Zakaźne martwicze zapalenie wątroby spowodowane przez clostridiumnovyi typu B u konia: opis przypadku i przeglądliteratura | Jiotower

zakaźne martwicze zapalenie wątroby (INH) jest spowodowane przez Clostridium novyityp B. choroba zazwyczaj dotyka owiec, w którym jest również określany jako”czarna choroba” biorąc pod uwagę ciemne przebarwienia tkanki podskórnej spowodowane przezintensywne przekrwienie żylne widoczne w tuszach zwierząt umierających z powodu tej choroby.Chociaż uważa się,że INH występuje również u innych gatunków, w tym u bydła, kóz i koni, dostępne są bardzo ograniczone informacje na temat tej choroby nieożywionych innych niż Owce.2,3,19,15 ponadto,ze względu na ścisły charakter beztlenowy, izolacja i identyfikacja C. novyi typu B jest rzadko osiągana.15 z tego powodu doniesienia o Inh są zwykle ograniczone do domniemanej diagnozy opartej na histopatologii, badaniu przeciwciała fluorescencyjnego (FAT) i/lub monohistochemii (IHC). Rodzaj C. novyi jest rzadkookreślony. W niniejszym artykule przedstawiamy potwierdzony przypadek INH koni wywołany przez C.nowy typ B, a także przegląd literatury na temat choroby.

14-letni wałach koński o wadze 511 kg został przekazany do San Bernardinobranch Kalifornijskiego systemu laboratoryjnego Zdrowia Zwierząt i Bezpieczeństwa Żywności w celu przeprowadzenia badań pośmiertnych i diagnostycznych. Zwierzę miało 3-d historię progresywnych objawów neurologicznych, temperaturę odbytnicy 38,8-40,5°C i było leczone bezskutecznie niesteroidowymi lekami przeciwzapalnymi przed śmiercią.Pełną autopsję wykonano ~6 h po śmierci.

podczas autopsji koń był w dobrej kondycji odżywczej, z odpowiednią ilością tłuszczu i w umiarkowanym stanie rozkładu pośmiertnego. Stwierdzono żółte zabarwienie twardówki, tkanki podskórnej i tłuszczowej oraz stawów stawowych. Wieloogniskowe krwotoki wybroczynowo-duszące były obecne w większości guzów, serozy przewodu pokarmowego, krezki, śledziony, opłucnej i mięśni włośnikowych serca. Krew żylna była głęboko czerwono-czarna. Osierdziowy był rozdęty dużą ilością płynu serosanguinous, a w jamie brzusznej było ~5L podobnego płynu zawierającego obfite nici fibrynowe.Wątroba była znacznie powiększona i miała zaokrąglone krawędzie; lewy płat był jędrny, ciemnoczerwony do Czarnego i miał liczne subcapsular i głębokie miąższowe pęcherzyki gazowe i obfite fibrynę nad kapsułką (Fig. 1a). Na ciętym odcinku tego płata znajdował się blady obszar o średnicy około 15 cm otoczony cienką obręczą krwotoczną (rys. 1B). Oponowo-mózgowe i rdzeń kręgowy były dyfuzyjnie zatkane, a w korze mózgowej pojawiły się krwotoki kostne. W pozostałej części tuszy nie zaobserwowano innych znaczących zgrubień.

próbki mózgu, płuc, serca, przepony, wątroby, śledziony, żołądka,jelita, trzustki, nadnerczy, krezki, nerek i pęcherza moczowego pobierano i mieszano w 10% buforowanej formalinie (pH 7,2) przez 48 godzin i rutynowo przetwarzano w celu wytworzenia fragmentów zabarwionych hematoksyliną i eozyną o grubości 4 µm (H&e). Fragmenty wątroby i nerek zostały również zabarwione odpowiednio Plamami grama i Okajima.

próbki wątroby pobrano w warunkach aseptycznych i poddano hodowli tlenowej i beztlenowej na 5% płytkach agaru owiec przez 48 godzin. PCR przeprowadzono dla wirusa Zachodniego Nilu(WNV)na zbiorczych próbkach ośrodkowego układu nerwowego oraz dla equid herpesvirus 1 (EHV-1) na wymazie z nosa. Na próbkach wątroby wykonano Sito z metali ciężkich zawierające ołów, mangan, żelazo, rtęć,arsen, molibden, cynk, miedź i kadm.Płyn mózgowo-rdzeniowy badano na obecność przeciwciał przeciwko Sarcocystisneurona przy użyciu pośredniego tłuszczu. Rozmazy wątroby były przetwarzane przez tłuszcze Clostridium chauvoei, Clostridium septicum, Clostridium sordelli i C. novyi przy użyciu koniugatów komercyjnych (Vmrd, Pullman, WA). Dodatkowo, utrwalone formaliną, osadzone w parafinie odcinki wątroby były przetwarzane przez pośredni immunoperoksydasetechnique dla C. novyi, przy użyciu zestawu handlowego (RTU VECTASTAINELITE ABC system, Vector Laboratories, Burlingame, CA). Endogenną peroksydazę wygaszono 3% roztworem nadtlenku wodoru, a następnie poddano pepsintreatacji w celu pobrania antygenu. Następnie próbki inkubowano z przeciwciałem tła (Biocare Medical, Concord, CA) w celu zablokowania niespecyficznego wiązania, przed inkubacją z kozim przeciwciałem poliklonalnym anty–C. novyi (vmrd) w temperaturze 37°C przez 60 minut. Do wizualizacji wykorzystano Wektor NovaRED chromogen (Wektorlaboratoria). Sekcje wątroby inkubowane z normalną surowicą kozą zamiast pierwotnych przeciwciał zastosowano jako kontrolę negatywną. Wątroba od krowy w whichC. novyi został zidentyfikowany przez kulturę, a PCR był używany jako kontrola pozytywna.

próbki wątroby przetwarzano do ekstrakcji DNA (QIAamp DNA FFPE Tissue kit, Qiagen,Hilden, Niemcy) zgodnie z instrukcjami producenta. Wyekstrahowane DNA wykorzystano jako szablon do testu Multiplex PCR w celu amplifikacji segmentów wiciowców (fliC) C. septicum, C. novyi Typ A, C. novyi Typ B, C. chauvoei i Clostridium haemolyticum, jak opisano wcześniej.17 ponadto opracowaliśmy konwencjonalny PCR w celu wzmocnienia segmentu theC. nowy gen toksyny Alfa typu B (Tcna) (GenBank jenv01000127.1), główny czynnik zjadliwości tego mikroorganizmu. Zaprojektowano następujące sekwencje oligonukleotydowe:5′-TGATGTTGACCCTTGCTCT-3′ (CNtBaF) i 5′-CCTTATGCAAAGGATGGCG-3′ (CNtBaR),które wzmacniają fragment DNA docelowego genu o długości ~342 bp. Konwencjonalny PCR wytworzono w całkowitej objętości 25 µL zawierającej 5 µL ekstrahowanego DNA, 0.25 µL każdego startera (10 µM), 7 µL wody wolnej od nukleaz i 12,5 µL mieszaniny wzorcowej PCR(2x, Promega, Madison, WI), zawierającej polimerazę DNA TAQ (pH 8,5, 50 U/mL), dNTPs(400 µM) i MgCl2 (3 mM). Profile termocyklera były następujące: 94°C przez 5 min, 30 cykli 94°C przez 1 min, 55°C przez 1 min i 72°C przez 1,5 min, a następnie końcowy etap przedłużania w 72°C przez 7 min. Próbki trzymano w 4°Cuntil reakcje PCR wizualizowano w świetle ultrafioletowym w ethidiumbromide (Amresco, Solon, OH) barwione 1% żele agarozowe (Agaroza SFR, Amresco). DNAextracted from C. Kultury novyi typu B (ATCC 25758), C. novyi typu A, C. septicum, C. chauvoei i C. haemolyticum były stosowane jako kontrole pozytywne. Woda zamiast DNA została użyta w kontroli negatywnejreakcje.

mikroskopowo, kapsułka wątrobowa była pokryta obficie fibryną zmieszaną z komórkami komórkowymi, a także były subkapsularne i głębokie miąższowe bulki rozedmowe różnej wielkości. Najbardziej uderzającym odkryciem była wieloogniskowa do ogniskowo ekstensywna martwica koagulacyjna, otoczona obręczą dużej liczby żywotnych anddegenerianowych neutrofili, krwotoku, fibryny, szczątków komórkowych i dużych agregatów Gram-dodatnich prętów bakteryjnych, z których niektóre miały subterminalne zarodniki (Fig. 1C,, D).D). W interweniującychrodzimie i w mniej dotkniętych wątrobie, nie było zastój żółci, wieloogniskowe krwotoki i segmentowe do rozproszonych martwicy fibrynoidów naczyń krwionośnych, z których wiele również zawierała skrzepy fibrynowe. Nabłonek kanalików nerkowych wykazywał wakuolację mildcytoplazmatyczną, a w świetle kanalików nerkowych obecne były odlewy białkowe i ziarniste. Odlewy poplamione dodatnio plamą Okajima (rys. 1e). W mózgu wystąpiły rozproszone zatory, wieloogniskowe i losowo rozrzucone krwotoki okołowaskowe oraz umiarkowane do wyraźnego rozszerzanie się przestrzeni Virchowa-Robina z obrzękiem kwasowofilnym. Otrzewna trzewna była pokryta obfitą fibryną domieszaną z dużą liczbą żywotnych i zdegenerowanych neutrofilów; większość otrzewnowych naczyń krwionośnych była zatłoczona i / lub zawierała skrzepy fibrynowe. Kilka małych tętnic i tętnic w korze i rdzeniu nadnerczy również miało skrzepy fibrynowe. Zespół miał przekrwienie naczyń i wieloogniskowe krwotoki miąższowe i torebkowe. Płuca były rozproszone i miały wieloogniskowe krwotoki i obrzęki, oprócz kilku naczyń krwionośnych zawierających skrzepy fibryny. Obserwowano krwotoki wieloskurczowe, subepicardialne i podtwardówkowe.

zdecydowana większość wewnątrzsesionalnych prętów gram-dodatnich obserwowanych w wątrobie była dodatnia dla C. novyi IHC (Fig. 1F). Tłuszcz był pozytywny dla C.nowy, ale negatywny dla innych badanych gatunków clostridial. Próbki wątroby były dodatnie dla genów Flic i tcna C. novyi typu B oraz ujemne dla genów fliC innych badanych clostridii (Fig. 2). Próbki płynu mózgowo-rdzeniowego były ujemne dla testu immunofluorescencyjnego przeciwciała S. neurona. PCR dla WNV i EHV-1 byłregatywny. Nie uzyskano znaczącego wzrostu bakterii poprzez hodowlę tlenową lub beztlenową. Badanie przesiewowe metali ciężkich wykazało podwyższone stężenie żelaza w próbkach (1500 ppm; interwał odniesienia: 100-300 ppm).

wykonaliśmy przypuszczalną diagnozę INH na podstawie zmian brutto i mikroskopowych, w połączeniu z wynikami tłuszczu i IHC dla C. novyi. Rozpoznanie INH wywołanego przez C. novyi typu B zostało potwierdzone przez wykrycie przez PCR genów fliC i tcna tego mikroorganizmu. Według naszej wiedzy zgłoszono tylko 6 przypadków podejrzenia IHN u koni. Trzy przypadki wystąpiły w Australii,8, 9,11 i po jednym w Nowej Zelandii,23 w Szkocji, 19 w Stanach Zjednoczonych (Montana).16 w tych przypadkach przypuszczalną diagnozę oparto na grubych i mikroskopowych tkankach połączonych z wykrywaniem C. novyi przez FAT, 9, 16, 19 IHC, 23 i/lub kulturę.9,19 jednak w żadnym z tych przypadków nie określono rodzaju “C. novyii”.

C. novyi jest gram-dodatnim, zarodniotwórczym, beztlenowym bacillus, który jest powszechnie spotykany w glebie i odchodach zwierząt.15 jest klasyfikowany do typów A, B I C w oparciu o zakres wytwarzanych toksyn.4C. nowy typ A wytwarza głównie śmiertelną, indukującą obrzęk alfatoksynę (TcnA) i nieśmiercionośną fosfolipazę, toksynę gamma; ta bakteria jest powiązana z gangreną gazową ludzi i zwierząt, zwykle działającą razem z innymi clostridia. C. novyi Typ B produkuje również TcnA, oprócz martwiczej i hemolitycznej toksyny beta, chociaż ta pierwsza jest uważana za najważniejszy czynnik zjadliwości dla patogenezy INH. C. novyi Typ C jest uważany za nietoksyczny i nie patogenny.13,15 C. haemolyticum było wcześniej znane jako C. novyitype D, i nadal jest określany tą nazwą przez niektórych autorów; dlatego też omówiono tutaj ten mikroorganizm. C. haemolyticum również wytwarza toksynę beta, ale w znacznie większych ilościach niż C. novyitype B; ta toksyna jest uważana za główny czynnik zjadliwości tego mikroorganizmu i jest odpowiedzialna za hemoglobinurię bacillarną (BH), chorobę dotykającą głównie bydło, która jest klinicznie i patologicznie bardzo podobna do INH.11,10,14

zarodniki C. nowe są bardzo odporne na warunki środowiskowe, a biorąc pod uwagę, że zarodniki są powszechnie spotykane w glebie, zwierzęta wypasane mogą je często spożywać.6,19 chociaż nie do końca udowodniono, obecny dogmat jest taki, że po spożyciu zarodniki C. novyi typu B są wchłaniane z jelita i docierają do wątroby poprzez krążenie wrotne, po czym przedostają się do innych narządów. Zarodniki są fagocytowane i pozostają utajone w Kupffercells wątroby oraz w makrofagach śledziony i szpiku kostnego.2,6 INH powszechnie uważa się za odpowiednik BH, ponieważ uważa się, że obie choroby występują po uszkodzeniu wątroby, powodując martwicę i związane z tym warunki beztlenowe, które są wymagane do kiełkowania utajonych zarodników i produkcji toksyn.Migracja niedojrzałych form Fasciola hepatica przez wątrobę jest uważana za najważniejszy czynnik predysponujący zarówno dla przeżuwaczy BH, jak i INHin, a obie choroby są bardziej powszechne na obszarach o wysokiej częstości występowania powięzi.1 h przeżuwaczy było również związane z Cysticercustenuicollis i innymi pasożytami, w tym Fascioloidesmagna, Dicrocoelium dendriticum ithysanosoma actinoides, 2,6,15,21,chociaż nie wykazano roli tych pasożytów w patogenezie choroby.Jednakże każde uszkodzenie wątroby prowadzące do powstania warunków beztlenowych może być czynnikiem warunkującym INH. Należą do nich, ale nie są ograniczone do, testy wątroby, biopsje, zmiany tłuszczowe, teleangiektazja i czynniki toksyczne. Po wytworzeniu TcnA i uwolnieniu przez wegetatywne formy C. nowy typ B, jego aktywność transferazy monoglikozylowej inaktywuje kilka białek wiążących guanozyno5 ‘ -trifosforan (GTP) w komórkach gospodarza, powodując zmianę i redystrybucję cytoszkieletu aktyny.3 TcnA zaburza również układ wimetyny i tubuliny.7,18 zmiany te wydają się być bardziej dramatyczne w śródbłonku kapilarnym, co prowadzi do rozległego wynaczynienia płynu obserwowanego w INH15 i prawdopodobnie zakrzepicy wielostystemicznej obserwowanej u konia naszego ciała. U owiec bardzo ostry charakter choroby utrudnia wykrywanie objawów klinicznych, a zwierzęta zwykle znajdują się martwe. W przypadkach, w których obserwuje się objawy, są niespecyficzne i obejmują osłabienie, letarg,anoreksję, hipertermię, tachypnea, hiperpnea i wreszcie cofanie się. Zmiany kliniczne mogą obejmować neutrofilię z przesunięciem w lewo, azotemię,kwasicę metaboliczną oraz zwiększoną aktywność enzymów wątrobowych i mięśniowych.15,19

biorąc pod uwagę,że wcześniej opisano tylko 6 przypadków domniemanego INH u koni, dostępne informacje epidemiologiczne, kliniczne i patologiczne są nikłe. Opierając się na ograniczonej liczbie przypadków, nie ma widocznych predyspozycji do płci lub rasy u koni INH, a zarówno młode, jak i dorosłe zwierzęta mogą być dotknięte. Przebieg choroby u koni jest zwykle dłuższy niż u przeżuwaczy, trwa 12-72 h, a wynik zawsze był śmiertelny. Objawy kliniczne wahają się od łagodnej do ciężkiejdepresji i niechęci do poruszania się, objawy neurologiczne, w tym ataksja i zapalenie głowy, hiperemia i (lub) żółtaczka błon śluzowych i twardówki oka,ból brzucha i recumbency.20,23 w jednym przypadku, w którym przeprowadzono abdominocentezę, uzyskano zwiększoną ilość mętnego płynu o podwyższonym stężeniu białka i zwiększonej grawitacji.

profil kliniczno-patologiczny koni z INH jest bardzo zmienny i może wykazywać różne stadia zatrucia i uszkodzenia wątroby. Zmiany te mogą obejmować neutrofilię z przesunięciem w lewo,zwiększoną aktywnością enzymów wątrobowych, trombocytopenię, hiperfibrynogenemię, hiperbilirubinemię i zmniejszoną koncentrację elektrolitów.Ponadto odnotowano zwiększenie częstości występowania tromboplastyny częściowej, protrombiny i trombiny.Zmiany te, w połączeniu z obserwowaną mikrochrombią naczyń włosowatych, są zastoinową postacią rozsianego wykrzepiania wewnątrznaczyniowego, procesem, który może wystąpić podczas przebiegu toksemii i hemolizy u dużych zwierząt.22,23 istnieje nadmierne zużycie czynników krzepnięcia, ich zmniejszona synteza z powodu niewydolności wątroby oraz synergiczne działanie TcnA na śródbłonek naczyniowy są prawdopodobnie odpowiedzialne za powszechne krwotoki obserwowane w przypadkach unh.

chociaż icterus nie jest opisany u przeżuwaczy, konie mogą czasami wykazywać ten znak związany z INH.19,23 żółtaczka wydaje się być związana z ciężkością uszkodzenia wątroby i do pewnego stopnia z hemolizą, jak w naszym przypadku, w którym hemoglobina była wizualizowana w kanalikach nerkowych przez plamę Okajima. Koń w naszym badaniu miał umiarkowanie zwiększone stężenie żelaza w wątrobie, co sugeruje proces hemolityczny.5 ten poziom żelaza w wątrobie jest jednak częstym odkryciem u koni z różnych przyczyn i jest często uważany za przypadkowe odkrycie związane z zatorem i pośmiertną autolizą (niepublikowane przez autorów zachowanie).

chociaż można postawić hipotezę, że konie są bardziej podatne niż inne specjały na działanie hemolitycznej toksyny beta wytwarzanej przez C. novyitype B, zmiany hemoglobiny nie zostały opisane w domniemanych przypadkach Inh.16,23 w porównaniu z C. haemolyticum, C. novyi typu B wytwarza niższe poziomy toksyny beta;15 dlatego przypuszcza się, że jego udział w patogenezie INH powoduje pewien stopień hemolizy u koni, ale nie na tyle, aby wywołać istotne zmiany związane z hemoglobinurią. Ponadto żaden z poprzednich przypadków nie wykluczał roli C. haemolyticum jako czynnika sprawczego choroby, więc z tych przypadków nie można wyciągnąć ostatecznych wniosków. C. haemolyticum został zaangażowany w przypadku septycznego zapalenia otrzewnej ina mare poprzez identyfikację z MALDI-TOF; jednak w tym konkretnym przypadku nie podjęto próby identyfikacji PCR lub toksyny.11

czynnik predysponujący do INH u koni nie zawsze był ustalany, chociaż migracje wątrobowe F. hepatica i pokrewnych trematodów, jak również członków rodziny Strongylidae, zostały przebadane.9,12,19 dodatkowo, leczenie przeciwminowe przed zestawem objawów klinicznych zostało zasugerowane jako potencjalny WYZWALACZ choroby, 9, 16, 23 przypuszczalnie przez spowodowanie pewnego stopnia martwicy wątroby powiązanej ze zniszczeniem migrujących pasożytów. Nie ma jednak dowodów naukowych na poparcie tej hipotezy. Niestety w naszym przypadku nie ustalono znanych czynników wpływających na

podobnie jak w naszym przypadku, większość poprzednich doniesień opisywała pojedyncze (wielokrotne w jednym przypadku19) ognisko martwicy wpływającej na wątrobę, konsekwentnie zlokalizowane w lewym płatku. Kontrastuje to z Inh owiec, w których losowo rozmieszczone, małekrotyczne ogniska są bardziej powszechne.6,15 przyczyna tego zróżnicowania w dystrybucji nie jest znana. Możliwe, że przewaga krwi portalowej na lewym płacie związana jest z tzw. strumieniowaniem portalowym, które jest odpowiedzialne za różnicowy przepływ krwi portalowej do poszczególnych płatów płata. Ponieważ C. novyi jest prawdopodobnie wchłaniany z drobnoustroju, a krew z tego narządu podąża za portalem do lewego płata, może to spowodować, że ten płat zostanie w przeważającej mierze dotknięty.Brak zmian związanych z encefalopatią wątrobową (np.Alzheimera typu II gwiaździsta związana z hiperamonemią) 6 może sugerować, że objawy neurologiczne w tym i poprzednich przypadkach były następstwem krwotoków, zatorów i obrzęku okołonaczyniowego odnotowanych w mózgu, związanych z toksemią i działaniem tcna na śródbłonek naczyń włosowatych.

INH powinien znajdować się na liście diagnostyki różnicowej koni z objawami neurologicznymiklinicznymi, toksemią, ostrą niewydolnością wątroby i zapaleniem otrzewnej. Mimo, że leczenie dużymi dawkami penicyliny i tetracyklin może być skuteczne przeciwko STC. nowy, zaawansowana produkcja toksyn zwykle skutkuje w złym rokowaniu.19 na obszarach, na których choroba jest wyraźnie związana z flukami wątroby i/lub innymi pasożytami, jako środki zapobiegawcze można próbować zmniejszyć obciążenie pasożytnicze i ograniczyć dostęp zwierząt Do słabo osuszonych pastwisk.15

biorąc pod uwagę, że przyjmuje się, że kilka chorób kostnych wiąże się z przyspieszonym rozkładem pośmiertnym, ważną kwestią dla prawidłowej diagnozy choroby jest potrzeba szybkiej oceny i zachowania tkanek po śmierci zwierzęcia.6,23 wywiad kliniczny, rutynowa autopsja, histopatologia i utrzymywanie odporności C. novyi w uszkodzeniach wątroby są niezbędne, aby zapewnić przypuszczalną diagnozę INH. Ponieważ izolacja nie zawsze jest udana, biorąc pod uwagę surowe wymagania beztlenowe mikroorganizmu,identyfikacja molekularna za pomocą PCR jest cennym narzędziem do zapewnienia etiologicznej diagnozy i odróżnienia C. novyi typu B od innych patogenów kostnych.