Mutacje chromometylazy Arabidopsis cmt3 blokują metylację bez CG i wyciszanie endogennego genu | Jiotower

wyniki i dyskusja

aby zidentyfikować czynniki, które kontrolują metylację i wyciszanie genów WS PAI, wyizolowaliśmy zmutowany wariant ws, pai1C251Y, w którym wyciszanie metylowanego genu singletowego PAI2 może być wizualizowane przez intensywność niebieskiego fluorescencyjnego fenotypu rośliny pod ultra-światło fioletowe (UV) (bartee and Bender 2001). W szczepie pai1C251Y jedynymi potencjalnymi źródłami aktywności enzymu PAI są Gen PAI1, który jest sparaliżowany przez mutację missense, oraz Gen PAI2, który jest wyciszony. Z powodu tego niedoboru PAI, szczep gromadzi fluorescencyjne półprodukty szlaku tryptofanowego, a także wykazuje żółto-zieloną pigmentację liści, Zmniejszony rozmiar, zwiększoną krzaczastość i zmniejszoną płodność. Jednak mutacje drugiego miejsca, które łagodzą wyciszanie PAI2, stłumią fenotypy z niedoborem PAI (Bartee and Bender 2001). W ten sposób mutagenizowaliśmy szczep pai1C251Y i przesiewaliśmy sadzonki o tłumionych słabych fenotypach fluorescencyjnych. Jako drugi ekran testowaliśmy metylację PAI poprzez analizę Southern blot z użyciem wrażliwych na metylację enzymów restrykcyjnych. W szczególności, badaliśmy metylację izoschizomerami HpaII i MspI, które rozpoznają sekwencję 5 ‘- CCGG-3’. HpaII jest wrażliwy na metylację zarówno wewnętrznych (CG), jak i zewnętrznych (CNG) cytozyn, podczas gdy MspI jest wrażliwy tylko na metylację zewnętrznych cytozyn. Enzymy te rozszczepiają się raz w każdym locus WS PAI i ujawniają zarówno gęstość, jak i wzór metylacji dla każdego genu(Bender and Fink 1995; Luff et al. 1999; Melquist et al. 1999).

z tej strategii przesiewowej wyizolowaliśmy 11 alleli utraty funkcji w genie CMT3 (patrz poniżej oraz materiały i metody). Mutanty cmt3 w tle pai1C251Y wykazywały silnie zmniejszoną fluorescencję we wczesnym rozwoju sadzonek i częściowo zmniejszoną fluorescencję u dorosłych roślin, ze zwiększonymi rozmiarami, zmniejszoną krzaczastością i zwiększoną płodnością (Fig. (Rys.1).1). Te pośrednie fluorescencyjne Izolaty cmt3 nie powróciły do nonfluorescencji, co jest diagnostyką utraty resztkowej metylacji PAI2 (Bender and Fink 1995), z wykrywalną częstotliwością. Wykazywały one częściowo zwiększone rozszczepienie z HpaII i silnie zwiększone rozszczepienie z MspI dla genów PAI w stosunku do rodzicielskiego pai1C251Y (Fig. (Rys.2A).2A). Schemat rozszczepiania sugerował, że mutanty cmt3 miały największy wpływ na utrzymanie metylacji CNG genów PAI. Aby ustalić, czy mutanty cmt3 miały również wpływ na metylację wysoce powtarzającej się sekwencji genomowej, poddaliśmy Hpaii / Mspi Southern blot sondą sekwencji powtórzeń centromerowych (CEN) o długości 180 bp (Vongs et al. 1993). Ta sonda wykazała niewielki wpływ na rozszczepienie HpaII, ale zwiększyła rozszczepienie MspI, zgodnie ze wzorem obserwowanym dla genów PAI (rys. (Rys.2b).2b). Podobny wzorzec zwiększonego rozszczepiania MspI zaobserwowano również przy powtarzanym rDNA (dane nie pokazane). Wszystkie badane allele 11 cmt3 miały identyczne wzorce metylacji w tych testach. Ponadto, gdy allele cmt3 zostały oddzielone od allelu pai1C251Y na tle ws typu dzikiego, wykazywały one również identyczne wzorce metylacji w tych testach (Fig. (Rys.2).2). Wzorce metylacji PAI i CEN były różne od wzorców indukowanych przez scharakteryzowane mutacje z niedoborem metylacji ddm1 i met1 (Fig. (Rys.2;2; Bartee and Bender 2001).

aby dokładniej określić wzorce metylacji w tle mutacji cmt3, wykonaliśmy sekwencjonowanie genomowe wzorców metylacji w regionach promotorów PAI1 i PAI2 reprezentatywnego allelu cmt3, stosując mutagenezę bisiarczynu sodu (Frommer et al. 1992). Analiza ta wykazała, że większość metylowanych cytozyn (87% w PAI1 i 70% W PAI2) występuje przy pozostałościach CG (Fig. (Rys.3; 3; Table Table1).1). W porównaniu z promotorem ws pai1 typu dzikiego (Luff et al. 1999; tabela Table1),1), metylacja CG została zmniejszona o 34%, metylacja CNG została wyeliminowana, a metylacja asymetryczna została zmniejszona o 93%; w promotorze PAI2 metylacja CG została zmniejszona o 8%, metylacja CNG została zmniejszona o 92%, a metylacja bez CG została zmniejszona o 75%. Tak więc utrata funkcji CMT3 ma silny wpływ na utrzymanie CNG i asymetrycznej metylacji oraz słabszy wpływ na utrzymanie metylacji CG. Wyniki te są zgodne z doniesieniami, że Arabidopsis CMT3 i kukurydza ZMET2 są ważne dla utrzymania metylacji CNG w różnych miejscach genomu (Lindroth et al. 2001; Papa et al. 2001), ale dalej pokazują, że CMT3 jest również ważny dla utrzymania asymetrycznej metylacji genów PAI. Wynik ten oznacza albo, że CMT3 bezpośrednio kontroluje zarówno symetryczną, jak i asymetryczną metylację, albo że zmniejszenie symetrycznej metylacji w zmutowanym tle cmt3 powoduje redukcję asymetrycznej metylacji jako wtórną konsekwencję. Ponieważ metylowane sekwencje w promotorze i pierwszym eksonie genu reporterowego PAI2 (∼370 bp) zawierają tylko 16 rozproszonych motywów CG, utrata metylacji bez CG znacząco hipometyluje ten region genu (Fig. (Rys.3), 3), co odpowiada zwiększonej ekspresji PAI2 u mutanta supresorowego.

zmutowane locus cmt3 w izolatach supresorowych pai1C251Y cmt3 mapowano przez krzyżowanie z polimorficznym szczepem Nd-0, który ma podobny układ gęsto metylowanych genów PAI, jak w WS (Melquist et al. 1999). Potomstwo F2 o fenotypach słabo fluorescencyjnych, diagnozujących homozygotyczność zarówno dla pai1C251Y, jak i cmt3, zostało zidentyfikowane na podstawie oględzin w świetle UV i potwierdzone przez Mspi Southern blot dla silnego rozszczepu PAI podobnego do obserwowanego w izolatach supresorowych rodziców. Mapowanie populacji roślin F2, które spełniły te kryteria, zostało następnie wykorzystane do oceny loci genomowych związanych z tłumionym fenotypem. Analiza map wykazała powiązanie z pojedynczym locus na dolnym ramieniu chromosomu 1. Ponieważ przypuszczalny Gen metylotransferazy cytozyny cmt3 mapuje to locus, skupiliśmy się na tym genie jako kandydacie. W każdej mapowanej populacji znaleźliśmy pełne powiązanie z polimorficznym markerem, który znajduje się w obrębie 100 kb genu CMT3. Aby potwierdzić, że Gen CMT3 był miejscem mutacji tłumiących metylację, sklonowaliśmy i zsekwencjonowaliśmy gen z 11 zmutowanych izolatów. Sekwencjonowanie ujawniło pojedynczą zasadową zmianę w sekwencji kodującej CMT3 w każdym izolacie. Trzy zmutowane allele miały wpływ na absolutnie zachowane aminokwasy w katalitycznej domenie metylotransferazy, w tym reprezentacyjny allel cmt3G456D używany do sekwencjonowania bisiarfitu. Przewidywano, że inny allel przedwcześnie zakończy działanie białka. Dwa allele stworzyły mutacje Splice junction. Pozostałe pięć alleli miało wpływ na aminokwasy między motywem metylotransferazy IV A końcem C białka, które są wysoce zachowane wśród genów CMT (Fig. (Rys.4).4).

aby dodatkowo potwierdzić, że Gen CMT3 był zmutowanym locus, przekształciliśmy Izolaty cmt3 pai1C251Y z genomowym klonem genu CMT3 typu dzikiego. Transformantowe sadzonki były silnie fluorescencyjne, podobnie jak w przypadku szczepu pai1C251Y (rys. (Rys.1).1). Linie transformantowe oznaczone przez Analizę Southern blot w generacji T2 wykazały remetylację genu PAI2 do poziomów obserwowanych w oryginalnym szczepie pai1C251Y (dane nie pokazane). Tak więc, sklonowany Gen CMT3 może uzupełniać zmutowane defekty metylacji. W ramach kontroli Mutant pai1c251y cmt3G456D został również przekształcony genomowym klonem genu CMT2 typu dzikiego WS. Siewki transformujące CMT2 były słabo fluorescencyjne, podobnie jak w przypadku nieprzetransformowanego szczepu rodzicielskiego (rys. (Rys.1), 1) i nie wykazywały wykrywalnej remetylacji PAI2. Analiza ta pokazuje, że CMT2 nie może zastąpić funkcji CMT3. W związku z tym warto zauważyć, że CMT2 różni się od CMT3 przede wszystkim sekwencją N-końcową (rys. (Rys.44).

wcześniej scharakteryzowane szczepy Arabidopsis z niedoborem metylacji z defektami w genie ddm1 związanym z czynnikiem przebudowy chromatyny SWI2/SNF2 (Jeddeloh et al. 1999) lub Gen metylotransferazy cytozyny met1 związany z Dnmt1 wykazuje postępujące nieprawidłowości rozwojowe (Finnegan et al. 1996; Kakutani et al. 1996; Ronemus et al. 1996). Nasza wstępna analiza sześciu generacji wsobnych szczepów pai1C251Y cmt3 i dwóch generacji wsobnych szczepów cmt3 nie wykazała wyraźnej segregacji zmian morfologicznych. Ta różnica między cmt3 a innymi mutantami z niedoborem metylacji prawdopodobnie odzwierciedla fakt, że metylacja CG jest utrzymywana w większym stopniu w cmt3 niż w ddm1 lub met1 (Fig. (Rys.2;2; Bartee and Bender 2001). Ponieważ wiele endogennych metylowanych miejsc w genomie Arabidopsis, takich jak CENOPSIS (rys. (Rys.2;2; Vongs et al. 1993; Lindroth et al. 2001), oraz promotor genu homeo-domeny FWA (Soppe et al. 2000; Lindroth et al. 2001), przenoszą głównie metylację CG, nie można oczekiwać, że mutacje cmt3 będą silnie wpływać na te loci. Zamiast tego, CMT3 najprawdopodobniej działa jako wzmacniająca metylaza, która dodaje dodatkową warstwę metylacji do określonych regionów genomowych, takich jak geny PAI, w których zwiększona gęstość metylacji prowadzi do zwiększonego wyciszania. Specyficzny model polega na tym, że podstawowa warstwa metylacji CG zapewniona przez inne funkcje, takie jak MET1, może służyć jako przewodnik dla CMT3, który następnie ozdobi warstwę podstawową dodatkową metylacją CG i bez CG. Rekrutacja CMT3 do docelowych regionów może obejmować interakcje białek chromatyny z motywem chromodomeny (Henikoff and Comai 1998), wraz z interakcjami za pośrednictwem unikalnych sekwencji N-końcowych.

ponieważ grzyby takie jak Neurospora crassa i Ascobolus immersus mogą utrzymywać metylację bez CG (Selker et al. 1993; Goyon et al. 1994), organizmy te mogą kodować geny CMT. Odwrotnie, ponieważ zwierzęta takie jak ludzie i myszy nie mają metylacji CG, przewiduje się, że organizmy te nie mają genów CMT, jak to ma miejsce w przypadku analiz bieżących baz danych sekwencji. Widoczny brak metylaz podobnych do CMT w genomach zwierzęcych (Finnegan and Kovac 2000) sugeruje, że zwierzęta wyewoluowały alternatywne mechanizmy wzmacniania Stanów chromatyny.