konstytutywna ekspresja wybranych genów z fosforanu pentozy i szlaków aromatycznych zwiększa wydajność kwasu shikimowego w hodowlach wsadowych o wysokiej zawartości glukozy szczepu Escherichia coli pozbawionego PTS i pykF

Budowa szczepów pochodzących z PB12 Arok-Arol-zawierających plazmid przeznaczony do konstytutywnej ekspresji syntetycznego Operonu w produkcji kwasu shikimowego

niepublikowane dowody z naszego laboratorium wskazują, że produkcja związków aromatycznych w laboratoryjnie wyewoluowanym szczepie PB12 może osiągnąć wyższe poziomy, gdy transkrypcyjna indukcja genów zaangażowanych w kanalizowanie strumienia węgla do szlaku AAA występuje na początku fermentacji. Biorąc pod uwagę tę obserwację, opracowano nową strategię optymalizacji produkcji SA w PB12 posiadającym nieaktywne geny Arok i Arol(ryc. 1). Strategia ta obejmowała projektowanie i budowę plazmidu do silnej i stabilnej ekspresji sześciu kluczowych genów ułożonych w postaci syntetycznego Operonu, kontrolowanego wyłącznie przez pojedynczy promotor Trc. W celu zmniejszenia obciążenia metabolicznego, jako wektor zastosowano pojedynczy plazmid pochodzący z pBR327 przenoszący locus par w celu zwiększenia stabilności plazmidu, po włączeniu fragmentu zawierającego promotor, polilinker i terminatory transkrypcyjne z pTrc99A (fig.2).

początkowa część Operonu została skonstruowana przez sekwencyjne amplifikowanie i ligację pierwszych 4 sekwencji kodujących (aroB, tktA, arogfbr i Aroe) do polilinkera plazmidu pbrint-Ts Cm, stosowanego jako rusztowanie klonujące (patrz metody). Później, 4-genowa konstrukcja została przeniesiona do hybrydowego plazmidu pTrc327par w połączeniu z 2 innymi genami (aroD i zwf), co prowadzi do 8kB Operonu zawartego w plazmidzie 12kb (fig.2). Otrzymany plazmid, zwany pTrcAro6, został przekształcony w szczep PB12 Arok – aroL-pozbawiony genu lacIq, umożliwiając konstytutywną ekspresję genów będących przedmiotem zainteresowania(Tabela 1). Dla uproszczenia, wygenerowany szczep PB12 aroK-Arol-lacI został nazwany AR2. Po inaktywacji genu pykF w AR2 otrzymany szczep nazwano AR3. Szczepy pochodzące z AR2 i AR3 przenoszące plazmid pTrcAro6 nazwano odpowiednio AR26 i AR36 (Tabela 1).

przestrzenny układ sekwencji kodujących, które stanowią syntetyczny operon w pTrcAro6, flankowany przez promotor Trc i terminatory transkrypcyjne, przedstawiono na fig. 2. aroB jest pierwszym genem w operonie, ponieważ kilka dowodów wskazuje, że jego niska ekspresja jest jednym z etapów ograniczających produkcję związków aromatycznych . Plazmid pTrcAro6 zawiera również geny tkta i arogfbr, których produkty biorą udział w syntezie E4P i jego kondensacji z PEP, tworząc DAHP, pierwszy związek aromatyczny (Fig. geny aroD i aroE zostały również włączone w celu promowania skutecznej konwersji DHQ do SA. Dodatkowo plazmid ten przenosi Gen zwf, kodujący pierwszy enzym PPP (Fig.1). Decyzja o włączeniu tego genu opierała się na następujących obserwacjach: 1) nadekspresja zwf znacznie odzyskała utratę szybkości wzrostu spowodowaną obciążeniem metabolicznym plazmidu w szczepie JM101 rosnącym na glukozie jako jedynym źródle węgla ; 2) doniesiono, że szczep PB12 wykazuje szczególnie niską partycję strumienia węgla na węźle 6-fosforanu glukozy (G6P) w kierunku PPP (5% zużytego G6P w porównaniu do 22% w szczepie rodzicielskim jm101). Dlatego nadekspresja tego genu powinna zwiększyć dostępność NADPH, wymaganą w ilościach katalitycznych przez enzym dehydrogenazę shikimate (aroe) i może złagodzić potencjalne skutki wzrostu poprzez przekierowanie większej ilości G6P w kierunku biosyntezy nukleotydów i aminokwasów w szczepach pochodzących z PB12 . Jednak eksperymenty przedstawione w tym raporcie nie miały na celu przeanalizowania specyficznego efektu jakiegokolwiek wykorzystywanego genu, ale zamiast tego starały się scharakteryzować konsekwencje ekspresji wszystkich z nich jako operon.

W celu promowania skutecznej translacji każdego genu, każda sekwencja kodująca została amplifikowana przy użyciu wyznaczonych starterów, które wprowadziły konsensusową sekwencję Shine-Dalgarno zlokalizowaną 8 bp przed miejscem rozpoczęcia translacji. Sekwencję nukleotydową skonstruowanego Operonu przedstawiono w dodatkowym pliku 1.

Ocena wpływu wywołanego inaktywacją pykF u szczepów wykazujących ekspresję Operonu aro6

W celu oceny wpływu wywołanego inaktywacją pykf na produkcję SA porównano skuteczność szczepów produkcyjnych AR26 (pykF+) i AR36 (pykF-) stosując kolby wstrząsające zawierające 15 g/l Glc i 5 g/l YE. Do kontroli włączono również te same szczepy zawierające pusty plazmid pTrc327par (bez Operonu aro6), AR2e i AR3e.

mimo, że SA nagromadziło się we wszystkich przypadkach, zgodnie z oczekiwaniami dla mutantów w Arok i arolu, szczepy zawierające pTrcAro6 osiągnęły wyższe stężenia SA niż te z pustym plazmidem (Fig.3b). Ponadto miano SA było prawie dwa razy wyższe w grupie AR36 niż w grupie AR26 (6,1 g/l vs 3,3 g/l). Spadek zużycia Glc zaobserwowano w szczepie AR26 po około 18 h hodowli, korelując z wysokim stężeniem octanu i zatrzymaniem w produkcji SA. W przeciwieństwie do tego, szczep AR36 wykazywał stałe zużycie Glc i wytworzono znikome ilości octanu (Fig. 3C, 3d). Wyniki te pokazują, że geny obecne w sztucznym operonie są funkcjonalne i promują produkcję SA od początku Kultury. Ich konstytutywna ekspresja zmniejszała właściwą szybkość wzrostu (μ) o 25% w tle pykF+ i nieznacznie ją zwiększała w wariancie pykf, ale nie powodowała znaczących zmian w maksymalnej wytwarzanej biomasie (Xmax) w porównaniu do szczepów z pustym plazmidem (Fig.3a). Co ciekawe, w szczepach wyrażających operon w tych warunkach wzrostu, inaktywacja genu pykF zwiększyła produkcję SA, wyeliminowała akumulację octanu i pozwoliła na stałą konsumpcję Glc.

zachowanie szczepów AR26, AR36 i ich pustych pochodnych plazmidowych, AR2e (pykF+) i AR3e ( pykF -), przy użyciu kolb wstrząsających zawierających 15 G/L Glc i 5 g/L YE (A,b,c, d) oraz 1 L fermentorów zawierających 100 g/L Glc i 15 G/L YE (e). a) wzrost; B) produkcja SA; C) konsumpcja Glc; d) produkcja octanu; e) zużycie Glc i produkcja SA AR26 i AR36 w fermentorach. Paski błędów reprezentują odchylenie standardowe.

W celu ustalenia, czy wyższa produkcja octanu i niższa produkcja SA w AR26 w porównaniu z AR36 jest konsekwencją niskiej dostępności tlenu i zakwaszenia podłoża w hodowlach kolby wstrząsającej, oba szczepy hodowano w fermentorach wsadowych o pojemności 1 L w kontrolowanych warunkach pH i napięcia rozpuszczonego tlenu (DOT). Jako podejście do zwiększenia miana SA, początkowe stężenie Glc w tych eksperymentach podniesiono do 100 g/L, a stężenie YE jednocześnie zwiększono do 15 g / L, aby umożliwić wyższe wytwarzanie biomasy.

w tych warunkach szczep AR36 wytwarzał 42 G/L SA w ciągu 60 godzin, pochłaniając cały Glc i gromadząc 12 g/l octanu. Natomiast po 47 godzinach szczep AR26 wytworzył maksymalnie 13 G / L SA, nie wyczerpał Glc i zgromadził 29 g / l octanu (rysunek 3e I Tabela 2). Niezależnie od kontrolowanych warunków w fermentorach, gdzie Ph utrzymywano na poziomie 7, a punkt był przez cały czas wyższy niż 20%, profile produkcji obu szczepów przypominały zachowanie obserwowane w kolbach wytrząsanych, z AR26 wytwarzającym więcej octanu i mniej SA. Nawet gdy globalny wolumetryczny wskaźnik zużycia Glc (Qsglobal), μ i Xmax uzyskiwany przez oba szczepy były podobne, produktywność, wydajność i miano były ponad dwukrotnie wyższe w AR36 niż w AR26 (Fig.3e i Tabela 2).

godne uwagi jest to, że tak duże różnice w produkcji octanu i SA zaobserwowano przez zakłócenie tylko jednego genu, co pokazuje zalety połączonej inaktywacji PTS i pykF przy użyciu konstytutywnego systemu ekspresji w wyewoluowanym szczepie E. coli. Aby uwzględnić zaobserwowaną poprawę w produkcji SA, sugerujemy, że wczesna i stała ekspresja enzymów zakodowanych w operonie mogłaby utrzymać stałe spożycie glikolitycznych półproduktów w kulturach, zapobiegając wysokim wahaniom ich wewnątrzkomórkowego stężenia. Stawiamy hipotezę, że połączenie tego stałego stanu metabolicznego ze zmniejszonym strumieniem z PEP do pirogronianu spowodowanym inaktywacją genu pykF może zwiększyć dostępność PEP i innych prekursorów glikolitycznych do produkcji SA bez zmniejszania wskaźnika zużycia Glc. Przyznajemy jednak, że w przypadku braku zmierzonych wewnątrzkomórkowych stężeń metabolitów uwagi te są spekulacyjne.

profile fermentacji AR36 w kulturach wsadowych

biorąc pod uwagę poprzednie wyniki, AR36 wybrano do dalszej charakterystyki jego kinetycznej i stechiometrycznej wydajności w fermentorach 1 L. Aby osiągnąć ten cel, produkcja SA została przetestowana w trzech różnych warunkach hodowli o wysokiej zawartości substratu. Wzrost, Glc i produkty uboczne były mierzone dla każdego przypadku, co z kolei pozwoliło na porównanie wydajności i wydajności.

najpierw wykorzystano 50 g / L Glc i 15 G / L YE(Fig. 4a). Wzrost nastąpił w ciągu pierwszych 10 godzin, generując 6,3 g/L suchej masy komórek z μ wynoszącym 0,53 h-1. W tym stanie wyprodukowano 24 g/L SA w ciągu 32 godzin. zużycie Glc i produkcja SA występowały od początku fermentacji i trwały do wyczerpania Glc, chociaż wskaźnik zużycia GLC (qs) i wydajność sa (qp) były wyższe w fazie wykładniczej (Tabela 3). Uzyskana wydajność SA na Glc (YSA/Glc) wynosiła 0,47 mol/mol, a globalna objętościowa wydajność SA (Qpglobal) wynosiła 0.74 gSA/L * h (Tabela 3). W odniesieniu do gromadzenia produktów ubocznych w szlaku SA, stężenia 2,4 G/L DAHP, 2,1 g/l DHS, 1,4 g/L QA, 0,4 g/L GA i 0,3 g/l DHQ były obecne w supernatancie na końcu fermentacji (Fig. W tych warunkach praktycznie nie wytwarzano octanu w trakcie fermentacji, osiągając maksymalne stężenie 1,5 g/L po 32 godzinach (Fig.4a).

profil fermentacji szczepu AR36 uprawianego w bioreaktorach o pojemności 1 L z trzema różnymi stężeniami substratu. a) 50 g/L Glc i 15 G/L YE; b) 100 g/L Glc i 15 g/L YE; c) 100 g/l Glc i 30 g/l YE. Glc: koła; SA: kwadraty; octan: Trójkąty otwarte; stężenie biomasy: Trójkąty odwrócone. Paski błędów reprezentują odchylenie standardowe.

aromatyczne produkty uboczne szlaku SA wykryte w 1 L hodowlach fermentorów szczepu AR36 przy użyciu trzech różnych stężeń substratów. a) 50 g/L Glc i 15 G/L YE; b) 100 g/L Glc i 15 g/L YE; c) 100 g/l Glc i 30 g/l YE. Diamenty: DAHP (7-fosforan 3-deoksy-d-arabinoheptulozonianu); kwadraty: DHQ (kwas 3-dehydrochinowy); okręgi: DHS (kwas 3-dehydroshikimowy); Trójkąty: QA (kwas chiniowy); odwrócone Trójkąty: ga (kwas galusowy). Paski błędów reprezentują odchylenie standardowe.

biorąc pod uwagę, że 50 g/l Glc zostało całkowicie zużyte, rozpoczęto drugie eksperymenty wsadowe z 100 g/l Glc i 15 G/L YE. Jak stwierdzono w porównaniu z AR26 w poprzedniej sekcji, ar36 uprawiany w tych warunkach wytwarzał około 42 g / L SA w ciągu 60 godzin (rysunek 4b). W tym przypadku, po spożyciu około 100 g/L glukozy i osiągnięciu maksymalnego stężenia SA, szczep wytworzył 12 g / l octanu. Wartości uzyskane dla YSA / Glc, Qpglobal, Qsglobal, Xmax i μ były podobne do wartości uzyskanych dla 50 g / L Glc i 15 G / L YE (Tabela 3). Eksperymenty te pokazują, że przy użyciu tego samego stężenia YE, dwukrotnie większa ilość Glc jest spożywana w prawie dwukrotnie większym czasie, co wskazuje, że średni wskaźnik zużycia glukozy jest utrzymywany między obydwoma warunkami hodowli. Stężenia 4,8 g/l DAHP, 2,8 g/l DHS, 3,4 g/L QA, 0.7 g/L GA i 0,9 g/l DHQ były obecne w supernatancie po 60 godzinach (Fig. Co ciekawe, podczas podwojenia stężenia Glc produkty pośrednie szlaku AAA wzrosły w sposób dość proporcjonalny z SA, co wskazuje, że zużycie 100 g/L Glc najwyraźniej nie generowało nowych wąskich gardeł strumienia węgla. W rezultacie w obu doświadczeniach ilość SA utworzona w odniesieniu do wszystkich wytworzonych związków aromatycznych wynosiła blisko 80% (ryc. 6).

procent molowy każdego związku aromatycznego wytwarzanego w szczepie AR36 w odniesieniu do całości w hodowlach wsadowych rozpoczynających się od: A) 50 g/l Glc i 15 G/L YE; b) 100 g/L Glc i 15 g/l YE; c) 100 g/l Glc i 30 g/l YE. Obliczone plony i stosunek molowy wytworzonych związków aromatycznych przedstawiono poniżej każdego pręta. Porównano stężenia zmierzone w supernatancie na końcu fermentacji. YSA / Glc = rentowność SA z Glc; YTAC / Glc = wydajność wszystkich związków aromatycznych z Glc; Ymax = maksymalna teoretyczna wydajność związków aromatycznych.

wpływ zwiększenia YE na produktywność SA badano za pomocą trzeciego zestawu eksperymentów, przy użyciu 100 g / L Glc i 30 g / l YE. Chociaż biomasa została podwojona przy użyciu dwukrotnego stężenia YE, miana SA, μ i YSA / Glc były bardzo podobne do tych uzyskanych w hodowli z 100 g / L Glc i 15 G / L YE (Fig.4b i Fig. 4c). W połączeniu z danymi uzyskanymi z dwóch pozostałych warunków, wyniki te sugerują, że ilość YE określa przede wszystkim maksymalną biomasę, którą można osiągnąć. Dodatkowo, przyrost początkowego stężenia YE nie zmienił miana SA i potwierdza obserwację, że SA jest głównie wytwarzany z glukozy. Bezpośredni związek między początkowym stężeniem YE a maksymalną wytworzoną biomasą, niezależnie od wstępnego stężenia Glc badanego w tych warunkach wzrostu, sugeruje, że jeden lub więcej ograniczających składników odżywczych jest dostarczanych przez YE. Wydaje się również, że takich składników odżywczych nie można zsyntetyzować z Glc, stąd ich wyczerpanie z YE ogranicza wzrost na długo przed wyczerpaniem Glc. Oczekuje się, że aromatyczne aminokwasy i witaminy obecne w Wye, które są potrzebne do przeciwdziałania auxotrofii AR36, staną się ograniczające; jednak inne związki w tym złożonym podłożu mogą również odgrywać rolę w ograniczaniu wzrostu w czasie.

dla początkowego stężenia YE wynoszącego 30 g/l, łącznie 106 g/l Glc i 43 g/L SA spożyto i wyprodukowano odpowiednio w około połowie czasu niż fermentacja z 15 g/l YE. Przy 30 g/L YE, qsglobal i Qpglobal wzrosły dwukrotnie, w porównaniu z fermentacjami z 15 G/L YE, mimo że miano SA pozostało niezmienione(Tabela 3). Ponieważ biomasa również wzrosła dwukrotnie, obliczone qp i qs były podobne między trzema eksperymentami, zarówno w fazie wykładniczej, jak i stacjonarnej, wykazując odporność metaboliczną zmodyfikowanego szczepu w badanych warunkach.

ponadto wyniki wykazały, że wzrost stężenia YE nie zwiększył znacząco stężenia półproduktów szlaku SA (Fig.5c). W tym względzie uznano, że obecność dużych ilości półproduktów szlaku może negatywnie wpłynąć na odzyskiwanie SA z bulionu fermentacyjnego . Ta troska skierowała pewne wysiłki na ten temat, prowadząc do testowania warunków kulturowych, tła genetycznego i stosowania nietransformowalnych analogów glukozy, jako prób zminimalizowania wytwarzania produktów ubocznych .

w tych eksperymentach wykryto wysoki odsetek SA w stosunku do produktów ubocznych bez stosowania dalszych modyfikacji do szczepu lub procesu. Stężenie każdego pośredniego szlaku porównano z sumą wszystkich aromatycznych półproduktów, a ich procenty wykorzystano do obliczenia stosunku molowego SA do każdego produktu ubocznego na końcu fermentacji(Fig. 6). Stosunek SA okazał się wyższy niż 10 dla DHS, QA lub DAHP i wyższy niż 40 dla GA lub DHQ dla wszystkich badanych stężeń substratu. Co ciekawe, we wszystkich warunkach uzyskane plony SA były bliskie 50% teoretycznego maksimum, a plony całkowitych związków aromatycznych (TAC) były powyżej 60% teoretycznego maksimum, szacowane jako 0.MolTAC/molGlc (patrz metody i rysunek 6). Odzwierciedla to skuteczne przekierowanie glukozy w kierunku szlaku AAA w szczepie AR36, nawet w przypadku stosowania kultur wsadowych o wysokiej zawartości glukozy. Stosunek SA do produktów ubocznych, jak również uzyskane plony SA i TAC są dość stałe dla wszystkich ocenianych warunków i stanowią według naszej wiedzy najwyższe zgłoszone wartości dla procesu fermentacji produkcji SA. Ulepszenia te można uzasadnić, biorąc pod uwagę, że platforma obecna w zmodyfikowanym szczepie pozwala na bardziej jednorodną ekspresję niezbędnych enzymów na wydajnym tle genetycznym. To, w przeciwieństwie do innych systemów ekspresji, gdzie wymagane geny są ekspresji z oddzielnych plazmidów, pod różnymi promotorami, lub w szczepach nie zoptymalizowane do efektywnego wykorzystania wysokich poziomów Glc. Oprócz zalet dotyczących dynamiki ekspresji genów, fakt, że IPTG nie jest potrzebny do indukcji Operonu aro6, stanowi ważną korzyść ekonomiczną dla procesu produkcyjnego, ponieważ wysoka Cena IPTG ogranicza jego zastosowanie w fermentacjach na dużą skalę.

spostrzeżenia na temat glikolitycznego i octanowego metabolizmu szczepu AR36 przez RT-qPCR

aby uzyskać głębszy wgląd w zmiany metaboliczne wywołane konstytutywną ekspresją syntetycznego Operonu aro6 w szczepie AR36, mierzono poziomy transkrypcji kilku genów w trzech różnych stadiach wzrostu w kulturach z 50 g/l Glc i 15 G/L YE. Jak szczegółowo opisano w metodach, dane uzyskane z wczesnej fazy wykładniczej (EE), późnej fazy wykładniczej (LE) I Fazy stacjonarnej (ST) zostały znormalizowane w stosunku do wartości zmierzonych z szczepu AR3e w EE, uprawianego w tych samych warunkach hodowli.

wyniki wskazują, że obecność i ekspresja Operonu w szczepie AR36 zwiększa poziomy transkrypcyjne kilku genów kodujących enzymy glikolityczne podczas faz EE i LE (Fig.1 i Fig. 7a). Wzrost ekspresji genów galP i glk jest szczególnie interesujący, ponieważ doniesiono, że ich produkty kontrolują import i fosforylację glukozy w PB12, rodzicielskim szczepie AR36 . Ponadto obserwuje się znaczny wzrost poziomu transkrypcji ChOG i eno, ale nie pykA. Zmiany te mogą przekładać się na większą dostępność PEP i fruktozy 6-P (która może być bezpośrednio przekształcona w E4P przez transketolazę kodowaną plazmidem), zwiększając wydajność związków aromatycznych. Teoretyzujemy, że obserwowana podwyższona Regulacja genów glikolitycznych w szczepie AR36 może być jedną z konsekwencji niskiego poziomu niektórych glikolitycznych półproduktów (glukoza 6-fosforan, fruktoza 6-fosforan i PEP), spowodowana silną i konstytutywną ekspresją enzymów kodowanych OPERONEM, które zużywają te metabolity.

zmiany transkrypcyjne wynikające z ekspresji syntetycznego Operonu aro6 w szczepie AR36. Dla porównania, poziom transkrypcji każdego genu oznaczono w trzech różnych punktach krzywej wzrostu szczepu AR36, wyhodowanego z 50 g/L Glc i 15 G / L YE (patrz Fig.4a). Wszystkie dane znormalizowano w stosunku do wartości uzyskanych ze szczepu AR3e we wczesnej wykładniczej fazie wzrostu. a) geny kodujące enzymy glikolityczne; B) geny biorące udział w asymilacji i biosyntezie octanu; c) geny wchodzące w skład syntetycznego Operonu aro6 (patrz Fig.1 i fig. 2). Czarne paski: wczesna faza wykładnicza; szare paski: późna Faza wykładnicza; białe paski: Faza stacjonarna. Paski błędów reprezentują odchylenie standardowe.

z drugiej strony, poziomy transkrypcyjne genów kodujących enzymy biorące udział w biosyntezie octanu (poxB, acka i pta) nie były modyfikowane przez obecność syntetycznego Operonu, podczas gdy actP i acs, kodujące enzymy biorące udział w asymilacji octanu, były silnie regulowane w fazach EE i LE (Fig.7b). W fazie wykładniczego wzrostu szczepu rodzicielskiego PB12 Wykryto również wzrost genów actP i acs, który jest zdolny do współwytworzenia Glc i octanu w pożywce minimalnej . Wyniki te korelują z niskim poziomem octanu w ocenianym stanie wzrostu (Fig.4a). Co ważne, wartości transkrypcyjne tych genów biorących udział w asymilacji octanu były niskie w fazie ST(Fig. 7b). Jeśli odpowiedź ta jest reprezentatywna dla innych zastosowanych warunków wzrostu, może częściowo wyjaśnić akumulację octanu obserwowaną w fermentacjach z 100 g/L Glc, które zużywają większe ilości Glc podczas fazy stacjonarnej(Fig. 4B i Fig. 4c). Wyniki te podkreślają, że actp i acs są potencjalnymi celami genów do sztucznego zwiększenia ich ekspresji w późnych stadiach hodowli, wykorzystując spodziewane możliwości szczepu AR36 do jednoczesnego wykorzystania Glc i octanu, obecnego w jego rodzicielskim szczepie PB12 .

geny obecne w syntetycznym operonie wykazywały bardzo silne poziomy ekspresji (nawet w fazie stacjonarnej), odzwierciedlające konstytutywną naturę promotora i wysoką liczbę kopii plazmidu (Fig.7c). Wyniki te korelują z nieprzerwanym zużyciem Glc i produkcją SA obserwowaną podczas całej fermentacji (Fig. 4a), co sugeruje, że enzymy kodowane przez geny w operonie są obecne przez cały czas uprawy. Na fig. 7c widać, że poziomy transkrypcji aroD i zwf są odpowiednio stosunkowo wyższe i niższe niż pozostałe cztery geny w operonie. Należy zachować ostrożność, ponieważ sześć genów w operonie porównuje się z tymi obecnymi w chromosomie referencyjnego szczepu AR3e. Ponieważ wartości uzyskane dla sześciu genów nie są normalizowane między nimi, różnice między ich ekspresją chromosomową w szczepie AR3e mogą zmienić względne porównania ze szczepem AR36. Niemniej jednak dane transkryptomiczne są zgodne z wysokim stosunkiem SA do aromatycznych półproduktów uzyskanych w badanych warunkach, czego można się spodziewać, jeśli wszystkie geny w operonie zostały odpowiednio wyrażone. Wraz z danymi kinetycznymi i stechiometrycznymi wyniki te podkreślają korzyści wynikające z zastosowania konstytucyjnie wyrażonego syntetycznego Operonu jako alternatywnej strategii zwiększenia wydajności SA z Glc w wyewoluowanym szczepie, który nie ma PTS i pykF.