Kolagen typu III ma kluczowe znaczenie dla fibrylogenezy kolagenu i i dla prawidłowego rozwoju układu sercowo-naczyniowego

wyniki i dyskusja

komórki ES (J-1) (22) transfekowano wektorem celującym zawierającym fragment genomowego DNA genu Col3a1, w którym usunięto region promotora genu i pierwszy ekson kodujący peptyd sygnałowy (Fig. 1a). Ukierunkowane klony komórek ES zidentyfikowano za pomocą analizy Southern blot i wykorzystano do iniekcji blastocyst (Fig. 1B Górna). Zmutowane myszy uzyskano z dwóch niezależnie ukierunkowanych klonów komórek ES i zidentyfikowano za pomocą analizy Southern blot (Fig. 1B niżej). Analiza białek kolagenu ogonowego i skórnego wykazała, że heterozygotyczne zmutowane myszy mają około 50% redukcję kolagenu typu III, podczas gdy kolagen typu III nie został wykryty u homozygotycznych zmutowanych zwierząt (Fig. 1C).

zmutowane zwierzęta były płodne, ale tylko heterozygotyczne myszy były fenotypowo normalne. Homozygotyczne zmutowane myszy wykazywały średni wskaźnik przeżycia wynoszący 5% w wieku odsadzenia od piersi, przy czym większość zgonów miała miejsce w ciągu pierwszych 48 godzin po urodzeniu (Tabela 1). Dokładna przyczyna śmiertelności noworodków nie jest jasna, ponieważ martwe szczenięta zostały kanibalizowane, zanim mogły zostać zbadane, a lekka mikroskopowa analiza histologiczna żywych nowonarodzonych homozygotycznych mutantów nie wykryła żadnych rażących nieprawidłowości. Dorosłe, homozygotyczne zmutowane myszy wydawały się normalne, z wyjątkiem tego, że były o około 15% mniejsze niż ich dzikie małpy tej samej płci (dane nie zostały przedstawione). Średnia długość życia homozygotycznych zmutowanych myszy wynosiła jednak około 6 miesięcy lub jedną piątą normalnej długości życia. Sekcja zwłok wykazała, że pęknięcie naczyń krwionośnych było główną przyczyną skrócenia życia tych myszy (tabela 2). Miejsca pęknięcia były sporadyczne i związane głównie z dużymi naczyniami krwionośnymi. Przeprowadzono analizę histochemiczną w celu znalezienia wady, która spowodowała kruchość ściany naczynia krwionośnego. Fig. 2 A i B pokazują przekrój prawidłowej aorty brzusznej. Ściana aorty składa się z intima i media (rys. 2A, strzała) i adwentyzmu (rys. 2 a i B, groty strzał). Medium składa się z elastycznych włókien (rys. 2B, Duże Strzałki) i komórek mięśni gładkich (rys. 2B, małe strzałki) i zapewnia elastyczność aorty, podczas gdy adventitia obejmuje głównie włókna kolagenowe typu I i ogranicza rozszerzenie aorty. Fig. 2C pokazuje przekrój tętniaka rozwarstwiającego aortę brzuszną od homozygotycznej zmutowanej myszy. Pęknięcie przekroczyło media (strzałka), co doprowadziło do kanału wypełnionego krwią (gwiazda) między mediami a adwentytią (groty strzałek) i częściowo zawaliło światło aorty. Adwentia ostatecznie pękła gdzie indziej, a krew wyciekła do jamy otrzewnej, jak to ma miejsce u ludzi ze śmiertelnym tętniakiem aorty (20). Ogólny układ włókien elastycznych i komórek mięśni gładkich (rys. 2D)był podobny do kontrolek (rys. 2b). Intensywność i rozkład materiału macierzy zewnątrzkomórkowej oraz ciemniejsze zabarwienie w adwentycji i między elastycznymi włóknami a komórkami mięśni gładkich w wewnętrznej części zmutowanych myszy (Fig. 2D) były porównywalne z kontrolami typu dzikiego (rys. 2b). Pod mikroskopem świetlnym nie zaobserwowano wyraźnych wad serca oraz średnich i małych tętnic u zmutowanych zwierząt (dane nie zostały przedstawione).

oprócz tętniaka, zmutowane myszy wykazywały częste powiększenie jelit i sporadyczne pęknięcia jelit prowadzące do śmierci(Tabela 2). Około 60% homozygotycznych zmutowanych myszy wykazywało zmiany skórne, z których najcięższe przedstawiało się jako otwarta rana o długości ≈1 cm w okolicy barku, która całkowicie przeniknęła przez skórę i odsłoniła tkankę podskórną (Fig. 3). Rany nie były spowodowane walkami między zwierzętami, ponieważ obserwowano je u zwierząt trzymanych osobno w klatce. Lekka mikroskopowa Analiza skóry, jelita i innych narządów wewnętrznych, w tym wątroby i płuc, nie wykryła żadnych jawnych nieprawidłowości u zmutowanych zwierząt (dane nie pokazane).

w celu określenia wad strukturalnych u zmutowanych zwierząt przeprowadzono mikroskopowe analizy elektronowe aorty i serca. Fig. 4 pokazuje, że włókna kolagenowe znajdują się między komórkami mięśni gładkich lub między komórkami mięśni gładkich a włóknami elastycznymi (Fig. 4A, strzałki) były nieobecne lub znacznie zmniejszone w pożywce zmutowanej aorty (Fig. 4B, strzałki). Co najbardziej uderzające, w adwentii, gdzie większość kolagenu należy do typu I, średnica włókien kolagenowych zmutowanej aorty była wysoce zmienna (porównaj rys. 4 D do C). Kiedy policzono włókna i zmierzono średnicę tych włókien w danym obszarze adwentycji, okazało się, że liczba włókien u mutantów została zmniejszona do około jednej trzeciej średnicy włókien u dzikich, podczas gdy średnia średnica włókien u mutantów była około dwukrotnie większa niż u myszy typu dzikiego (Fig. 5). Podobnie jak w przypadku aorty, włókna kolagenowe między nadkłykciem a mięśniem sercowym były zmniejszone lub brakowało, a mikrowilli nadkłykcia były słabo rozwinięte w sercu zmutowanych myszy (dane nie pokazane).

oprócz układu sercowo-naczyniowego, skórę, jelita, wątrobę i płuca zmutowanych myszy zbadano za pomocą mikroskopii elektronowej. Podobnie jak w przypadku aorty, włókna kolagenowe I w zmutowanej skórze (rys. 4F, strzały i groty strzał) były zdezorganizowane i miały bardzo zmienną średnicę w porównaniu z myszami typu dzikiego (Fig. 4E, strzałki). Zmiany te obserwowano również w wątrobie i płucach zmutowanych myszy (dane nie pokazane). Ponadto brak lub znaczne zmniejszenie włókien kolagenowych w podśluzówce i serozie zmutowanych jelit (dane nie pokazane) sugeruje, że włókna kolagenowe w tych obszarach są głównie włóknami kolagenowymi typu III.

poprzednie badania wprowadzające ukierunkowane mutacje w genach Col1a1, Col2a1, Col5a2 i Col9a1 przyniosły ważne informacje na temat funkcji tych kolagenów (24-27). Tutaj pokazujemy, że kolagen typu III odgrywa kluczową rolę w fibrillogenezie, która jest ważną częścią rozwoju takich narządów, jak układ sercowo-naczyniowy, jelita i skóra. Brak kolagenu typu III zaburzył fibrillogenezę i doprowadził do wadliwego rozwoju i niewydolności funkcjonalnej tych narządów. W warunkach fizjologicznych kolagen typu III jest nie tylko niezbędnym składnikiem włókien w tkankach, takich jak media aorty, ale także ważnym elementem regulacyjnym w fibrylogenezie kolagenu typu I. Nasze wyniki sugerują, że kolagen typu III reguluje średnicę włókien kolagenowych typu I, co służy jako mechanizm spełniania wymagań fizjologicznych różnych tkanek lub tkanki na różnych etapach rozwoju. Fenotyp myszy z niedoborem kolagenu typu III bardzo przypomina objawy kliniczne pacjentów z zespołem Ehlersa–Danlosa typu IV, u których śmierć wynika z pęknięcia naczyń krwionośnych lub jelit (20). Zmutowane myszy powinny zatem okazać się dobrymi modelami zwierzęcymi do zrozumienia tej choroby i ewentualnego testowania podejść terapeutycznych.