Kompletna sekwencja genomu szczepu Clostridium innocuum ATCC 14501

ogłoszenie

przedstawiamy kompletną sekwencję genomu szczepu Clostridium innocuum ATCC 14501, który został zidentyfikowany w 1962 roku po izolacji z ropnia wyrostka robaczkowego (1). Charakteryzował się Gram-dodatnim pręcikiem z terminalnymi zarodnikami. Kolonie miały od 1,5 do 2,5 mm średnicy, błyszczące, białe, wzniesione i niehemolityczne. Dootrzewnowe zaszczepienie supernatantu hodowlanego u myszy nie miało charakteru patogennego. Od tego czasu C. innocuum jest uważany za łagodny mikroorganizm żołądkowo-jelitowy (1).

teraz ponownie rozważa się potencjał chorobotwórczy C. innocuum. Niedawno Chia i współpracownicy donieśli, że C. innocuum jest drugim najczęściej występującym gatunkiem clostridial powodującym infekcję pozajelitową (2) i jest przyczyną infekcji jelit przypominającej clostridioides difficile (3). Izolaty te były oporne na wankomycynę, cytotoksyczne dla komórek Vero i HT-29 oraz enteropatogenne u myszy (3). Przy ponownym rozważeniu patogenności C. innocuum potrzebna jest pełna sekwencja genomu szczepu ATCC 14501.

genomowy DNA (gDNA) zarówno dla bibliotek Illumina, jak i Nanopore ekstrahowano za pomocą BiOstic bacteremia DNA isolation kit (Qiagen, Germantown, MD) z nocnej hodowli uprawianej beztlenowo w tryptycznym bulionie sojowym w temperaturze 37°C. Long-read sequencing libraries przygotowano z nieuszkodzonego gDNA za pomocą ligacji sequencing kit SQK-Lsk109 (Oxford Nanopore, UK) i zsekwencjonowano na platformie MinION za pomocą przepływu FLO-MIN106 cell. Domyślne parametry były używane dla całego oprogramowania, chyba że określono inaczej. Guppy v3. 4.5 był używany do bazowania odczytów połączeń z Modelem R9.4.1 o wysokiej dokładności i do filtrowania jakości odczytu na podstawie wyników Q, demultipleksowania i przycinania kodów kreskowych. Przybliżony zasięg odczytu wynosił 98× z 19 646 czytań o łącznej wartości 460,0 Mbp. Odczytywana wartość N50 wynosiła 22 933 nukleotydy, a wartość L50 wynosiła 7 784 odczyty. Jakość odczytu nanoporu oceniano za pomocą pycoQC v2.5.0.21 (4).

krótkie biblioteki sekwencjonowania zostały przygotowane z gDNA przy użyciu zestawu Nextera XT (Illumina, San Diego, CA) i zsekwencjonowane na platformie Illumina MiSeq przy użyciu komórki przepływowej v3, aby uzyskać 482 327 par odczytów 301-bp. Adaptery sekwencjonujące zostały przycięte z odczytu na przyrządzie, aby wygenerować 196,3 Mbp sekwencji, z przybliżonym pokryciem genomu 42×. Jakość odczytu Illumina oceniono za pomocą FastQC v0.11.2 (5). Aby zminimalizować wywołania wariantu fałszywie dodatniego w wyrównaniach, nie przeprowadzono przycinania jakości odczytów Illumina (6).

genom został zmontowany za pomocą Nanopore reads passing Q score filtering przy użyciu Flye v2.6, aby wygenerować pojedynczy contig o rozmiarze 4,30 Mb (7). Przycinane Adaptery odczyty Illumina zostały dostosowane do montażu za pomocą BWA v0.7.17, a błędy montażu zostały poprawione za pomocą Pilon v1.23 z ustawieniem –mindepth 0.1 (8, 9). Seryjne wyrównanie odczytu i korekta Pilona były wykonywane trzy razy, dopóki nie wygenerowano dalszych poprawek montażowych. Oprogramowanie niestandardowe (Pilon Tools v0.1) (https://github.com/egonozer/pilon_tools) zostało użyte do identyfikacji, ręcznej oceny i korygowania resztkowych błędów montażu homopolimerów. Cyrkulator v1. 5.5 zastosowano w celu zapewnienia cyrkularyzacji chromosomu poprzez przycinanie nakładających się końców i obracanie do początku genu dnaA (10). Zespół końcowy stanowi pojedyncza Sekwencja chromosomalna o długości 4 718 906 bp i zawartości GC 43,6%. Adnotację przeprowadzono przy użyciu NCBI Prokaryotic Genome Annotation Pipeline (PGAP) v4.11 (11, 12).