minimalne informacje do raportowania w teście komet (MIRCA): zalecenia dotyczące opisywania procedur i wyników testu komet

wytyczne MIRCA zostały opracowane przez członków Hcomet COST Action w celu poprawy analizy i raportowania wyników testu komet (http://www.hcomet.eu/). Autorzy są ekspertami od testów komet z minimum ośmioletnim doświadczeniem w tych testach(15 z nich ma >20 lat doświadczenia). Skorzystaliśmy z ankiety internetowej, aby sprawdzić opinie autorów na temat znaczenia szczegółów raportowania (Tabela 1; Dane uzupełniające). Każda informacja została sklasyfikowana przez autorów jako “niezbędna”, “pożądana” lub “nieistotna”, a do klasyfikacji zastosowano próg ≥75% zgodności. Jeżeli liczba odpowiedzi na “istotne informacje” nie osiągnęła progu 75% porozumienia, odpowiedzi na “istotne informacje” i “pożądane informacje” zostały połączone, a informacja została sklasyfikowana jako “pożądana informacja”, Jeśli ≥75% autorów zgodziło się, że była “niezbędna” lub “pożądana”. W tabeli 1 zamieszczamy objaśnienia do każdego zalecenia.

szczegółowe zalecenia MIRCA dla każdego etapu badania komety

etap 1a: Izolacja komórek i przygotowanie zawiesin jednokomórkowych

ponieważ w teście comet wykorzystuje się zawiesiny pojedynczych komórek, próbki, które nie są uzyskiwane jako pojedyncze komórki, muszą być traktowane mechanicznie lub enzymatycznie w celu przerwania przyłączania komórek do macierzy zewnątrzkomórkowej lub do siebie nawzajem. Homogenizacja tkanek przez mechaniczne zakłócenia może sama spowodować uszkodzenie DNA, podczas gdy enzymatyczne trawienie tkanki może prowadzić do usunięcia zmian DNA z powodu aktywności endogennych enzymów naprawczych DNA lub zwiększyć poziom uszkodzeń DNA poprzez uwalnianie nukleaz z komórek. Skład buforu homogenizacyjnego jest “pożądaną” informacją, szczególnie w odniesieniu do składników, które są niezbędne do zachowania integralności DNA (np. kwas etylenodiaminotetraoctowy)24,25. Opis procedury izolacji zawiesin jednokomórkowych, w tym homogenizacji tkanki, jest uważany za “pożądaną” informację, którą należy podać w artykułach.

próbki krwi są często wykorzystywane w badaniach biomonitoringu człowieka. Ponieważ krew stanowi heterogeniczną populację komórek, szczegółowe informacje na temat populacji komórek są “niezbędne” w publikacjach. Tekst powinien dokładnie opisać, czy próbki są krwi pełnej (w tym krwinek czerwonych), leukocytów, jednojądrzastych komórek krwi lub podzbioru komórek (np. limfocyty). Pomocne może być również dołączenie informacji na temat procedury nakłucia żyły, rodzaju antykoagulantu i późniejszej metody izolacji komórek (tj. etapów wirowania i mycia) dla osób powtarzających eksperyment, więc jest to sklasyfikowane jako “pożądane” informacje. Informacje na temat warunków przechowywania komórek lub tkanek, jeśli są one krioprezerwowane, jak również metody zamrażania (np. zamrażanie błyskawiczne na suchym lodzie lub w ciekłym azocie, lub procedura powolnego zamrażania) i procedury rozmrażania, są uważane za “istotne” informacje, które należy podać, ponieważ wykazano, że procesy te wpływają na podstawowy poziom migracji DNA 26.

krok 1B: Przygotowanie komórek substratowych do testu naprawy DNA in vitro

każdy typ komórki eukariotycznej może być użyty jako komórka substratowa do testu naprawy DNA in vitro, a typ komórki i gęstość są “pożądanymi” informacjami do przekazania. “Istotne” jest zgłaszanie metody i rodzaju genotoksycznego związku stosowanego do wywoływania zmian DNA w komórkach substratu i późniejszych warunkach przechowywania komórek, podczas gdy całkowity poziom zmian DNA, które można wykryć w komórkach substratu (np., liczbę miejsc wrażliwych na glikozylazę formamidopirymidynową DNA w komórkach leczonych Ro19-8022 plus światło) uważa się za informacje “pożądane”.

krok 1C: kontrole testu

w tym artykule kontrole testu odnoszą się do próbek, które są zawarte w każdym eksperymencie testu comet; są one czasami nazywane wzorcami referencyjnymi, kontrolą wewnętrzną lub kontrolą techniczną16,27. Kontrolami testu są zazwyczaj krioprezerwowane alikwoty z pojedynczej partii komórek, które zostały wystawione na działanie czynnika zrywającego nici DNA (np., promieniowanie jonizujące, nadtlenek wodoru lub metanosulfonian metylu) lub leczenie powodujące określony rodzaj uszkodzenia DNA (np. fotouczulacz Ro19-8022 plus światło, lub leczenie bromem potasu, w celu wywołania utleniania DNA). Istnieją różne metody kontrolne dla standardowego testu alkalicznego komety i testu komety modyfikowanego enzymem. Związek stosowany w teście modyfikowanym enzymem nie powinien powodować pęknięć nici DNA, ponieważ zmniejszają one zakres dynamiczny miejsc wrażliwych na enzymy. W badaniach biomonitoringu, jak również w badaniach przekrojowych, interwencyjnych i klinicznych, komórki nienaświetlone mogą być stosowane jako kontrole oznaczania. “Istotne” jest zgłaszanie poziomów uszkodzeń w kontrolach testu i zmienności testu (odchylenie standardowe) zarówno w teście standardowym, jak i w teście Comet modyfikowanym enzymem.

test naprawy DNA in vitro wykorzystuje wewnętrzne kontrole eksperymentalne, które są również stosowane do obliczania aktywności naprawczej, a nie kontrole testowe per se. “Istotne” jest zgłaszanie poziomu nacięć naprawczych DNA w nukleoidach z (i) nieeksponowanych komórek substratu inkubowanych z buforem reakcyjnym, w celu określenia podstawowego poziomu uszkodzenia DNA w DNA substratu (tj. “Kontrola tła”); (ii)odsłoniętych komórek inkubowanych z buforem reakcyjnym, w celu ujawnienia poziomu niespecyficznych przerw nici DNA lub miejsc abazycznych wynikających z leczenia czynnikiem niszczącym (tj. “Kontrola leczenia”).; (iii) nieeksponowane komórki substratowe inkubowane z ekstraktem białkowym z próbki, w celu sprawdzenia niespecyficznej aktywności nacinania lub rozszczepiania (tj. “Kontrola swoistości”); oraz (iv) odsłonięte komórki substratowe inkubowane z enzymem specyficznym dla zmian chorobowych, podobne do kontroli testów dla testu Comet modyfikowanego enzymem (tj. “Kontrola reakcji inkubacji”).

etap 1D: kontrole negatywne i pozytywne

w niniejszym artykule kontrole negatywne i pozytywne odnoszą się do grup doświadczalnych, zgodnie z wytycznymi OECD (TG 489) dotyczącymi testu komet in vivo w tkankach zwierzęcych18. Tak więc kontrola negatywna i pozytywna odnosi się do całego eksperymentu. Kontrola pozytywna odnosi się do bezpośredniego lub pośredniego działania genotoksycznego związku, który wytwarza pęknięcia nici DNA lub miejsca wrażliwe na enzymy wykryte za pomocą testu komety. W przypadku testu komety modyfikowanego enzymem nie ma listy kontroli pozytywnych, która odpowiadałaby związkom, które OECD wymienia jako kontrole pozytywne dla testu komety alkalicznej (w celu indukowania przerw nici DNA) w określonych tkankach zwierzęcych. Ponadto nie istnieje pozytywna Kontrola badań biomonitoringu u ludzi, ponieważ zdrowi ludzie nie mogą celowo być narażeni na działanie czynnika genotoksycznego. Kontrole pozytywne są już uważane za obowiązkowe w eksperymentach z hodowlą komórek w toksykologii genetycznej i będą de facto “niezbędnymi” informacjami w artykułach wykorzystujących test komety. W badaniach na zwierzętach, jednak w celach praktycznych dane dotyczące kontroli testów (tj., próbki wymienione w sekcji powyżej zatytułowanej “krok 1C, kontrole testu”) są wystarczające, podczas gdy wyniki prawdziwych kontroli ujemnych i dodatnich są uważane za informacje “pożądane”.

Krok 2: osadzanie komórek w agarozie

test comet został pierwotnie opracowany przy użyciu trzech warstw agarozy na szkiełkach szklanych, z warstwą środkową zawierającą komórki. Jednak górna warstwa agarozy nie jest konieczna, a niektóre procedury nie wykorzystują dolnej warstwy (np. testy folii Gelbond). “Pożądane” jest zgłaszanie rodzaju i rozmiaru szkiełek (tj., powierzchnia) żeli, w miarę jak proporcja komórek w pobliżu krawędzi żelu wzrasta wraz ze zmniejszaniem się rozmiaru żelu, a DNA w nukleoidach na krawędzi żelu może migrować inaczej niż w nukleoidach w kierunku środka żelu22. Końcowe stężenie agarozy (z wbudowanymi w nią komórkami) jest “niezbędne” do zgłoszenia, ponieważ migracja DNA zależy od gęstości żelu.

Krok 3: Liza komórek

w teście Cometa istnieje kilka procedur lizowania komórek. Informacje o składzie roztworu do lizy są “niezbędne”. Dodatkowy etap inkubacji enzymu (np. z proteinazą K) może być wymagany dla niektórych typów komórek, a szczegóły inkubacji należy również podać jako “niezbędne” informacje. Niektóre raporty sugerują,że czas trwania lizy może wpływać na stabilność niektórych rodzajów uszkodzeń DNA 28,29, 30, więc czas trwania lizy i temperatura roztworu do lizy są “pożądanymi” informacjami, które należy podać.

krok 4a: Obróbka enzymu naprawczego w teście Comet modyfikowanym enzymem

ponieważ roztwór lizy może hamować aktywność enzymu naprawczego, “pożądane” jest ustalenie, czy przeprowadzono etap mycia między etapem lizy a obróbką enzymu (tj. skład buforu myjącego, liczba myć i czas trwania). Istotne jest przekazywanie informacji o źródle enzymów naprawczych, ponieważ wykazano, że enzymy różnych producentów różnią się zarówno pod względem aktywności, jak i swoistości wobec zmian nukleobaz16. W większości badań komet przeprowadza się eksperymenty z krzywą miareczkowania w celu określenia optymalnych warunków leczenia enzymatycznego31; jednak wyniki krzywych miareczkowania enzymów są rzadko zgłaszane i klasyfikowane tutaj jako informacje “pożądane” (zamiast tego można odnieść się do poprzedniego badania), chociaż uważamy za “niezbędne” zgłaszanie czasu trwania i temperatury leczenia. Stężenie enzymu nałożonego na żel jest “podstawową” informacją; zaleca się zgłaszanie stężenia w jednostkach enzymatycznych (U/ml), chociaż przydatne jest również stężenie białka (mg/ml). Rodzaj jednostki inkubacji (np. inkubator, fosa ślizgowa lub system 12-ŻELOWY) i sposób inkubacji są “pożądanymi” informacjami do przekazania. Należy określić, czy inkubację przeprowadzono (i) w kąpieli enzymatycznej lub z kroplą i szkiełkiem na szkiełku, (ii) w standardowej wersji 2-żelowej, 12-żelowej lub w systemie wieloodwiertowym, lub (iii) w nawilżonym pudełku w inkubatorze, na płycie grzewczej lub w podgrzewanej Fosie szkiełkowej.

krok 4B: Przygotowanie ekstraktu i inkubacja do testu naprawy DNA in vitro

“pożądane” jest zgłaszanie liczby komórek lub masy tkanki użytej do przygotowania ekstraktów białkowych, podczas gdy “istotne” jest zgłaszanie końcowego stężenia białka ekstraktów komórkowych lub tkankowych dodawanych do dna substratu. Skład buforu ekstrakcyjnego (informacja “pożądana”) jest mniej istotny niż skład buforu inkubacyjnego (informacja “istotna”), ponieważ może on wpływać na poziom tła migracji DNA. Zgodnie z informacjami dotyczącymi testu Comet modyfikowanego enzymem, “pożądane” jest zgłaszanie wyników eksperymentów dotyczących miareczkowania lub odniesienia do poprzednich badań z tego samego laboratorium, w którym zostały one przeprowadzone. Objętość ekstraktu dodanego do komórek substratu osadzonych w żelu jest “pożądaną” informacją. “Istotne” jest zgłaszanie czasu trwania i temperatury okresu inkubacji, ponieważ wpływają one na liczbę nacięć naprawczych. Podobnie jak w przypadku testu Comet modyfikowanego enzymem, sposób inkubacji jest “pożądaną” informacją, którą należy podać w teście naprawy in vitro. Informacje na temat tożsamości enzymu stosowanego jako kontrola reakcji inkubacji (wskazujące na ilość zmian DNA w komórkach substratu) oraz skład buforu stosowanego do poziomu tła w nacięciach naprawy DNA w nienaświetlonych komórkach substratu są “niezbędne”, ponieważ są kluczowe dla wykazania wiarygodności aktywności nacięć naprawy DNA.

Krok 5: leczenie alkaliczne

roztwór o wysokim alkalicznym pH przerywa wiązanie wodorowe, które utrzymuje nici DNA razem, a także przekształca pewne zmiany nukleobazowe w pęknięcia nici DNA. Tak więc czas trwania leczenia alkalicznego może wpływać na poziom migracji DNA w późniejszej elektroforezie32,33,34. Szczegółowe informacje dotyczące składu roztworu zasadowego, pH, temperatury i czasu trwania obróbki są więc “niezbędnymi” informacjami do przekazania.

Krok 6: elektroforeza

najważniejszymi czynnikami migracji DNA są Czas trwania elektroforezy i potencjał elektryczny (spadek napięcia na platformie zbiornika elektroforezy)35. “Istotne” jest podanie składu buforu elektroforetycznego, siły elektroforezy (gradient napięcia (V/cm) nad platformą zbiornika elektroforetycznego) oraz czasu trwania elektroforezy. Wysoka temperatura podczas elektroforezy może mieć wpływ na migrację DNA 36; W związku z tym informacja o temperaturze roztworu elektroforezy jest “niezbędna”, co może towarzyszyć opisom kroków podjętych w celu utrzymania stałej temperatury (np. chłodzenie platformy lub krążenie bufora).

Krok 7: Neutralizacja

ten etap polega na usunięciu nadmiaru roztworu zasadowego ze szkiełek w celu zapewnienia skutecznego barwienia. “Pożądane” jest opisanie składu roztworu neutralizacji.

Krok 8: barwienie i wizualizacja

barwniki wiążące DNA mają różne powinowactwa wiązania do DNA i dlatego mogą wpływać na obliczenia podstawowych deskryptorów testu komet w oprogramowaniu do analizy obrazu36,37,38. Rodzaj barwnika jest “niezbędną” informacją, podczas gdy stężenie jest “pożądaną” informacją, podobnie jak czas między barwieniem a wizualizacją. Natężenie światła z różnych typów lamp mikroskopowych różni się. Ponadto zmienia się ze względu na wiek lampy i czas, w którym została włączona podczas punktowania komet. Nie ma jednak standardowej procedury pomiaru natężenia światła i odpowiedniej korekty poziomu migracji DNA. Co więcej, Ta sama Kometa może wydawać się mieć różne poziomy migracji DNA przy różnych powiększeniach mikroskopowych. W związku z tym “pożądane” jest zgłaszanie powiększenia mikroskopowego wykorzystywanego do punktacji. “Pożądane” jest Pokazywanie reprezentatywnych obrazów komet (np., kontrola z niewielką lub zerową migracją, umiarkowana i rozległa migracja DNA) wraz ze zgłoszonymi poziomami migracji DNA.

etap 9A: Ocena i analiza danych

ten etap wymaga przedstawienia “istotnych” informacji dla głównego deskryptora testu komet (np.. %DNA w ogonie, Długość ogona, moment ogona lub wynik wzrokowy), liczba komet, które są analizowane na próbkę i sposób wyrażania ogólnego poziomu migracji DNA (np. mediana lub średnia wyników komet). “Nie jest ważne” raportowanie indywidualnego wyniku każdej komety w każdym żelu; są one łączone, aby obliczyć ogólny poziom obrażeń. Ponieważ nie można wykluczyć, że różne pakiety oprogramowania do analizy obrazu mogą mieć różne sposoby obliczania podstawowego predyktora testu komety, “niezbędne” jest zgłoszenie użytego oprogramowania (nazwa oprogramowania, producent, wersja). Wszystkie podstawowe deskryptory podzielają ograniczenie, że konieczne jest posiadanie wiedzy specjalistycznej w teście komet, aby zrozumieć, co one oznaczają, podczas gdy w przypadku utworzenia krzywej kalibracji (z wykorzystaniem promieniowania jonizującego, które wywołuje przerwy o znanej częstotliwości) wyniki można przekształcić na względną częstotliwość zmian w porównaniu z niezmienionymi nukleotydami lub parami nukleobaz; takie dane są jednoznaczne i przekazują informacje, które wszyscy badacze mogą zrozumieć39. Wcześniej opisano procedurę uzyskiwania krzywej kalibracyjnej przy użyciu promieniowania jonizującego i przekształcania poziomów migracji DNA na częstotliwość zmian w stosunku do niezmienionych nukleotydów lub par nukleobaz40. Tak więc raportowanie wyników jako poziomów zmian na 109 niezmienionych nukleotydów lub 106 par nukleobaz jest “pożądane”.

krok 9B: Obliczanie miejsc wrażliwych na enzymy lub netto liczby nacięć w DNA substratu dla testu naprawy DNA in vitro

inkubacja z enzymami naprawy DNA zwiększa poziom migracji DNA, ponieważ zarówno podstawowy poziom przerw nici DNA, jak i zmiany specyficzne dla enzymów przyczyniają się do całkowitej liczby przerw nici DNA. Ponieważ migracja DNA przypisywana podstawnemu poziomowi uszkodzenia DNA i zmianom specyficznym dla enzymów może pochodzić z różnych mechanizmów genotoksyczności, nie jest wystarczające, aby zgłosić tylko całkowity poziom uszkodzenia DNA po leczeniu enzymem. Zamiast tego “istotne” jest zgłaszanie genotoksyczności jako miejsc wrażliwych na enzymy, w których podstawowy poziom migracji DNA został odjęty od migracji DNA w szkiełkach poddanych działaniu enzymów.

ponieważ w teście naprawy DNA in vitro wykorzystuje się te same komórki substratowe ze wszystkimi próbkami ekstraktu komórkowego lub tkankowego, nie jest konieczne jednoczesne kontrolowanie tła i leczenia dla każdej próbki w tym samym eksperymencie (tj. testowanie). Może być więcej niż jeden substrat (np., analizując zarówno aktywność naprawczą wycięcia zasadowego, jak i nukleotydowego), a zatem konieczne są oddzielne kontrole dla każdego rodzaju testu naprawy DNA. “Istotne” jest zgłaszanie nacięcia sieci przez ekstrakt naprawczy w DNA substratu.

krok 9C: Analiza statystyczna wyników

analizy statystyczne są “niezbędne”. Rodzaj analizy statystycznej zależy od projektu badania i jest zgodny z ogólnymi założeniami w badaniach statystycznych w toksykologii genetycznej i biomonitoringie41,42.