obróbka nasion Klotianidyny nie ma wykrywalnego negatywnego wpływu na kolonie pszczół miodnych i ich patogeny

projekt badania

w 2013 r.na 16 polach (8,9 ± 5,4 ha; średnia ± S. d.) w południowej Szwecji przeznaczono rzepak oleisty wiosenny (Brassica napus L.). sparowane zgodnie z bliskością geograficzną (ale oddzieloną o >4 km) i użytkowaniem gruntów (rys. 1, patrz wyżej). Okoliczny krajobraz był sprawdzany pod kątem braku roślin kwitnących. Jednak w 2013 r.w badaniu pozostawały dwa pola, mimo że w pobliżu znajdowało się inne pole rzepaku, tak aby zachować jak najwięcej par gospodarskich34. W każdej parze gospodarstw losowo przydzielono jedno pole do obsiania nasionami rzepaku oleistego poddanymi działaniu klotianidyny, podczas gdy drugie pole obsiano nasionami niepoddanymi działaniu klotianidyny (potraktowano: 8; Kontrola: 8). W 2014 r.stosowano te same sparowane farmy, ale z odwróconymi zabiegami, tj. lokalizacje z polami poddanymi zabiegowi w 2013 r. miały pola kontrolne w 2014 r. i odwrotnie (poddane zabiegowi: 6; kontrolowane: 4). Ze względu na płodozmian w latach 2013 i 2014 wykorzystywano różne pola w poszczególnych gospodarstwach (rys. 1, patrz wyżej). W celu utworzenia rys. 1, pobraliśmy mapę z World Borders Database (do pobrania tutaj: http://thematicmapping.org/downloads/world_borders.php).

informacje na temat Zmiennych krajobrazu otaczającego dla różnych gospodarstw rolnych w 2014 r. przedstawiono w dodatkowej tabeli 7. W 2014 roku w promieniu 2 km W połowie pól uprawnych uprawiano dodatkowo rzepak wiosenny (1-13 ha). Nasiona poddane działaniu klotianidyny dla pól ogniskowych zostały pokryte Elado, zastrzeżoną mieszanką dwóch aktywnych składników: klotianidyny (400 g l-1) i β-cyflutryny (+80 g l−1), wybrane do tego badania, ponieważ był to dominujący środek owadobójczy w rzepaku oleistym w Szwecji i w innych częściach Europy63. Klotianidyna jest pobierana przez roślinę i rozprowadzana systemowo na wszystkie jej części w celu ochrony przed owadami64. β-Cyflutryna nie jest uważana za ogólnoustrojową i nie wykryto żadnych pozostałości w próbkach zebranych w tym badaniu34. Zarówno nasiona poddane działaniu klotianidyny, jak i nasiona kontrolne zostały pokryte tiuramem grzybobójczym w 2013 r.

uczestniczącym rolnikom zalecono, aby podczas badania nie stosowali innych neonikotynoidów na polach, chociaż do zwalczania szkodników stosowano inne środki owadobójcze; głównie Plenum (pimetrozyna), Avaunt/Steward (indoksakarb) i Mavrik (Tau-fluwalinat; stosowany również jako warroacyd w pszczelarstwie) (tabela uzupełniająca 8). Jednak Biscaya, Nazwa handlowa preparatu w sprayu zawierającego tiaklopryd neonikotynoidowy, została zastosowana w jednym polu kontrolnym w 2013 r., a następnie w sprayu Mavrik tydzień później i w jednym leczonym polu w 2014 r., w obu przypadkach w 0,3 l ha−1. Tiaklopryd ma znacznie niższą toksyczność ostrą dla pszczół niż klotianidyna65 i w 2013 r.wykryto jedynie śladowe ilości tiakloprydu w próbkach pyłku, nektaru i pszczół, a w 2014 r. Nie wykryto żadnych. Podczas gdy Rundlöf et al.34 nie zauważyło żadnych zmian w wynikach, gdy pola, w których zastosowano Biscaya zostały wyłączone z analiz, wykryliśmy pewne zmiany jakościowe (dodatkowa tabela 9). Zmiany te mogą wynikać z wyższych pozostałości tiakloprydu wykrytych w 2014 r., ale równie dobrze mogą nie odnosić się do Biscaya, ale raczej do różnicy między Biscaya/Mavrik a stosowanymi alternatywnymi kombinacjami rozpylaczy owadobójczych34 lub być spowodowane zmniejszoną mocą statystyczną.

kolonie pszczół miodnych

sto szesnaście kolonii pszczół miodnych zostało przygotowanych pod koniec maja 2013 r.przez profesjonalnego pszczelarza w pojedynczych pełnowymiarowych ulach Langstrotha zawierających dwa grzebienie z głównie zapieczętowanym potomstwem (z pszczołami), dwa pełne plastry miodu (z pszczołami), jeden wyciągnięty pusty grzebień, pięć grzebieni z podkładką woskową, pszczoły wytrząsane z dwóch grzebieni i 1-letniego (84 kolonie doświadczalne) lub 2-letniego (12 kolonii doświadczalnych plus 20 kolonii rezerwowych) królowa o znanym pochodzeniu, produkująca stosunkowo małe, jednakowe wielkości (3418 ± 123 dorosłe pszczoły; średnia ± s.E.M.; N = 96 Kolonii) kolonie z dużą ilością miejsca na wzrost, które mogą stać się wystarczająco silne, aby przetrwać nadchodzącą zimę, ale nie przerastają swojej przestrzeni w lecie. W okresie od 14 do 28 czerwca 2013 r.na każdym z 16 pól rzepaku oleistego (łącznie 96 kolonii), na początku kwitnienia rzepaku oleistego, rozmieszczono sześć Kolonii doświadczalnych (rys. uzupełniająca). 1). Rodowód królowej i wiek były dopasowane między parami farm, ale kolonie były rozmieszczone losowo. Kolonie utrzymywano w pełnym rozkwicie na 60-hektarowym ekologicznie zarządzanym polu rzepaku ozimego przed umieszczeniem na 16 polach doświadczalnych (rys. uzupełniająca). 1) aby zapewnić, że wzrost kolonii przed eksperymentem był w jak największym stopniu oparty na żerowaniu wolnym od pestycydów.

po ustaniu kwitnienia rzepaku na polu doświadczalnym, kolonie zostały przeniesione między 2 a 31 lipca (dodatkowe rys. 1) do wspólnej pasieki do zimowania. 10 sierpnia kolonie poddano obróbce parowej kwasem mrówkowym przeciwko roztoczom Varroa, składającej się z 20 ml 60% kwasu mrówkowego nasączonego płaską gąbką domową umieszczoną pod wewnętrzną osłoną na wierzchu ramek. Kolonie były karmione łącznie 20 kg cukru na kolonię w postaci roztworu sacharozy o stężeniu 55-60% v/v, dostarczonego w skrzynce paszowej trzykrotnie w okresie Sierpień-Wrzesień 2013 r. Dodatkową lekką obróbkę Varroa przeprowadzono 4 grudnia, posypując 30 ml 2,6% kwasu szczawiowego w 60% sacharozy pomiędzy ramkami, bezpośrednio na gromadę pszczół. Wiosną 2014 r. kolonie zostały przeniesione na ekologicznie zarządzane Pole rzepaku oleistego przed umieszczeniem na 10 wiosennych polach rzepaku oleistego (rys. uzupełniająca). 1). W części badania z 2014 r.rozważano włączenie Kolonii, jeśli w kwietniu 2014 r. miała 2-letnią królową składającą jaja (z wyłączeniem kolonii, które zmarły, ponownie zaszły w kolejce lub miały 3-letnie królowe w kwietniu 2014 r.) i nie zapełniły się do początku czerwca 2014 r. Ograniczenia te, oprócz wymogu, aby kolonie były narażone/nienaświetlone na działanie klotianidyny przez oba lata eksperymentu, oznaczały, że w 2014 r.tylko cztery kolonie mogły być przydzielone do każdego pola. Kolonie umieszczone przez leczone pola w 2013 r.zostały ponownie umieszczone przez leczone pola w 2014 r., aby ocenić skumulowane efekty wieloletniej ekspozycji na klotianidynę, ale w przeciwnym razie zostały ponownie randomizowane przed umieszczeniem, aby zminimalizować niezamierzone uprzedzenia. Mimo to, dwie kolonie kontrolne z 2013 r.musiały zostać umieszczone przez pole poddane działaniu klotianidyny w 2014 r., ze względu na niewystarczającą kwalifikację narażonych kolonii dla sześciu pól poddanych działaniu klotianidyny. Wystarczająca ilość Kolonii była dostępna dla czterech pól kontrolnych. Siła kolonii została zrównana zgodnie z Opisem dla 2013 roku, ale tylko w obrębie każdej grupy leczonej. Kolonie zostały zmniejszone i wyrównane po raz drugi (8 czerwca 2014), po tym jak niektóre z nich urosły za duże i próbowały się roić (dodatkowe rys. 1). Każda zmniejszona Kolonia obejmowała 1 pełny grzebień miodowy (z pszczołami), 3 grzebienie z głównie pieczętowanym potomstwem (z pszczołami) oraz oryginalną królową z 2013 roku i 6 grzebieni z podkładką woskową. Kolonie zostały przeniesione na pola rzepaku jarego między 16 a 25 czerwca 2014 r.i przywrócone do wspólnego zimowiska między 14 a 22 lipca 2014 r. (rys. uzupełniająca). 1).

analizy pozostałości

w celu potwierdzenia narażenia na klotianidynę, 24 dorosłe pszczoły miodne na pole złowione przy wejściu do ula, granulki pyłkowe zebrane z 5 pszczół miodnych żerujących na polach rzepaku oleistego i nektar usunięty z żołądków 5 pszczół miodnych żerujących na polach rzepaku oleistego analizowano z każdego miejsca pod kątem pozostałości klotianidyny. Pyłek (>25 ml) zebrano za pomocą pułapek pyłkowych, które instalowano przez 1 dzień w trzech koloniach na miejsce i analizowano pod kątem pochodzenia gatunków roślin. Próbki były przetwarzane i analizowane jak w Rundlöf et al.34 i zbierane podczas oceny maksymalnego rozkwitu w obu latach(dodatkowe rys. 1), ze stężeniami klotianidyny i czterech innych neonikotynoidów stosowanych w Szwecji (tabela uzupełniająca 2) oznaczonymi ilościowo przy użyciu chromatografii cieczowej połączonej z tandemową spektrometrią masową (LC-MS/MS) i pyłkiem zidentyfikowanym jako rzepak oleisty przy użyciu mikroskopii świetlnej i biblioteki referencyjnej pyłku (zob. tabela uzupełniająca 2 w celu uzyskania granic wykrywania i oznaczania ilościowego). Do dalszych analiz zmienności ekspozycji na neonikotynoidy pszczół miodnych w różnych miejscach zebraliśmy 12 pszczół miodnych na miejsce od wejścia do ula. Pobieranie próbek przeprowadzono w trzech miejscach leczonych klotianidyną w 2013 r. Nektar ekstrahowano z żołądka miodowego zebranych pszczół. Następnie stężenia klotianidyny oznaczano ilościowo zarówno w nektarze, jak i tkance pszczół dla każdego osobnika pszczoły. Więcej szczegółów na temat obróbki próbek dla różnych matryc, metody LC-MS/MS i kontroli jakości podano w metodach uzupełniających.

rozwój kolonii, re-queening i produkcja miodu

rozwój kolonii pszczół został oceniony przez tego samego wyszkolonego obserwatora i jednego asystenta. Ustalono obecność leżącej królowej, a także obecność komórek królowej. Jeśli zdarzeniu re-queening towarzyszyła duża utrata dorosłych pszczół, uznano, że roiło się. Jeśli nie zaobserwowano utraty dorosłych pszczół, kolonię uznano za ponownie zaszczepioną w wyniku supersedure. Produkcję i rozwój miodu kolonijnego określono poprzez ważenie Kolonii i ocenę siły Kolonii metodą Liebefelda66, jako całkowitą liczbę dorosłych pszczół i powierzchnię wylęgowego wylęgu we wszystkich klatkach. Liczbę dorosłych pszczół oszacowano, licząc pszczoły po obu stronach 10 klatek. Liczbę ograniczonych komórek lęgowych (ilość lęgowa) określono przez pomnożenie proporcji zamkniętego pokrycia lęgowego przez 2700, czyli liczbę komórek po jednej stronie użytych ramek. Kolonie ważono podczas oceny przedekspozycyjnej i poekspozycyjnej (przy użyciu wagi stołowej Mettler Toledo o wadze do 32 kg z dokładnością do 1 g) w celu oszacowania produkcji miodu. Pełne oprawki miodu zostały zastąpione pustymi oprawkami podczas kwitnienia rzepaku, aby umożliwić wzrost kolonii i zmniejszyć rojenie. Ważono zarówno pełne, jak i puste ramy, aby uwzględnić je w obliczeniach produkcji miodu. Podczas oceny poeksploatacyjnej usunięto jak najwięcej ramek miodu (maksymalnie 10% powierzchni pokrytej zadaszonym lęgiem) w celu symulacji zbiorów miodu przez pszczelarzy. Oceny przedeksploatacyjne przeprowadzono na ekologicznie zarządzanym polu rzepaku ozimego w dniach 6-17 czerwca 2013 r.i 9-11 czerwca 2014 r., A oceny poeksploatacyjne w pasiece zimującej wspólnej w dniach 29 lipca-9 sierpnia 2013 r. i 28-31 lipca 2014 r. (rys. uzupełniająca). 1). Ponadto w kwietniu 2014 r.przeprowadzono ocenę wytrzymałości Kolonii wiosennych poprzez oszacowanie całkowitej liczby dorosłych pszczół i liczby trzmieli (rys. uzupełniająca). 1). Asesor Kolonii i asystenci zostali oślepieni podczas zbierania danych dotyczących schematu leczenia pól.

pobieranie i przetwarzanie próbek patogenów i pasożytów

próbki około 100 dorosłych pszczół miodnych Pobrano z każdej kolonii podczas oceny przed i po ekspozycji na polach doświadczalnych rzepaku oleistego poddanych działaniu klotianidyny i kontrolnych w latach 2013 i 2014 (dodatkowe rys. 1). Pszczoły pobierano z grzebienia zewnętrznego każdej kolonii i składały się z mieszanki pszczół domowych i pszczół żerujących67. Wszystkie próbki pszczół przechowywano w temperaturze -20 °C do czasu wykonania prac laboratoryjnych. V. wskaźniki porażenia destruktorami dla każdej kolonii określono poprzez przemywanie próbek dorosłych pszczół wodą z mydłem w celu usunięcia i policzenia mitów68. Odwłoki 60 dorosłych pszczół na kolonię (w przypadku analiz pojedynczych kolonii) lub na pasiekę (w przypadku analiz zbiorczych Kolonii w 2013 r.10 pszczół na kolonię) usunięto i umieszczono w worku polietylenowym z wewnętrzną siatką (BioReba). Odwłoki zmielono w worku za pomocą tłuczka i 30 ml wody bez nukleazy (Milli-Q) (0,5 ml na pszczołę) dokładnie zmieszano z próbką, tworząc jednorodną zawiesinę. Kilka 1 ml Porcji tej zawiesiny usunięto i zamrożono natychmiast w temperaturze -80 °C w celu ekstrakcji DNA i RNA oraz jako przyszły materiał odniesienia.

pasożyty, patogeny, symbiotyczne drobnoustroje i geny odpornościowe

pobrane próbki pszczół oceniono pod kątem różnych patogennych i niepatogennych pasożytów i drobnoustrojów w celu zbadania wpływu umiejscowienia kolonii na pola poddane działaniu klotianidyny na ich występowanie i liczebność. Organizmy obejmowały wszędobylskie ektopasożyty Varroa destructor, 13 wirusów: wirus ostrego paraliżu pszczół (ABPV), wirus śmiertelnego paraliżu mszycy (ALPV), wirus Big Sioux River (BSRV), wirus czarnej królowej (bqcv), wirus przewlekłego paraliżu pszczół (CBPV), zdeformowany wirus skrzydła typu A (DWV-a), zdeformowany wirus skrzydła typu B (DWV-B), izraelski wirus ostrego paraliżu (IAPV), wirus pszczoły Kaszmiru (KBV), wirus Jeziora Synaj szczep 1 (LSV-1) i szczep 2 (LSV-2), wirus Sacbrood (SBV), wirus powolnego paraliżu pszczół (sbpv); dwa wspólne mikrosporidianowe pasożyty pszczół miodnych (Nosema APIs i Nosema ceranae) i dwie symbiotyczne bakterie jelitowe (gammaproteobacterium: gilliamella apicola i BETAPROTEOBACTERIUM: Snodgrassella alvi). W przypadku próbek z 2013 r. przeanalizowaliśmy również na poziomie pasieki poziomy mRNA ośmiu genów pszczół miodnych (Amel / LRR, Apidaecin, Csp33, Dorsal-1a, Eater-like, NIMC2, PGRP-S2 i SPH51), których ekspresja była wcześniej powiązana z narażeniem na pestycydy, patogeny i/lub pasożyty 19, 44 i (społeczną) odpornością pszczół miodnych 45.

ekstrakcja kwasem nukleinowym

DNA ekstrahowano z homogenatów pszczół przy użyciu protokołu do ekstrakcji DNA z zarodników Nosema69, który jest wystarczająco wytrzymały, aby również ekstrahować DNA z bakterii i innych mikroorganizmów. W sumie 500 µl pierwotnego homogeniatu pszczelego wirowano przez 5 minut w mikrofudze przy 13 000 obr. / min. Pellet był wielokrotnie zamrażany-rozmrażany ciekłym azotem i mielony sterylnym mikropestlem teflonowym, aż do sproszkowania. Sproszkowany osad ponownie zawieszono w 400 µl Qiagenowych tkankach roślinnych buforu lizy DNeasy AP1 zawierającego 4 µl RNazy-a (10 mg ml-1) i inkubowano i wstrząsano przez 10 minut w temperaturze 65 oC, po czym 130 µl buforu neutralizującego P3 (3,0 m octanu potasu pH 5.5) Dodano, a następnie 5 minut inkubacji na lodzie i odwirowywania przez 5 minut przy 14 000 obr. / min w celu usunięcia resztek lizy. DNA oczyszczono z 500 µl supernatantu za pomocą zautomatyzowanego robota do ekstrakcji QIAGEN qiacube, zgodnie z roślinnym protokołem dneasy i eluując DNA do 100 µl wody wolnej od nukleaz. RNA ekstrahowano za pomocą robota Qiacube bezpośrednio ze 100 µl homogeniatu pszczoły miodnej przy użyciu protokołu QIAGEN Plant Rneasy (w tym rozdrabniacza Qia w celu dodatkowej homogenizacji 70) i RNA eluowano do 50 µl wody wolnej od nukleaz. Przybliżone stężenie kwasu nukleinowego oznaczono za pomocą Nanodropu, po czym próbki rozcieńczono wodą wolną od nukleaz do jednorodnego 10 ng µl-1 (DNA i LSV−1(RNA)) lub 20 ng µl-1 (dla wszystkich innych próbek RNA) i przechowywano w temperaturze -80 °C.

RT−qPCR i qPCR

różne mikroorganizmy i cele mRNA gospodarza wykryto i oznaczono ilościowo za pomocą jednoetapowej odwrotnej transkrypcji-ilościowy PCR (RT-qPCR) dla patogenów z genomem RNA oraz immunologicznym i wewnętrznym genem referencyjnym mRNA, lub ilościowy PCR (qPCR) dla organizmów z genomem DNA. Szczegóły testów przedstawiono w tabeli uzupełniającej 10, tabeli uzupełniającej 11 i tabeli uzupełniającej 12. Odwrotny podkład dla Amel / LRR został nieznacznie przeprojektowany przez Di Prisco et al.19 ponieważ niezwykle wysoka komplementarność oryginalnych starterów do przodu i do tyłu skutkowała wysokimi poziomami artefaktów PCR dominującymi nad sygnałem ilościowym. Reakcje prowadzono podwójnie, w 20 µl (DNA) lub 10 µl (RNA) objętości reakcji zawierających 2 µl (DNA) lub 1,5 µl (RNA) szablon, 0,4 µM (DNA) lub 0.2 µM (RNA) startera do przodu i do tyłu oraz mieszankę Bio-Rad Eva Green qPCR (DNA) lub mieszankę Bio-Rad One-Step iTaq RT-qPCR z SYBR Green detection chemistry (RNA). Reakcje inkubowano w 96-studzienkowych optycznych płytkach qPCR w termocyklerze Bio-Rad CFX connect, stosując następujące profile cykli amplifikacji: 10 min w temperaturze 50 °C do syntezy komplementarnego DNA (cDNA) (tylko RT-qPCR): 5 min w temperaturze 95 °C (w celu dezaktywacji odwrotnej transkryptazy i aktywacji polimerazy Taq), a następnie 40 cykli po 10 s w temperaturze 95 °C dla denaturacji i 30 s w temperaturze 58 °C dla wyżarzania podkładu, przedłużania i zbierania danych. W testach DNA zastosowano następujące profile cyklu amplifikacji: 2 min w temperaturze 98 °C dla denaturacji początkowej, a następnie 40 cykli po 5 s w temperaturze 98 °C dla denaturacji i 10 s w temperaturze 60 °C dla wyżarzania podkładu, przedłużania i zbierania danych. Po cyklach amplifikacji przeprowadzono analizę krzywej topnienia w celu określenia specyficzności amplifikacji poprzez odczyt fluorescencji przy 0,5 °C w zakresie od 65 ° C do 95 °C. na każdej płytce reakcyjnej umieszczono dodatnie i ujemne (bez szablonu) kontrole testu. Dla każdego rodzaju testu (tabela uzupełniająca 10, tabela uzupełniająca 11 i tabela uzupełniająca 12) przygotowano krzywą kalibracji przez 10-krotną serię rozcieńczeń pozytywnej kontroli znanego stężenia obejmującą 6 rzędów wielkości, w celu konwersji danych ilościowych, ustalenia referencyjnego profilu krzywej topnienia amplikonu i oszacowania statystyk wydajności reakcji.

konwersja danych i normalizacja

krzywe topnienia poszczególnych reakcji oceniano wizualnie w celu oddzielenia niespecyficznych amplifikacji, które różnią się profilami temperatury topnienia od rzeczywistych docelowych amplikonów cDNA/DNA. Ze zbioru danych usunięto niespecyficzne amplifikacje. Wszystkie testy przeprowadzono w dwóch egzemplarzach, przy czym średnia wartość tych dwóch duplikatów została wykorzystana w dalszych obliczeniach. Oba duplikaty musiały uzyskać dodatnią wartość ilościową i przejść analizę krzywej topnienia w celu włączenia danych do zbioru danych. Surowe dane RT-qPCR dotyczące wszystkich potwierdzonych amplifikacji zostały następnie przekształcone na szacunkową liczbę kopii każdego docelowego RNA, stosując odpowiednią krzywą kalibracyjną do testu. Dane te pomnożono przez różne współczynniki rozcieńczenia podczas całej procedury w celu obliczenia szacunkowych kopii każdego celu na bee69. Ponieważ RNA łatwo ulega degradacji, istnieje ryzyko, że różnice między poszczególnymi próbkami w jakości RNA (tj. degradacji) mogą wpływać na wyniki70. Aby to skorygować, na wszystkich próbkach przeprowadzono testy RT-qPCR dla mRNA wspólnego wewnętrznego genu referencyjnego pszczoły miodnej (rp49). Dane dla interesujących celów RNA znormalizowano do średniej wartości dla mRNA rp49, korygując w ten sposób dane dotyczące specyficznych dla próbki różnic w jakości RNA w odniesieniu do wydajności RT-qpcr70.

analizy statystyczne

proporcje pyłku pobranego z pszczół miodnych, pochodzącego z roślin rzepaku oleistego, porównano między zabiegami (obróbka nasion klotianidyny/nieleczona) przy użyciu uogólnionego modelu liniowego, zakładającego rozkład dwominalny i korygującego naddyspersję. Stężenia klotianidyny w nektarze i pyłku zebranym przez pszczoły miodne i w tkance pszczół porównano pomiędzy zabiegami z użyciem testów Wilcoxona–Manna–Whitneya. Aby porównać stężenia klotianidyny w tkance pszczół i nektaru u poszczególnych pszczół między polami, wykorzystaliśmy analizy wariancji (ANOVA), z tożsamością pola jako predyktorem. Ponadto, stężenia klotianidyny w tkance i zawartość żołądka nektaru u poszczególnych pszczół były powiązane przy użyciu wielokrotnej regresji liniowej z tożsamością pola i stężeniem klotianidyny w nektarze jako zmiennych wyjaśniających i stężeniem klotianidyny w tkance pszczelej jako zmiennej odpowiedzi.

badanie przeprowadzono w ogólnym projekcie Before-After-Control-Impact (BACI), z sparowaną strukturą pola, powtarzaną przez dwa kolejne lata na poziomie Kolonii w celu uzyskania danych na temat rozwoju kolonii, a także występowania i obfitości pasożytów, patogenów i bakterii jelitowych. Lata 2013 i 2014 zostały przeanalizowane razem w jednym pełnym modelu, z zaprawianiem nasion, kwitnieniem, rokiem i ich oddziaływaniami jako stałymi czynnikami. Wpływ leczenia klotianidyną oceniano na podstawie interakcji między kwitnieniem a zaprawianiem nasion, ponieważ termin ten odzwierciedla różnicę w zmianie między zabiegami w stosunku do kwitnienia rzepaku. Jeśli interakcja trójdrożna (bloom × Seed treatment × year) była znacząca (tj. jeśli zmienna reagowała inaczej na leczenie klotianidyną z roku na rok), zbiór danych podzielono według roku i rok został odrzucony jako stały czynnik. Ponadto zbiór danych analizowano tylko przez 1 rok, jeśli dane obejmowały wielkość próby ≤10 w ciągu jednego roku, zarówno w odniesieniu do występowania mikrobioty, jak i jej liczebności (tabela uzupełniająca 1). Kolonie, które roiły się (8 na polach kontrolnych i 10 na polach leczonych klotianidyną w 2013 r.; jeden na polu kontrolnym i dwa na polach leczonych klotianidyną w 2014 r.), zostały wyłączone z analizy, ponieważ rojenie ma duży wpływ na rozwój kolonii. Wykluczona jest również pojedyncza Kolonia, która straciła królową podczas transportu przed umieszczeniem pola w 2013 roku (pole traktowane). Wykluczenie kolonii, które roiły się z analizy, jakościowo zmieniło niektóre wyniki (zob. dodatkowa tabela 13). Zmiany poziomu istotności mogą być spowodowane zmniejszoną mocą statystyczną, przypadkowym przypadkiem lub skutkami biologicznymi.

wykorzystano liniowe modele efektów mieszanych (LMM) do badania wpływu leczenia klotianidyną na rozwój kolonii mierzonych jako liczba ograniczonych komórek potomstwa (ilość potomstwa) i liczba dorosłych pszczół. Zaprawianie nasion (klotianidyna lub kontrola), kwitnienie (przed lub po kwitnieniu rzepaku), Rok (2013 lub 2014) i ich interakcje były stałymi czynnikami. Tożsamość pary Farm, tożsamość farm i tożsamość Kolonii zostały uwzględnione jako czynniki losowe. Produkcję miodu porównano między obróbkami wykorzystującymi LMM z tożsamością par i tożsamością gospodarstw jako czynnikami losowymi. Generalized linear mixed models (GLMMs) wykorzystano do badania wpływu leczenia klotianidyną na re-queening i śmiertelność kolonii z tożsamością rolniczą jako czynnikiem losowym.

wpływ leczenia klotianidyną na rozwój kolonii wiosennych, mierzony jako liczba dorosłych pszczół i ilość potomstwa, badano przy użyciu odpowiednio LMM i GLMM, z zaprawianiem nasion jako stałym czynnikiem oraz tożsamością pary hodowlanej i tożsamością hodowlaną jako czynnikami losowymi. Dla liczby ograniczonych komórek potomnych użyliśmy ujemnego dwumianowego rozkładu błędów i logarytmicznej funkcji łącza.

dane dotyczące mikrobiomu i roztoczy Varroa analizowano zarówno pod kątem ich dwumianowego (obecność/brak), jak i ilościowego (obfitość) charakteru, stosując odpowiednio GLMMs (z dwumianowymi rozkładami błędów i funkcją logit link) i LMMs (z normalnymi rozkładami błędów), z zaprawianiem nasion, kwitnieniem, rokiem i ich oddziaływaniami jako stałymi czynnikami. Glmm dotyczące występowania mikroorganizmów lub roztoczy Varroa zawierały tylko tożsamość Kolonii jako czynnik losowy, ponieważ efektywna wielkość próby (tj. rzadszy wynik danych dotyczących obecności/nieobecności) nie pozwalała na włączenie bardziej losowych czynników. Jedynie organizmy i lata o (efektywnej) wielkości próby >10 były analizowane zarówno pod kątem występowania, jak i liczebności. Ponadto kolonie, które przynajmniej raz nie uzyskały pozytywnego wyniku na obecność określonego mikroorganizmu, zostały wyłączone z analizy liczebności. Patogen pszczeli i obfitość bakterii ulegały logarytmicznej transformacji (log10), ponieważ na ogół są one rozłożone wykładniczo. LMMs w odniesieniu do liczebności organizmu docelowego zawierały jako czynniki losowe tożsamość pary hodowlanej, tożsamość hodowli i tożsamość Kolonii. Liczba roztoczy Varroa przypadająca na 100 pszczół i masa Kolonii zostały przekształcone w pierwiastek kwadratowy, aby uniknąć niestandardowych pozostałości. Przedziały ufności obliczono na podstawie prawdopodobieństwa profilu. W przypadku danych przekształconych pierwiastkiem kwadratowym oszacowania zostały ponownie przekształcone do pierwotnej skali dla ilustracji graficznych.

transkrypty genów immunologicznych były dostępne tylko w 2013 r.i na poziomie pasieki, ale również zgodnie z projektem BACI. LMMs na ekspresji genów zawierały zaprawianie nasion i kwitnienie jako stałe czynniki i tożsamość gospodarstwa jako czynniki losowe.

analizy Danych Statystycznych przeprowadzono przy użyciu R, z wyjątkiem analiz dotyczących weryfikacji narażenia na klotianidynę i użytkowania gruntów, dla których SAS 9.4 for Windows (SAS Institute Inc.) był używany. LMM były dopasowane za pomocą funkcji lmer pakietu lme4, a Glmm były dopasowane za pomocą funkcji glmmTMB pakietu glmmTMB w R. wartości p z Glmm zostały obliczone za pomocą testów współczynnika prawdopodobieństwa. Wartości P z LMMs obliczono przy użyciu funkcji Anova pakietu samochodowego, przy czym testy typu III F wykorzystano dla modeli zawierających interakcje, a testy typu II F dla modeli bez interakcji (tj. ocena sprężynowa i produkcja miodu). Wpływ czynników stałych oszacowano na podstawie kontrastu sumy do zera we wszystkich modelach z wyjątkiem reszt neonikotynoidowych. Kontrasty sumujące do zera pozwalają na określenie głównych efektów / interakcji (tj. estymacji niezależnie od innych zmiennych niezależnych) i pokazują efekty czynników jako odchylenia od średniej Wielkiej (intercept). Dla czynników o dwóch poziomach wielkość odchylenia każdego poziomu od średniej wielkiej jest taka sama, ale kierunek się różni. Przedstawiamy efekty czynników (zaprawianie nasion, kwitnienie, rok), jako odchylenie drugiego poziomu (klotianidyna, po 2014) od średniej Wielkiej. Tak było również w przypadku interakcji, tak że na przykład interakcja zaprawiania nasion × kwitnienia wskazuje, w jakim stopniu kolonie narażone na klotianidynę różniły się zmianą w stosunku do kwitnienia rzepaku oleistego od średniej zmiany obu metod.

Analiza mocy

przeprowadziliśmy analizy mocy dla liczby dorosłych pszczół i liczby ograniczonych komórek rozrodczych i produkcji miodu, aby zbadać rozmiar efektu, który możemy potencjalnie wykryć, biorąc pod uwagę nasz projekt, replikację i wybór modelu. Moc została określona dla zakresu wielkości efektu przy nominalnym poziomie ufności α = 0,05 Przez 1000 symulacji Monte Carlo na wielkość efektu przy użyciu funkcji powerSim pakietu simr. Moc obliczono dla zakresu wielkości efektów, wyrażonych jako zmiana liczby dorosłych pszczół, liczby zamkniętych komórek potomstwa lub produkcji miodu. Dzieląc wielkość efektu ze średnią liczbą pszczół, średnią liczbą komórek potomstwa lub produkcją miodu wszystkich Kolonii kontrolnych, otrzymaliśmy wielkość efektu wyrażoną jako procentowa zmiana tych matryc (rys. uzupełniająca). 3). Ta analiza mocy umożliwiła porównanie wielkości efektu z wielkością efektu przedstawioną przez Rundlöf et al.34. Korzystając z pełnego modelu, mogliśmy wykryć rozmiar efektu dla liczby dorosłych pszczół poniżej 5% z mocą 80% w porównaniu z rozmiarem efektu poniżej 20% przedstawionym przez Rundlöf et al.34. Jest to nawet niższe niż wymagania dotyczące wielkości efektu < 7% określone przez EFSA32. W wyniku znaczącej interakcji zaprawiania nasion, rozkwitu i roku, zbiór danych dotyczących liczby ograniczonych komórek potomstwa analizowano oddzielnie dla każdego roku. Dlatego prezentujemy tutaj analizę mocy dla każdego roku. Wielkość efektu, przy którym osiągnięto 80%, wzrosła z poziomu poniżej 10% w 2013 r.do nieco poniżej 11% W 2014 r. (rys. uzupełniająca). 3), prawdopodobnie ze względu na zmniejszoną replikację w 2014 r. Przeprowadziliśmy również analizę mocy produkcji miodu (ilość miodu na kolonię w kg) przy użyciu zestawu danych z obu lat, pokazując, że rozmiar efektu poniżej 20% można wykryć przy mocy 80% (dodatkowe rys. 3).

podsumowanie sprawozdania

więcej informacji na temat projektu eksperymentalnego można znaleźć w podsumowaniu sprawozdania z badań przyrodniczych, połączonym z tym artykułem.