodowlanej. DLS, dynamiczne rozpraszanie światła; SEM, skaningowa mikroskopia elektronowa; i a.u., dowolne jednostki.

3.2. Oznaczanie proliferacji komórkowej i produkcji IL-2

na początku ustaliliśmy, czy dawka cytotoksyczna poprzednio stosowana w komórkach raka piersi wpływa na limfocyty lub funkcje makrofagów. Wyniki wykazały, że leczenie srebrem koloidalnym nie miało znaczącego wpływu () na proliferację i liczbę komórek PBMC, a leczenie mitogenami Con A lub PHA znacząco () zwiększyło proliferację i liczbę komórek w porównaniu z nieleczoną kontrolą; co ciekawe, połączone leczenie AgC/Con A lub AgC/PHA znacząco () zmniejszyło proliferację i liczbę komórek (fig.2 i 3) PBMC. Podobne wyniki zaobserwowano przy użyciu cytometrii przepływowej i mikroskopii fluorescencyjnej przy użyciu barwnika fluorescencyjnego PKH26 (control (94%), Con A (165%), PHA (156%), AgC (91%), AgC + Con A (80%) i AgC + PHA (77%)) (Fig.3, 4 i 5). Ponadto leczenie AgC nie miało wpływu na produkcję IL-2 w porównaniu z grupą kontrolną (15 pg/mL) (), ale stwierdzono wzrost produkcji IL-2, gdy PBMC stymulowano PHA (176 pg/mL) lub Con A (150 pg/mL), a leczenie AgC + Con a (15 pg/mL) lub AgC + PHA (13 pg/mL) zmniejszyło produkcję IL-2 () (ryc. 4).

Rysunek 2

żywotność komórek PBMC poddanych działaniu srebra koloidalnego i mitogenów. PBMC (1 × 106 komórek/mL) potraktowano Con a (5 µg/mL), PHA (5 µg/mL), AgC (17,5 ng/mL), AgC (17,5 ng/mL) + Con a (5 µg/mL) lub AgC (17,5 ng/mL) + PHA (5 µg/mL) i inkubowano przez 72 godziny w 37°C i 5% atmosferze CO2. Żywotność komórek analizowano metodą MTT. Dane przedstawiają średnie ± odchylenie standardowe trzech niezależnych eksperymentów. . AgC, srebro koloidalne; PHA, fitohemaglutynina; i Con A, konkanawalina A.

Rysunek 3

liczba komórek PBMC poddanych działaniu srebra koloidalnego i mitogenów. PBMC (1 × 106 komórek/mL) potraktowano Con a (5 µg/mL), PHA (5 µg/mL), AgC (17,5 ng/mL), AgC (17,5 ng/mL) + Con a (5 µg/mL) lub AgC (17,5 ng/mL) + PHA (5 µg/mL) i inkubowano przez 72 godziny w 37°C i 5% atmosferze CO2. Liczbę komórek analizowano metodą cytometrii przepływowej. Dane przedstawiają średnie ± odchylenie standardowe trzech niezależnych eksperymentów. . AgC, srebro koloidalne; PHA, fitohemaglutynina; i Con A, concanavalin A.

Rysunek 4

proliferacja komórkowa i produkcja IL-2 PBMC traktowana srebrem koloidalnym i mitogenami. PBMC (1 × 106 komórek/mL) potraktowano Con a (5 µg/mL), PHA (5 µg/mL), AgC (17,5 ng/mL), AgC (17,5 ng/mL) + PHA (5 µg/mL) lub AgC (17,5 ng/mL) + Con a (5 µg/mL) i inkubowano przez 72 godziny w 37°C i 5% atmosferze CO2. Proliferację komórkową na podstawie ekspresji PKH26 analizowano metodą cytometrii przepływowej. Supernatanty IL-2 oceniano za pomocą testu ELISA. Dane przedstawiają średnie ± odchylenie standardowe trzech niezależnych eksperymentów. . AgC, srebro koloidalne; PHA, fitohemaglutynina; i Con A, konkanawalina A.

(a)

(b)

(c)

(d)

(e)

(f)

(g)

(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)

Rysunek 5

komórkowa proliferacja PBMC traktowana srebro koloidalne i mitogeny. PBMC (1 × 106 komórek/mL) poddano (A) kontroli negatywnej, (B) kontroli, (C) PHA (5 µg/mL), (D) Con a (5 µg/mL), (e) AgC (17,5 ng/mL), (f) AgC (17,5 ng/mL) + PHA (5 µg/mL) lub (G) AgC (17,5 ng/mL) + Con a (5 µg/mL) i inkubowano przez 72 godziny w temperaturze 37°C i 5% atmosfery CO2. Proliferację komórkową analizowano za pomocą mikroskopowej fluorescencji. AgC, srebro koloidalne; PHA, fitohemaglutynina; i Con A, konkanawalina A.

3.3. Cytotoksyczny wpływ AgC na limfatyczne i białaczkowe linie komórkowe

nasze wyniki potwierdziły antyproliferacyjne i cytotoksyczne właściwości AgC na białaczkę (Molt-4 i K562) i linie komórkowe chłoniaka (Ramos i L5178Y) w sposób zależny od dawki (1,75 do 17,5 ng/mL) () (ryc. 6).

Rysunek 6

żywotność komórek linii komórek nowotworowych leczonych srebrem koloidalnym i mitogenami. Linie komórek nowotworowych K562, Molt-4, Ramos i L5178Y (5 × 103 komórki/studzienkę) potraktowano kilkoma dawkami AgC i inkubowano przez 5 godzin w 37°C i 5% atmosferze CO2. Żywotność komórek analizowano metodą MTT. Dane przedstawiają średnie ± odchylenie standardowe trzech niezależnych eksperymentów. . AgC, srebro koloidalne.

3.4. Oznaczanie cytokin

poza leczeniem AgC nie miało wpływu na wytwarzanie () IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IFN-γ, IL-17A (0 pg/mL) lub TNF-α (5,84 pg/mL) w porównaniu z nieleczoną kontrolą. Jednakże leczenie LPS stosowane jako kontrola pozytywna wywołało wysoką produkcję wszystkich ocenianych cytokin(Tabela 1).

3.5. Fenotypowanie markerów powierzchni komórek

nasze wyniki wykazały, że leczenie AgC nie wpływa na odsetek ekspresji populacji komórkowych CD3+ (79,7%), CD3−CD19+ (10,2%), CD3+CD4+ (52,2%), CD3+CD8+ (33,9%) i CD16+CD56+ (7,6%), w porównaniu z grupą kontrolną () (Tabela 2).

3.6. Peroksynitryty i wychwyt oznaczeń FITC-dekstran

obróbka koloidalnym srebrem (99%) nie wpływała na żywotność komórek dendrytycznych (Fig.7(a)) ani na poziomy ocenianych peroksynitrytów (Fig. 7(b)), ale zwiększyła odsetek fagocytozy (Fig. 7(c)) w porównaniu z grupą kontrolną ().

(a)

(b)

(c)

(a)
(b)
(c)

Rysunek 7

żywotność komórek ludzkich makrofagów, fagocytoza i produkcja peroksynitrytów. Ludzkie makrofagi ( 1 × 106 komórek) potraktowano AgC i inkubowano przez 5 godzin w 37°C i 5% atmosferze CO2. (a) żywotność komórek analizowano metodą błękitu trypanu. B) makrofagi fagocytoza FITC-dekstran oceniana za pomocą cytometrii przepływowej. c) azotan / azotyn oznaczony w reakcji Griesa (zestaw kolorymetryczny azotan/azotyn); LPS zastosowano jako kontrolę pozytywną. Dane przedstawiają średnie ± odchylenie standardowe trzech niezależnych eksperymentów. . AgC, srebro koloidalne; FITC-dekstran, izotiocyjanian fluoresceiny-dekstran; i LPS, lipopolisacharyd.

4. Dyskusja

wiadomo, że kilka chemioterapeutyków stosowanych w leczeniu raka (cyklofosfamid, winblastyna, winkrystyna, bleomycyna i cisplatyna) ma działanie antyproliferacyjne i cytotoksyczne; ale w małych dawkach mogą stymulować odpowiedź immunologiczną . Należy zbadać wpływ jakiejkolwiek substancji na układ odpornościowy, ponieważ wszelkie uszkodzenia w tym układzie mogą wpływać na homeostazę organizmu. W niniejszym badaniu analiza srebra koloidalnego sugeruje obecność heterogenicznej populacji nanocząstek i skupisk utworzonych przez sole srebra, prawdopodobnie pochodzących z interakcji z białkami zawartymi w pożywce hodowlanej. Odnotowano efekt agregacji cząstek srebra w płynach biologicznych z powodu obecności białek i lipidów . Ponadto nasze wyniki wykazały, że AgC (17,5 ng/mL) może hamować wytwarzanie IL-2 indukowane przez mitogeny. Stąd immunosupresja wywołana w PBMC może być spowodowana hamowaniem uwalniania IL-2. Aktywność immunosupresyjna niektórych leków, takich jak cyklosporyna i azatiopryna, została potwierdzona przez hamowanie proliferacji limfocytów i produkcji cytokin (INF-γ, IL-2, RANTES, TGF-β i TNF-α), gdy limfocyty są stymulowane przez odczynniki, takie jak Pha, Con A lub mitogen pokeweed . IL-2 jest autokrynnym czynnikiem wzrostu limfocytów T, a jego wytwarzanie jest selektywnie hamowane przez leczenie lekami immunosupresyjnymi takrolimusem (FK506) lub kwasem mykofenolowym . Wiadomo, że leki immunosupresyjne (kortykosteroidy) są stosowane w leczeniu nowotworów limfatycznych, ponieważ indukują apoptozę złośliwych komórek limfatycznych . Wykazaliśmy antyproliferacyjne i cytotoksyczne właściwości AgC (155 nm) (dawki w zakresie od 1,75 do 17,5 ng/mL) na liniach komórkowych białaczkowych i limfatycznych, pomimo wcześniejszych doniesień, które wspominały, że cząsteczki srebra w zakresie 10-100 nm średnic są bardziej cytotoksyczne niż cząstki o większych rozmiarach . Konieczne jest poznanie mechanizmu selektywności między PBMC a komórkami nowotworowymi pochodzenia mieloidalnego i limfatycznego i należy opracować przyszłe badania w obszarze apoptozy pośredniczonej przez receptor, takie jak omówione przez ” Vega and De Maio, 2005 .”Ze względu na oporność na glikokortykosteroidy w leczeniu chłoniaka, komórki nowotworowe kontynuują ekspansję w obecności glikokortykosteroidów . Z tego powodu AgC może zaoferować nową opcję kliniczną, którą należy rozważyć, ale potrzebne są dalsze badania. Z drugiej strony, nasze wyniki wskazują, że produkcja cytokin i procent markerów powierzchniowych wyrażonych przez komórki T, B i NK nie ulegają zmianie w odpowiedzi na AgC (17,5 ng/mL), w przeciwieństwie do innych leków immunosupresyjnych, takich jak rapamycyna lub sorafen, dla których działanie immunosupresyjne przypisuje się zakłóceniu szlaku sygnałowego i metabolizm kwasów tłuszczowych . Ponadto istnieją dowody na to, że komórki układu odpornościowego mogą być aktywowane w odpowiedzi na biomateriały, chociaż nie oczekuje się szlaków sygnałowych indukowanych przez MHC/peptyd/TCR. Jednakże alternatywne drogi niezidentyfikowane mogą prowadzić do aktywacji poprzez usieciowanie glikoprotein na powierzchni błony komórkowej, takich jak proliferacja limfocytów indukowana przez mitogen . W odniesieniu do peroksynitrytów srebro koloidalne (17,5 ng / mL) nie indukowało ich produkcji, ale aktywność fagocytozy wzrosła prawdopodobnie z powodu niespecyficznego wychwytu srebra koloidalnego. Inni autorzy opisali, że nanocząstki srebra w zakresie 5, 10, 15 i 100 nm zwiększają reaktywne formy tlenu wpływające na funkcję mitochondrialną, a fagocytoza cząstek srebra blokuje cykl komórkowy w fazie S i stymuluje sygnalizację zapalną poprzez wytwarzanie reaktywnych form tlenu, a następnie wydzielanie TNF-α, co zmniejsza żywotność komórek wątroby szczura .

podsumowując, niniejsze badanie wykazuje nietoksyczność srebra koloidalnego w stosunku do komórek układu odpornościowego i jego zdolność do zakłócania odpowiedzi immunologicznej poprzez zmniejszenie proliferacji komórek po stymulacji mitogenami, co sugeruje, że srebro koloidalne można uznać za środek immunosupresyjny, ale należy przeprowadzić więcej badań w celu ustalenia jego skuteczności i mechanizmu działania.

konkurencyjne interesy

autorzy oświadczają, że nie ma konfliktu interesów w związku z publikacją niniejszego artykułu.

podziękowania

to badanie jest wspierane przez Laboratorium Immunologii i wirusologii, Wydział Nauk Biologicznych, Autonomiczny Uniwersytet Nuevo Leon, San Nicolás de los Garza, NL, Meksyk, we współpracy z “Red Temática de Inmunología en Cáncer y Enfermedades Infecciosas” z rejestrem nr 253053, CONACYT.