Okrągły RNA: funkcje, zastosowania i perspektywy

wprowadzenie

Okrągły RNA (cirrna) został odkryty w wirusach RNA jako wiroidy w połowie lat 70., początkowo podejrzewano, że jest to endogenny błąd splicingu RNA. Dzięki postępowi w analizie obliczeniowej i technikach sekwencjonowania RNA w tej samej dekadzie, te niezrozumiałe okrągłe struktury zostały ostatecznie poprawnie i głęboko rozpoznane zarówno pod względem struktury, jak i funkcjonalności . W swoim jądrze, cirrna jest jednoniciowym RNA, ale różni się od znacznie lepiej znanego liniowego RNA tym , że stale zamyka się w sobie kowalencyjnie łącząc swoje końce 5′ I 3′, prezentując w ten sposób fascynujące właściwości, które nie są w pełni zbadane: rusztowanie kompleksu białkowego, modulacja genów rodzicielskich, interakcje RNA z białkiem i gąbka microRNA (miRNA), by wymienić tylko kilka . Obecnie uważa się, że pełnią one istotną funkcję regulacyjną zarówno dla roślin, jak i dla zwierząt . Coraz więcej grup badawczych wykazało i zweryfikowało w pewnym stopniu poziom skuteczności i skuteczności wykazywany w okrągłych RNA, który jest zwykle wymagany w opłacalnych zabiegach medycznych i innych zastosowaniach biotechnologicznych. Na przykład, przypadki tradycyjnych biomarkerów znacznie przewyższają proponowane substytuty cirrna są często zgłaszane. Wsparte rosnącym poparciem i dowodami na temat promujących możliwości cirrna, należy jako takie wytworzyć więcej badań i zainteresowania, nie tylko z podstawowego kompleksowego biologicznego zrozumienia jego struktur i mechanizmów, ale także na systematycznym poziomie ich interakcji z otaczającymi cząsteczkami i środowiskami. Mówiąc aplikacyjnie, cirrna są na równi pod względem potencjału i żywotności w zwalczaniu raka i innych chorób złośliwych za pomocą innych nowatorskich metod leczenia, takich jak spersonalizowana medycyna i terapie komórkami macierzystymi.

charakterystyka Cirrna

Cirrna zwykle składają się z 1-5 eksonów, a introny flankujące eksony są do 3 razy dłuższe od ich liniowego odpowiednika. Bliższa analiza wykazała obecność wielu komplementarnych powtórzeń falownika Alu w segmentach intron, co doprowadziło niektórych do spekulacji, że ten konkretny układ faktycznie ułatwia miejsca łączenia, aby łatwo się zlokalizować i promować obieg. Ponieważ są to struktury ściśle zapętlone, w cirrna nie ma struktur końcowych 5′ I 3′, takich jak ogony Poli-a i kapsle 5′, co czyni je odpornymi na rozszczepienie egzonukleazy . Empirycznie trwają 2,5 razy dłużej niż ich liniowe odpowiedniki w komórkach sutka, jak pokazano w badaniu przeprowadzonym przez Enuka et al. . Dzięki tym właściwościom fizycznym, powszechne laboratoryjne Techniki przesiewowe, takie jak degradacja RNazy R – enzymu, który rozkłada wyłącznie liniowy RNA – jak również testowanie ogona Poli-a, mogą precyzyjnie dobierać bliskie zapętlone struktury nad formami liniowymi. Kilka grup badawczych w ostatnich latach przesunęło swój nacisk na identyfikację potencjalnych izoform cirrna, struktur, które są pierwotnie wyrażone z tego samego rodzicielskiego DNA, ale różnią się nieco od siebie w końcowej dojrzałej formie ze względu na różnicowanie specyficzności spliceosomów w rozpoznawaniu eksonów i intronów na nici pre-mRNA . Do znanych grup należą Salzman, Jeck, Memczak, Guo i Zhang . W związku z tym niesamowita różnorodność cirrnas wyjaśniła: do tej pory zidentyfikowano 20 000 różnych rodzajów u eukariotów, a liczba ta pozostaje do dziś Otwarta .

biogeneza i klasyfikacja Cirrna

tworzenie cirrna powstaje w wyniku pozycjonowania i kodowania grup egzonu i intronu, które są segmentami, które są zarezerwowane i wyeliminowane odpowiednio w końcowym produkcie zmodyfikowanym po transkrypcji . Zwykle dojrzały posłaniec RNA powstaje, gdy kompleks białkowo-RNA o nazwie spliceosom katalizuje rozszczepianie segmentów intronowych w cząsteczce prekursora-mRNA, zwykle przez rozpoznanie specyficznych sekwencji flankujących segment intronowy na obu końcach. Segmenty egzonów łączą się, podczas gdy segmenty introniczne są w konsekwencji usuwane i degradowane. Ta konwencjonalna percepcja nie bierze pod uwagę odchylenia i różnicy w sile działania we wszystkich miejscach splicingu , z których niektóre w rezultacie spliceosom może ignorować i nieuchronnie prowadzić do syntezy cirrna. Co więcej, nie należy ignorować udziału przestrzennego układu miejsca splotu 5′ I 3′, ponieważ jeśli pierwszy jest umieszczony za drugim, to spliceosom korzystnie konstruuje kowalencyjnie zamkniętą kolistą strukturę nad liniową cząsteczką egzoniczną . Mechanizm ten, zwany potocznie “Egzonotronicznym”, powoduje powstawanie różnych typów cirrnas, w tym egzonicznych, intronicznych, egzonotronicznych i międzygenicznych . W szczególnych przypadkach nowotworowych struktura wewnętrzna jest jeszcze trudniejsza do określenia ze względu na ekspansywny, a tym samym inwazyjny charakter nowotworów złośliwych . Pokrótce przedstawiliśmy biogenezę i funkcjonalność cirrna na Fig. 1.

przegląd biogenezy i funkcjonalności Okrągłego RNA. Wyjaśnienie i Przypisy: a posłaniec RNA w dojrzałej formie, w którym nie występują interakcje między egzonami i intronami. B Lariat-Driven Circularisation. Egzon wyższego rzędu (Egzon 1) i niższego rzędu (Egzon 4) są kowalencyjnie związane z powodu łączenia mRNA. Ułatwia to wytwarzanie lariatu RNA wraz z pozostałymi parami eksonów, które są Eksonami 2 i 3. C RNA-Binding protein Driven and Intron-pairing Driven Circularizations. W obu przypadkach, introny znajdujące się w górnym i dolnym biegu (introny 1 i 3) są sparowane, aby zapewnić możliwość interakcji między eksonami umieszczonymi w środku (eksony 2 i 3), jedyną różnicą jest to, że w pierwszym przypadku zewnętrzna cząsteczka RBP przyłącza się do równania, aby aktywnie ułatwić reakcję, podczas gdy w napędzanej parowaniem Intronowym, grupa hydroksylowa i grupa fosforanowa intronów znajdujących się w górnym i dolnym biegu odpowiednio łączą się w pary niezależnie. d ecircRNA lub ElcircRNA jest wytwarzany niezależnie od drogi krążenia. W niektórych przypadkach segmenty introniczne znajdują się w pętli, co powoduje powstanie Elcirrna w przeciwieństwie do ecirn, która zawiera czysto egzoniczne segmenty. e funkcje dojrzałych cirrna obejmują gąbkowanie miRNA, działające jako podwójny inhibitor dla niektórych reakcji chemicznych; translacja białka jest możliwa, choć dość rzadka i prowadzone są badania, aby zrozumieć, czym różni się od liniowych tłumaczeń RNA; złożone formacje RBP-białka pomagają regulować i umiarkować szlaki i pośrednio wpływają na produkcję innych cirrna; interakcje mRNA, ułatwiające lub hamujące

funkcja Cirrna: gąbki mikroRNA

ze względu na wyjątkowość w strukturach cirrna nie kodują białek, takich jak formy liniowe . Badania wykazały, na poparcie dowodów empirycznych, że niektóre cirrna działają jak gąbki mikroRNA i skutecznie blokują ich mechanizm. MikroRNA są 21-nt długimi niekodującymi sekwencjami RNA, które pomagają w post transkrypcyjnej regulacji ekspresji genów, zazwyczaj poprzez blokowanie się na mRNA i hamowanie jego translacji na białko poprzez konkurencyjną lub niekonkurencyjną modę. Są one klasyfikowane do rodzin według ich regionów nasiennych, w zależności od tego, czy mają tę samą sekwencję nukleotydów z pozycji 2 do 7 . Cirrna posiadają komplementarność do przeciwstawienia się mikroRNA, rozpoznając regiony nasienne Mirna i konkurencyjnie je dezaktywując. W szczególności dwa cirrna, odpowiednio CDR1as i cirsry, są obecnie głównym przedmiotem badań naukowych. Zaobserwowano, że CDR1as zawiera 70 zachowanych miejsc wiązania miRNA-7, znacznie znaczących niż jakakolwiek inna liniowa gąbka miRNA. Jego zdolność do gąbkowania potwierdzają Memczak et al. , w którym wykorzystano sekwestrowanie cząsteczek CDR1as przeciwko podwyższonej ekspresji miR-7 w mózgach danio pręgowanego w celu uzyskania dowodów potwierdzających aktywność hamującą CDR1as przeciwko docelowemu miRNA poprzez monitorowanie kolejnych zmian śródmózgowia danio pręgowanego. Z drugiej strony cirsry jest testowany w jądrach mysich i zauważany jest jego komplementarny atak na Region nasienny miR – 138 . Ponieważ zawiera 16 specyficznych miejsc wiązania, wiele wciąż imponujących spośród wszystkich cząsteczek gąbek, ich hipoteza funkcjonalizacji gąbek jest potwierdzona .

funkcja Cirrna: interakcja z RBPs i translacją białek

niektórzy odkryli, że cirrna reguluje transkrypcję i ekspresję genów za pośrednictwem innych szlaków. Mogą wchodzić w interakcje z białkami wiążącymi RNA (rbps), takimi jak circ-Foxo3 i razem tworzą kompleks, który wpływa na przetrwanie i proliferację komórek poprzez interakcję z p21 i CDK2 ; niektóre wzmacniają stabilność mRNA poprzez tworzenie struktur dupleksu, takich jak w przypadku CDR1as. Bardziej kontrowersyjne są grupy takie jak Legnini I. et al. i Pamudurti N. R. et al. odkrył, że niektóre cirrna mogą tłumaczyć białka, jeden w mysich mioblastach i jeden w muchołówkach . Takie wiadomości rodzą nową hipotezę ” o możliwościach cirrna, konwencjonalnie uważaną za niekodującą . Od czasu pierwszego odkrycia białek translowanych z wirusa zapalenia wątroby-jednoniciowego cirrna, niektórzy zweryfikowali aktywację zdolności translacyjnej cirrna poprzez wstawienie IRES (wewnętrznego miejsca wejścia rybosomu) przed kodonem start . Trzeba zrobić znacznie więcej, aby w pełni zrozumieć dokładny mechanizm translacyjny tych cirrna i dlaczego działają, podczas gdy większość innych nie.

potencjał zastosowania Cirrna

na bardziej praktyczną uwagę, cirrna są zdolnymi do życia biomarkerami do diagnozowania i leczenia chorób, ponieważ nie mogą być łatwo degradowane przez egzonukleazy ze względu na ich zamkniętą okrągłą strukturę. W niektórych przypadkach stwierdzono, że cirrna przewyższają konwencjonalne biomarkery. Na przykład, zwiększenie regulacji circ-PVT1 w tkankach raka żołądka (GC) zwiększa aktywność gąbczastą miR-125, a następnie zachęca do proliferacji GC ; hsa_circ_0000190 również przyciąga uwagę, działając dokładnie w przeciwną stronę-downregulation występuje, gdy wchodzi w kontakt z GC, i jest testowany jako bardziej wrażliwy i specyficzny niż biomarkery, takie jak CEA i CA 19-9 . Innym przykładem jest rak wątrobowokomórkowy (HCC), gdzie obecny biomarker w przeważającym zastosowaniu jest alfa-fetoproteina (AFP). AFP wykazuje słabą czułość, przy czym 40% wszystkich pacjentów z HCC testowało normalny poziom AFP. Konstruktywnym sposobem zwiększenia tej czułości jest połączenie z innymi markerami, co nie jest skutecznym rozwiązaniem. Alternatywnie, Xingchen Shang et al. zasugerował korelację pomiędzy circ_005075 a wielkością guza, wymieniając go jako żywy biomarker prognostyczny, który jest lepszy zarówno pod względem skuteczności, jak i potencjału ze względu na ich stabilność i swoistość. Sugeruje to, że rozwój i inwazja HCCs są ściśle związane z cirrnas, chociaż jego pełny mechanizm nadal niejasny. Niemniej jednak lista możliwych biomarkerów cirrna mających zastosowanie do badań nad rakiem nie ogranicza się wyłącznie do tych dwóch chorób. Podsumowaliśmy dostępne badania dotyczące cirrna zaangażowanych w różne choroby ludzkie, które można znaleźć w tabeli 1.

dodatkowe ostatnie badania zidentyfikowały i starają się dekodować wzbogacenie i stabilność cirrna w exosomach, kombinacji, która mogłaby dodatkowo zwiększyć zdolność celowania cirrna. Exosomy to pęcherzyki zewnątrzkomórkowe, których główną funkcją jest transport różnych treści komórkowych, substancji chemicznych, a także czynników, umożliwiając w ten sposób interakcję i odpowiedź między komórkami . W związku z tym znaczna liczba zmian komórkowych i reakcji tkankowych jest konsekwencją tego, czy odpowiadający jej pęcherzyk o tej samej kompatybilności z powodzeniem dotarł do miejsca przeznaczenia i nieumyślnych odpowiedzi lub transportowanych czynników . Zrozumienie mechanizmu egzosomów może pomóc w uzyskiwaniu mediacji na mikrośrodowiskach nowotworowych i sieci międzykomórkowej, dlatego wzbudza ostatnio duże zainteresowanie egzosomem cirrna w świetle możliwości zwiększenia skuteczności i zdolności ukierunkowania na złośliwe lub nieprawidłowo działające komórki.

pochodzenie cirrna ostatecznie zależy od odpowiedniego poziomu miRNA w komórkach dawców, które mogą być zarówno odporne, jak i nieimmunologiczne. Egzosomowe RNA mogą zminimalizować uszkodzenia DNA poprzez przyspieszenie cyklu komórkowego, jak wykazano w niedawnym przypadku nadekspresji miR-217, skutkującej zmniejszeniem ekspresji clclin-D1 i EZH2. Uważa się, że zachowanie to jest związane z deregulacji proliferacji w formacji nowotworów . Co więcej, wiele wyników eksperymentalnych wykazało bezpośredni związek między exosomami a transformacją nowotworową, a także mechanistyczny wpływ cirrna na mikrośrodowisko nowotworu . Biorąc na przykład gruczolakoraka przewodu trzustkowego (PDAC), wiązano się z nieprawidłową wysoką ekspresją egzosomu circ-PED8A ; egzosom cirnrip1 Promuje przerzuty w raku żołądka (GC) przez gąbkowanie miR-149-5P, w innym badaniu. Być może najbardziej znacząca jest rola exosome circPTGR1 ma na rozwój Hepatocellular Carcinoma (HCC) , gdzie upregulation exosome circRNA zachęcać nowotwór inwazja. Ze względu na te wysoce skorelowane odkrycia, egzosomowe cirrna są proponowane jako wskaźniki diagnostyczne dla odpowiadających im nowotworów złośliwych w oparciu o to, jak respondent zmienia poziom ekspresji i ich doskonałą stabilność, w połączeniu z wrodzonym mechanizmem dostarczania ukierunkowanego. Obecnie ponad 1000 cirrna zostało zidentyfikowanych w exosomach w całym ludzkim ciele, a więcej badań jest prowadzonych nad odkryciem dodatkowych kombinacji exosomu-cirrna-raka.

wyzwania i perspektywy Cirrna

pomimo rosnących badań prowadzonych równolegle ze wzrostem popularności cirrna, funkcja biologiczna większości cirrna nadal pozostaje tajemnicą. Na przykład obserwuje się, że większość cirrnas patroluje w cytoplazmie, ale pochodzą one z jądra komórki, więc pojawia się pytanie, w jaki sposób mieszczą się w maleńkich porach jądrowych. Co więcej, fakt, że wiele eksonów cyrkulacyjnych (85%) pokrywa się z sekwencjami kodującymi białka, ale większość cirrna nie koduje białek, pozostaje do zbadania. Bardziej kliniczne uwagi, wymagają dalszych badań, aby być w stanie całkowicie zastąpić tradycyjne procedury diagnostyczne. Należy zająć się takimi kwestiami, jak powodująca uraz ekstrakcja tkanek pacjenta i kosztowne wykrywanie cirrna w tkance, a także uzyskać pełne kompleksowe zrozumienie ich drugorzędnych struktur i różnych ról między sobą. Niewłaściwe podanie odpowiednich biomarkerów cirrna u pacjentów może zaciemnić wyniki kliniczne, które należy przezwyciężyć poprzez uzyskanie lepszego obrazu wytwarzania, lokalizacji i degradacji proponowanych cirrna.

mimo to, cirrna są nadal atrakcyjnymi opcjami dla rozwoju szeregu biologicznych narzędzi terapeutycznych. Istnieją już doniesienia o budowie RNA zarówno in vitro, jak i In vivo, wykorzystującej permutowane sekwencje intronowo-egzonowe (PIE) grupy I do komplementarnego celowania w sekwencje flankujące spliceosomal-backsplice-site, i ten mechanizm można ewentualnie ekstrapolować na dowolną sekwencję lub białko o znanej strukturze, jeśli sobie tego życzymy. Na marginesie, istnieje wiele możliwości poprawy w poszerzaniu różnorodności możliwości diagnostycznych cirrna. W jednym przykładzie obecna analiza molekularna krwi jest zatrzymywana przy analizie wolnych od komórek fragmentów genomowo-DNA; Wspaniałą perspektywą na przyszłość byłoby rozważenie pobierania próbek specyficznych dla choroby pęcherzyków pozakomórkowych w celu bardziej szczegółowego monitorowania początku i postępu choroby. Te pomysły stanowią podstawę dla dalszych sugestii selektywnej regulacji białek i programowanej sygnalizacji komórkowej. Jak wielokrotnie demonstrowano w trwających eksperymentach, cirrna z pewnością pokazały swój potencjał gąbczasty i biomarkingowy, co powinno skłonić nas do odkrycia sekretów długo niezrozumianych cirrna.