Interpretacja ilościowego badania DNA wirusa cytomegalii: zrozumienie perspektywy laboratoryjnej | Jiotower
charakterystyka testu analitycznego
istnieją cechy wydajności testów miana wirusa, które należy rozumieć, aby prawidłowo wykorzystać i zinterpretować wyniki testu. Obejmują one granicę wykrywalności (LOD), dolny i górny LOQ, zakres liniowy, precyzję (odtwarzalność) i dokładność. Lod, zdefiniowany jako najniższe stężenie DNA, które można wykryć w 95% replikatów, jest zwykle używany do jakościowych badań molekularnych; termin ten można jednak również stosować do ilościowych testów miana wirusa. Górne i dolne LOQ są najwyższymi i najniższymi stężeniami DNA, które można określić ilościowo z “akceptowalną precyzją”. Obecnie nie ma uzgodnionej definicji “dopuszczalnej precyzji”, dlatego poszczególne laboratoria definiują ją lokalnie. Sposób definiowania “dopuszczalnej precyzji” może znacznie wpłynąć na LOQ. LOD może być równoważny niższemu LOQ lub może być niższy niż niższy LOQ. W tej ostatniej sytuacji test może wykryć DNA CMV, ale wartość nie może być dokładnie określona ilościowo. W takich przypadkach laboratorium może zgłosić wynik jako “wykryty, ale poniżej LOQ”; niektóre laboratoria zgłaszają to jako ” niski dodatni.”Laboratorium powinno być w stanie dostarczyć zarówno LOD, jak i LOQ; na przykład w naszym laboratorium Lod testu miana wirusa CMV wynosi 100 kopii/mL, podczas gdy LOQ wynosi 300 kopii/mL. Po konsultacji z klinicystami podjęto decyzję o zgłoszeniu wartości 100-300 kopii / mL jako “niski wynik dodatni”, podczas gdy wartości >300 kopii/mL są podawane jako wartość całkowita.
chociaż bardzo czułe testy molekularne są często ważne dla wykrywania patogenów zakaźnych, może tak nie być w przypadku testów DNA CMV. Znaczenie kliniczne niskiego poziomu CMV DNA (< 100-500 kopii / mL) może być trudne do zinterpretowania, szczególnie w przypadku badania próbek pełnej krwi, ponieważ niski poziom CMV DNA w pełnej krwi lub osoczu nie zawsze koreluje z rozwojem choroby. Przeprowadzono kilka badań w celu określenia progu leczenia, w tym badanie historii naturalnej choroby CMV u biorców przeszczepu wątroby . Stosując COBAS Amplicor Monitor test (Roche Molecular Diagnostics), autorzy wykazali, że wartość miana wirusa 2000-5000 kopii/mL koreluje z rozwojem choroby narządu końcowego. Ta wartość odcięcia jest zależna od testu i może być wyższa lub niższa dla innych Ldt. Badania wykazały również, że zarówno wartość miana wirusa, jak i szybkość zmiany miana wirusa są ważnymi czynnikami predykcyjnymi rozwoju aktywnej choroby . Im szybszy wzrost wartości miana wirusa, tym większe ryzyko rozwoju choroby CMV. Po ponownej kalibracji testów zgodnie z międzynarodową normą można zidentyfikować uniwersalne klinicznie istotne LOD i niższe LOQ. Na podstawie aktualnie dostępnych danych i doświadczeń, 250-500 J.M./mL może być odpowiednim LOD i (lub) niższym LOQ.
biorąc pod uwagę, że większość Ldt wykorzystuje technologie łańcuchowej reakcji polimerazy w czasie rzeczywistym, liniowy zakres testów miana wirusa CMV wynosi zwykle co najmniej 6 log10; na przykład test może wykryć od 2, 0 log10 kopii/mL (100 kopii/mL) do 7, 0 log10 kopii/mL (10 milionów kopii/mL). Przegląd badań miana wirusa CMV przeprowadzonych w 2009 r.w laboratoriach medycznych Emory wykazał, że z około 8500 testów miana wirusa CMV DNA wykonanych na próbkach osocza, 671 (7,9%) było pozytywnych. Spośród nich, 394 (58, 7%) było <1000 kopii/mL, 169 (25, 2%) było między 1000 a 10 000 kopii/mL, a 63 (9, 4%) między 10 000 a 100 000 kopii/mL. Ponadto u 45 (6, 7%) miano wirusa CMV DNA wynosiło >100 000 kopii/mL. Chociaż niskie wartości miana wirusa są powszechne, ich znaczenie kliniczne jest niejasne. Bardzo wysokie wartości miana wirusa występują niezbyt często, a gdy występują, są zwykle obserwowane u pacjentów z immunosupresją z pierwotnym zakażeniem CMV lub u pacjentów z bardzo ciężką chorobą. Ponieważ u niektórych osób może występować nawet 10 milionów wiremii, górna granica oznaczalności testu powinna znajdować się w tym zakresie.
interpretacja istotnych różnic w podłużnych wartościach miana wirusa u danego pacjenta wymaga zrozumienia precyzji lub odtwarzalności testu. Zazwyczaj zmienność testów miana wirusa jest największa w pobliżu dolnego i górnego LOQ i najniższa w środkowym zakresie testu. W rezultacie niewielkie zmiany w niskiej wartości miana wirusa nie są istotne; na przykład nie ma wyraźnej różnicy między wynikami u pacjenta, u którego wartość miana wirusa wzrosła z 200 kopii/mL do 500 kopii/mL, ponieważ różnica ta mieści się w zmienności testu. Najbardziej przydatne dane dotyczące klinicznie istotnych zmian miana wirusa pochodzą z doświadczeń ze stosowaniem wirusa HIV-1. W przypadku tych testów zatwierdzonych przez FDA zmienność testu waha się od 0,1 log10 kopii/mL do 0,2 log10 kopii/mL, w porównaniu ze zmiennością biologiczną obserwowaną u przewlekle zakażonych nieleczonych osób, która wynosi około 0,3 log10 kopii/mL. Dlatego uważa się, że zmiany miana wirusa >0, 5 log10 kopii/mL stanowią biologicznie istotne zmiany w replikacji wirusa. Chociaż wartość 0,5-log10 kopii / mL została powszechnie przyjęta do stosowania z wieloma innymi patogenami wirusowymi, może nie być dokładna dla CMV. Ze względu na to, że biologiczna zmienność CMV nie jest znana, ważne zmiany wartości miana wirusa oceniano historycznie wyłącznie na podstawie zmienności testu. Dalsze prace z HIV-1 wykazały, że SD testu musi wynosić ≤0, 15 log10 kopii/mL, aby rozpoznać 5-krotne zmiany miana wirusa . W przypadku CMV Ldt zmienność testu nie powinna być lepsza niż w przypadku zatwierdzonych przez FDA testów miana wirusa HIV-1 i może być wyższa, szczególnie w pobliżu niższego LOQ . W związku z tym, podczas wykrywania wartości miana wirusa CMV <1000 kopii/mL, zmiany <5-krotne (0.7 log10) rzadko odzwierciedlają klinicznie istotne zmiany w replikacji wirusa. Dla wartości >1000 kopii/mL, 3-krotne (0, 5 log10) zmiany miana wirusa mogą być istotne, chociaż mogą się różnić w zależności od Ldt. Niektóre ośrodki zgłaszają miano wirusa jako kopie / mL i jako log10 kopii/mL, ponieważ klinicyści mogą być mniej skłonni do nadinterpretowania niewielkich zmian w wartościach miana wirusa, wyrażonych jako log10.
w dniu rozpoczęcia leczenia CMV należy pobrać próbkę wyjściową do badania miana wirusa, nawet jeśli badanie miana wirusa CMV przeprowadzono kilka dni wcześniej. Szybkie zwiększenie miana wirusa CMV może wystąpić w ciągu kilku dni u pacjentów z nieleczoną chorobą, co sprawia, że ważne jest uzyskanie wartości miana wirusa CMV w czasie leczenia. Jeśli wartości miana wirusa przekraczają górny LOQ, zaleca się, aby laboratorium rozcieńczyło próbkę w celu określenia rzeczywistej wartości miana wirusa. Po rozpoczęciu leczenia, idealny interwał do monitorowania jest tygodniowy, ponieważ okres półtrwania DNA CMV w osoczu wynosi 3-8 dni . Innym powodem stosowania tego odstępu jest to, że nierzadko miana wirusa DNA CMV zwiększa się u pacjenta kilka dni po rozpoczęciu leczenia, co może być błędnie interpretowane jako niepowodzenie leczenia. Ponieważ pacjenci z trwałym DNA w osoczu lub pełnej krwi są narażeni na zwiększone ryzyko nawrotu choroby , aktualne wytyczne zalecają kontynuowanie leczenia przeciwwirusowego do czasu, gdy wartości miana wirusa będą niewykrywalne. U niektórych pacjentów utrzymuje się niski poziom CMV DNA w osoczu lub pełnej krwi i nigdy nie rozwija się choroba CMV lub nawrót choroby. U tych osób bardziej użyteczne jest śledzenie trendów w wartościach miana wirusa w czasie niż ocena znaczenia danej wartości miana wirusa. Wzory wiremii, które są niepokojące dla wirusa lekoopornego obejmują te, które nie zmniejszają się po 2 tygodniach odpowiedniej terapii, te z plateau w tempie spadku wiremii, i te, które mają początkowy spadek, a następnie kolejny wzrost wiremii podczas leczenia. U tych pacjentów należy ocenić oporność wirusa poprzez sekwencjonowanie genów UL97 i (lub) UL54 (polimeraza) bezpośrednio z próbki osocza.
testy miana wirusa CMV DNA są zaprojektowane tak, aby nie reagowały krzyżowo z innymi herpeswirusami. U pacjenta z obniżoną odpornością wykrycie 2 herpeswirusów, na przykład CMV i wirusa Epsteina-Barr, odzwierciedla reaktywację obu wirusów i nie jest spowodowane reaktywnością krzyżową.
