jak zaprojektować gRNA do edycji genomu CRISPR?

gRNA prowadzi System Cripr Cas9 do właściwej lokalizacji genomowej w celu wykonania przerwy podwójnej nici.Specyficzność targetowania systemu CRISPR Cas9 jest określana przez 20 nukleotydów na 5 ‘ końcu gRNA. Pary zasad gRNA do komplementarnej nici sekwencji docelowej, a Nukleaza Cas9 wykonuje przerwę podwójną.

podczas projektowania gRNA należy wziąć pod uwagę następujące rzeczy.

1) Zawartość GC: Typowy zakres wynosi od 40% do 80% . Wyższa zawartość GC stabilizuje dupleks RNA-DNA podczas destabilizacji hybrydyzacji poza celem

2) Długość: długość może być regulowana i wahać się od 17-24 par zasad. Krótsza Sekwencja prowadzi do zminimalizowania efektów poza celem. (17 bp jest najniższą granicą długości sekwencji prowadzącej, każda długość sekwencji prowadzącej każda długość krótsza niż 17 ma statystyczną szansę na celowanie w wiele loci genomowych.)

3) potencjalne efekty poza celem: tolerancja niedopasowania i miejsce docelowe jest tym, co prowadzi do efektów poza celem. Można to zmniejszyć poprzez wyszukiwanie efektów docelowych w obrębie genomu.

istnieje wiele stron internetowych, które pomagają w projektowaniu grna. Niektóre z nich to Chop Chop (Harvard), Broad Institute sgRNA designer i Biotools.

tutaj wyjaśniam, jak korzystać z witryny Chop Chop,

1) Przejdź do https://chopchop.cbu.uib.no/

2) Select Species

3) Select species specific gene id or cut and paste the nucleotide of interest, and start analysis.

po zakończeniu analizy zostanie wyświetlona graficzna reprezentacja grna specyficznego dla witryny. Każdy potencjalny gRNA będzie również pokazać możliwe off efekty docelowe. Wybierz te, które mają mniej efektów docelowych.