perspektywa podłoża uwarunkowanego komórkami macierzystymi w medycynie regeneracyjnej

Streszczenie

Tło. Uwarunkowane podłoże pochodzące z komórek macierzystych ma obiecującą perspektywę, aby być produkowane jako farmaceutyki dla medycyny regeneracyjnej. Cel. Zbadanie różnych metod uzyskiwania pochodzących z komórek macierzystych uwarunkowane medium (CM), aby uzyskać wgląd w ich perspektywę zastosowania w różnych chorobach. Metody. Przegląd systematyczny przy użyciu słów kluczowych “komórka macierzysta” i “medium uwarunkowane” lub “secretome” i ” terapia.”Dane dotyczące leczonych stanów/chorób, rodzaju hodowanej komórki, pożywki i suplementów do hodowli komórek, warunków hodowli, przetwarzania CM, czynników wzrostu i innych wydzielin, które były analizowane, sposobu stosowania i wyniku, zostały odnotowane, pogrupowane, tabelaryczne i przeanalizowane. Wyniki. Większość badań CM przy użyciu wykazały dobre wyniki. Jednak różne CM, nawet jeśli pochodzą z tego samego rodzaju komórek, były wytwarzane w różnych warunkach, to znaczy z różnych przejść, podłoża hodowlanego i warunków hodowli. Wydajność czynnika wzrostu różnych typów komórek była dostępna w niektórych badaniach i można było obliczyć liczbę komórek potrzebną do wytworzenia CM dla jednego zastosowania. Wniosek. Różne uwarunkowane media pochodzące z komórek macierzystych były testowane na różnych chorobach i w większości wykazały dobre wyniki. Należy jednak przeprowadzić znormalizowane metody produkcji i walidacje ich stosowania.

1. Wprowadzenie

gromadzą się dane dotyczące wykorzystania komórek macierzystych w różnych chorobach. Niektóre badania donosiły korzystny wpływ terapii komórkami macierzystymi w chorobach zwyrodnieniowych, takich jak zawał mięśnia sercowego i wykazały, że komórki macierzyste powodują naprawę tkanek ze względu na ich zdolność do wydzielania czynników troficznych, które wywierają korzystny wpływ na uszkodzoną tkankę, a nie ich zdolność do różnicowania się w potrzebne komórki . Różne badania na komórkach macierzystych pochodzących wydzielanych czynników wykazały, że wydzielany czynnik sam bez samej komórki macierzystej może powodować naprawy tkanek w różnych warunkach, które zaangażowane uszkodzenia tkanek/narządów. Wydzielane czynniki są określane jako secretome, microvesicles lub exosome i można je znaleźć w pożywce, w której hodowane są komórki macierzyste; w ten sposób pożywka jest nazywana pożywką uwarunkowaną (CM) .

zastosowanie secretome zawierającego CM ma kilka zalet w porównaniu z wykorzystaniem komórek macierzystych, ponieważ CM może być wytwarzany, liofilizowany, pakowany i transportowany łatwiej. Co więcej, ponieważ jest pozbawiony komórek; nie ma potrzeby dopasowywania dawcy i biorcy, aby uniknąć problemów z odrzuceniem. Dlatego uwarunkowane pożywki pochodzące z komórek macierzystych mają obiecującą perspektywę produkcji jako farmaceutyki dla medycyny regeneracyjnej.

do tej pory nie zgłoszono żadnego badania klinicznego, w którym CM stosowano w określonej chorobie, z wyjątkiem dwóch badań pilotażowych dotyczących stosowania mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej CM do regeneracji mieszków włosowych i ułamkowego odnawiania się dwutlenku węgla w gojeniu ran u ludzi, które wykazały dobre wyniki. Zastosowanie CM do terapii jest bardzo atrakcyjne i może w niedalekiej przyszłości rozkwitać, ponieważ gromadzą się badania nad stosowaniem CM w różnych chorobach . Pożywka kondycjonowana zawiera różne czynniki wzrostu i czynniki regeneracyjne tkanek, które zostały wydzielone przez komórki macierzyste. Fakt, że komórki macierzyste wydzielają różne czynniki wzrostu, został również wykazany przez różne badania proteomiczne, które wykazały obecność różnych czynników wzrostu i innych cytokin w CM .

jednak różne badania donoszą o użyciu różnych rodzajów komórek macierzystych i różnych metod, aby uzyskać CM do leczenia różnych rodzajów chorób zwyrodnieniowych w różnych modelach zwierzęcych. Dlatego ten systematyczny przegląd miał na celu zbadanie różnych metod uzyskiwania CM i różnych chorób, które były leczone, aby uzyskać wgląd w różne rodzaje CM i ich zastosowanie w różnych chorobach.

2. Materiały i metody

23 stycznia 2014 r. w Pubmed/Medline przeprowadziliśmy wyszukiwanie “wszystkich tekstów” bez ograniczeń czasowych za pomocą słów kluczowych “stem cell” i “conditioned medium” lub “secretome” i “therapy”, “all text” w Cochrane library (trials) za pomocą słów kluczowych “secretome” lub “conditioned medium” i “all text” w Cochrane library (trials). ClinicalTrials.gov za pomocą słów kluczowych “komórka macierzysta” i “uwarunkowane medium” lub “secretome” i ” terapia.”Ponadto zostały dodane odpowiednie istniejące artykuły w naszej bibliotece.

kryteria włączenia to wszystkie badania, w których CM zastosowano w określonej chorobie. Kryteria wykluczenia to badania, które nie zawierały pełnych danych dotyczących stanu pacjenta/modelu choroby, źródła CM i wyniku leczenia CM.

zbieranie danych jest następujące: leczone warunki / choroby, typ komórki, która została hodowana, szczegółowy skład pożywki i suplementów, które zostały wykorzystane do hodowli komórek, warunki hodowli (hipoksja lub normoksja) w celu uzyskania CM, cm przetwarzania, czynniki wzrostu i inne wydzieliny, które były analizowane; Sposób (tryb) aplikacji i wynik aplikacji CM zostały odnotowane, pogrupowane i tabelaryczne.

synteza danych wygląda następująco: dane zostały pogrupowane według leczonych chorób i typów komórek, które zostały użyte do wytworzenia CM. Ponadto, aby poznać plony czynnika wzrostu różnych typów komórek, jeśli są dostępne, poziomy czynnika wzrostu zostały zestawione i pogrupowane według typów komórek, które dały czynnik wzrostu zawierający uwarunkowane podłoże, w odniesieniu do liczby komórek, rodzaju i czasu trwania hodowli oraz przetwarzania uwarunkowanego podłoża. Gdy dane były dostępne, obliczono liczbę komórek potrzebnych do wytworzenia CM dla jednej aplikacji.

3. Wyniki i dyskusja

otrzymaliśmy 39 artykułów spełniających kryteria włączenia, a 7 zostało wykluczonych z powodu niepełnych danych. Różne stany / choroby były leczone przez różne CM pochodzące z komórek i w większości wykazały obiecujące wyniki (Tabela 1).

różne uwarunkowane media, nawet jeśli pochodzą z tego samego rodzaju komórek, były wytwarzane przez inny stan, to znaczy z innego przejścia, liczby komórek, pożywki hodowlanej i warunków hodowli (Tabela 2). Wydajność czynnika wzrostu różnych typów komórek można zobaczyć w tabeli 3, a numer komórki, który jest potrzebny do wytworzenia CM dla jednego zastosowania, można zobaczyć w tabeli 4.

różne badania wykazały, że uwarunkowane podłoże zostało przetestowane w różnego rodzaju chorobach /Stanach (Tabela 1), to znaczy łysieniu , ostrym i przewlekłym niedokrwieniu kończyn tylnych , ostrym i przewlekłym gojeniu się ran , zawale mięśnia sercowego , ostrym urazie/niewydolności wątroby , urazie mózgu/niedokrwieniu/udarze mózgu , urazie rdzenia kręgowego , urazie płuc i defekcie kości i wykazały poprawę warunków. Ponadto, przewlekła choroba nerek, która była leczona przy użyciu ludzkich zarodkowych komórek macierzystych pochodzących z mezenchymalnych komórek macierzystych (huESC-MSC) cm, wykazała zmniejszenie skurczowego ciśnienia krwi i białkomocz oraz poprawę uszkodzenia kanalików i kłębuszków nerkowych, przepływu krwi i szybkości filtracji kłębuszkowej . Jednak nefropatia, która była leczona przy użyciu cm z ludzkiej krwi pępowinowej unrestricted somatic stem cell (huUCB-USSC) lub mezenchymalnej komórki macierzystej szpiku kostnego myszy (MBM-MSC) CM nie wykazywała poprawy poziomu mocznika i kreatyniny w surowicy, uszkodzeń histopatologicznych i oceny aktywności fizycznej . Ponadto profilaktyka raka przy użyciu ludzkiej mezenchymalnej linii komórek macierzystych CM wykazała zwiększoną proliferację komórek nowotworowych i unaczynienie .

w dwóch przypadkach choroby nerek można stwierdzić, że CM od hu-ESC-MSC może poprawić stan, a Wymagany poziom czynnika wzrostu jest prawdopodobnie wystarczający, ponieważ przetwarzanie CM obejmuje 25-krotny etap koncentracji . Jednakże w przypadku hu-UCB-USSC lub MBM-MSC-CM brak danych dotyczących przetwarzania CM i poziomu czynnika wzrostu CM uniemożliwia dalszą analizę w celu stwierdzenia, czy brak poprawy stanu wynika z braku określonego czynnika wzrostu, czy też z poziomu czynników wzrostu, który był zbyt niski, aby dać efekt.

3.1. Podłoże hodowlane i Suplement

w niektórych badaniach stosowano płodową surowicę bydlęcą lub inny suplement zawierający kompletne podłoże,podczas gdy w innych badaniach stosowano pożywki bez surowicy. Co więcej, użyte pożywki bazowe były zmienne, na przykład aMEM, DMEM, DMEM / F12, M199, EBM2, EGM-2, in vivo 15 lub chemicznie zdefiniowane pożywki, a ten sam typ komórki można hodować w innym rodzaju pożywki bazowej (Tabela 2). Pożywka hodowlana w hodowli in vitro reprezentuje mikrośrodowisko w warunkach in vivo i może determinować los komórek, a tym samym wydzielanie komórek . W związku z tym, ten sam typ komórek może wydzielać różne poziomy czynników wzrostu, gdy hodowano je w różnych podłożach, jak widać w tabeli 3 .

3.2. Czas trwania hodowli

czas trwania hodowli waha się od szesnastu godzin do pięciu dni (Tabela 3). W przypadku zastosowania pożywki pełnej, krótki czas trwania hodowli może pozostawić pewne czynniki wzrostu pochodzące z surowicy, które nie były spożywane przez komórki i może zwiększyć poziom czynnika wzrostu lub, przeciwnie, hamować wydzielanie czynnika wzrostu przez komórki. Możliwość obecności resztkowego czynnika wzrostu z pożywki można zaobserwować w badaniu, które wykazało, że pożywka bez komórek zawierała poziom TGF-b1 pg/mL (Tabela 3) .

3.3. Warunki hodowli

większość badań produkowała CM w kulturze jednowarstwowej, ale kilka badań wykorzystywało Kultury sferoidalne(Tabela 3). Kultury sferoidalne wymagają specjalnej obsługi i wyposażenia (kolba przędzalnicza), ale dają więcej komórek w porównaniu z konwencjonalnymi kulturami jednowarstwowymi, a tym samym więcej wydzielanych czynników (Tabela 4). Ponadto komórki znajdujące się w centrum sferoidy mogą być we względnym stanie niedotlenienia w porównaniu z komórkami na powierzchni, co dodatkowo zwiększa wydajność pewnego czynnika wzrostu.

3.4. Rola czynnika wydzielanego w poprawie chorób

różne cytokiny były wydzielane przez komórki macierzyste do CM i odgrywały rolę w poprawie różnych chorób/stanów. Cytokiny te można podzielić na czynniki wzrostu, cytokiny prozapalne i przeciwzapalne oraz inne cytokiny. W różnych badaniach stosowano różne metody oceny różnych cytokin w uwarunkowanym CM, od konwencjonalnych testów ELISA po metody profilowania proteomicznego .

3.4.1. Czynniki wzrostu

ponadto badania, w których analizowano różne czynniki wzrostu, wykazały obecność różnych czynników wzrostu, które były wydzielane przez różne komórki macierzyste do ich uwarunkowanego podłoża (Tabela 3), z wyjątkiem ludzkiego MSC (Lonza), który nie wydzielał FGF-2, PDGFBB, BMP-2 i SDF-1, ale wydzielał IGF-1, VEGF, TGF β1 i HGF . Co więcej, różne warunki hodowli i podłoże mogą powodować różny poziom wydzielania czynnika wzrostu .

3.4.2. Cytokiny Pro – i przeciwzapalne

3.4.3. Inne Cytokiny

3.5. Translacja użycia kondycjonowanego podłoża u pacjentów

w kondycjonowanym podłożu różne czynniki mogą występować jako koktajl i działać wspólnie w celu promowania regeneracji. Dlatego ważne jest, aby analizować kompletny zestaw czynników wzrostu i poziomów cytokin dla każdego rodzaju uwarunkowanego pożywki pochodzącej z komórek macierzystych i znać stan Kultury, uwarunkowane przetwarzanie pożywki i choroby/warunki, które reagują na pewne uwarunkowane leczenie pożywki. Gdy zawartość różnych cytokin w określonym uwarunkowanym podłożu jest znana, można określić wynik uwarunkowanego podłoża na określoną chorobę/stan, a droga do translacji na pacjentów jest otwarta.

z badań, które analizowały poziom VEGF, możemy wywnioskować, że większość komórek macierzystych wydziela VEGF. Ponieważ VEGF odgrywa rolę w angiogenezie, która jest ważna w regeneracji uszkodzonych / uszkodzonych tkanek / narządów, różne uwarunkowane media pochodzące z komórek macierzystych są w stanie leczyć różne choroby i będą miały większy wpływ na choroby z niedokrwieniem. Ponadto VEGF może zapobiegać apoptozie w stanie niedotlenienia, zapobiegając w ten sposób dalszym uszkodzeniom .

co więcej, FGF2 jest silniejszym czynnikiem angiogennym w porównaniu z VEGF, z dodatkowym wpływem na proliferację fibroblastów, preadipocytów i śródbłonkowych, nabłonkowych i nerwowych komórek macierzystych, na migrację komórek glejowych i miogennych pochodzących z grzebienia nerwowego oraz na różnicowanie komórek neuroepitelialnych w Dojrzałe neurony i komórki glejowe .

inne czynniki wzrostu przyczyniają się do regeneracji uszkodzonych/uszkodzonych narządów tkankowych, ze szczególnym naciskiem na proliferację, to znaczy PDGF dla tkanki łącznej, komórek glejowych i innych, EGF dla komórek mezenchymalnych, glejowych i nabłonkowych oraz IGF-I i IGF-II dla różnych rodzajów komórek . Ponadto PlGF, który jest członkiem rodziny VEGF, zwiększa aktywność VEGF in vitro i In vivo, KGF hamuje wywołaną stresem oksydacyjnym śmierć komórek nabłonkowych, NGF promuje wzrost neurytu i przetrwanie komórek nerwowych, BDNF jest neuroprotekcyjny, Promuje przetrwanie komórek i zmniejsza powstawanie blizn astroglialnych , a niektóre czynniki wzrostu, w tym HEGF, FGF-7, EGF i HGF promują regenerację wątroby .

prozapalne cytokiny , które odgrywają rolę w regeneracji , to IL-1B ze względu na jego rolę ochronną wątroby, IL-8 ze względu na aktywność angiogenną i IL-9 ze względu na aktywność gojenia się ran . Ponadto cytokiny przeciwzapalne zapobiegają stanom zapalnym i wspomagają regenerację wątroby .

receptor MCSF (MCSFR) Promuje progenitor mieloidalny, fagocyty jednojądrzaste i wzrost i rozwój trofoblastów łożyskowych, a PDGFR może oddziaływać z różnymi cząsteczkami sygnalizacyjnymi lub integryną , aby spowodować proliferację, ruchliwość, różnicowanie lub przeżycie przez hamowanie apoptozy .

co więcej, jeden czynnik może przyczyniać się do więcej niż jednego trybu działania regeneracyjnego, takiego jak MCP-1, który bierze udział w angiogenezie i aktywności ochronnej wątroby . Ponadto, w przypadku produkcji CM, która ma być stosowana w różnych chorobach ludzkich, dane z badań na zwierzętach, które wykazały obiecujący wynik, są bardzo cenne.

3.5.1. Produkcja CM do przekładania na różne choroby ludzkie

aby stosować CM do różnych chorób ludzkich, metoda produkcji CM musi zostać znormalizowana pod względem rodzaju i liczby komórek, które były potrzebne do wytworzenia CM, pożywki hodowlanej i kondycji oraz obróbki pożywki uwarunkowanej. Ponadto ważna jest również wielkość i sposób dostawy. Ponieważ w różnych badaniach stosowano różne liczby i typy komórek oraz różne dawki CM, ważne jest, aby znać liczbę komórek, które dały CM dla jednego zastosowania, które mogą być interpolowane w badaniach na ludziach. Dlatego w tabeli 4 podsumowaliśmy wszystkie dane, które mogą być potrzebne do interpolacji do badań na ludziach, to znaczy, choroby, które były leczone, gatunek i wiek lub masa ciała zwierzęcia, rodzaj komórki, podłoże hodowlane i stan, liczba komórek do wytworzenia CM dla jednego zastosowania, objętość i sposób zastosowania. Ponadto różne możliwe zastosowania CM w różnych warunkach podsumowano na rysunku 1.

Rysunek 1

różne możliwości zastosowania CM w różnych warunkach.

ponadto, w celu przetłumaczenia na pacjentów, bardzo ważne jest przeanalizowanie i odnotowanie różnych zawartości cytokin w różnych uwarunkowanych mediach. Ponadto, dla każdego uwarunkowanego podłoża o znanej zawartości cytokin, należy przeprowadzić walidację jego stosowania na różnych chorobach. Wreszcie, możliwość promowania istniejącego raka powinna być badana dla każdego CM i należy zachować ostrożność przed leczeniem CM, aby upewnić się, że biorca jest wolny od raka.

zalety produkcji różnych CM dla pacjentów polegają na możliwości masowej produkcji przez firmy farmaceutyczne, gdy metody produkcji zostały znormalizowane. Kondycjonowane media nie są jak komórki macierzyste, które wymagają dobrej praktyki wytwarzania (GMP), aby były stosowane u pacjentów . Gdy CM jest odpowiednio zapakowany, może być łatwo transportowany jako lek i nie wymaga kriokonserwacji, takiej, jakiej potrzebują komórki macierzyste. Jednak w porównaniu z komórkami macierzystymi, które mogą przetrwać dość długi okres, CM należy podawać częściej, ponieważ okresy półtrwania cytokin i czynników wzrostu są w większości krótsze , co jest niekorzystne dla pacjentów, ale przyniesie większe zyski firmom farmaceutycznym.

4. Wniosek

różne uwarunkowane media pochodzące z komórek macierzystych były wytwarzane różnymi metodami i przetwarzane oraz testowane na różnych chorobach i w większości wykazały dobre wyniki. Należy jednak przeprowadzić znormalizowane metody produkcji różnych uwarunkowanych mediów i walidacji ich stosowania w różnych chorobach.

konflikt interesów

autor oświadcza, że nie ma konfliktu interesów w związku z publikacją niniejszego artykułu.

potwierdzenie

to badanie zostało sfinansowane przez grant badawczy indonezyjskiego Ministerstwa Edukacji i Kultury (Pusnas 2014), Kontrakt nr 2218/H2. R12 / HKP.05.00/2014.