przeciwciało skierowane przeciwko claudin-1 jako potencjalnej terapii raka jelita grubego

próbki CRC

w celu profilowania ekspresji genów wybraliśmy 143 próbki nowotworów od 143 pacjentów włączonych do trzech kohort: prospektywne badanie jednoośrodkowe REGP (19 pacjentów) (GSE62322), retrospektywne badanie wieloośrodkowe REGP (19 pacjentów) (gse62322), retrospektywne badanie wieloośrodkowe cosival (68 pacjentów) i prospektywne wieloośrodkowe badanie biocolon (56 pacjentów) (Gse62080 i gse72970). W tych trzech badaniach kryteriami włączenia były: histologicznie udowodniony gruczolakorak okrężnicy, zaawansowany i mierzalny dwuwymiarowo guz (stadium IV), wiek od 18 do 75 lat oraz stan sprawności Światowej Organizacji Zdrowia (WHO) ≤2. Przed każdym leczeniem wszyscy pacjenci przeszli operację pierwotnej resekcji guza lub biopsji endoskopowej.

do analizy western blot wykorzystano 13 dodatkowych próbek guza z prospektywnego jednoośrodkowego badania REGP, ale nieuwzględnionych w 143 próbkach.

do analizy immunohistochemicznej próbki tkanek od 52 dodatkowych pacjentów z CRC były retrospektywnie wybierane z Institute of Cancer Research of Montpellier pathology files tylko wtedy, gdy dla tego samego pacjenta dostępne były normalne próbki błony śluzowej, gruczolaka i gruczolakoraka.

wszystkie badania z wykorzystaniem próbek tkanek ludzkich zostały zatwierdzone przez odpowiednie komitety etyczne, a wszyscy uczestnicy zostali poinformowani o celach i metodach badania i podpisali pisemną świadomą zgodę przed zapisaniem się.

analiza ekspresji genu

próbki jelita grubego (normalne próbki jelita grubego, pierwotnego guza i przerzutów do wątroby do badania REG / P, ale tylko pierwotne próbki guza do badań COSIVAL i BIOCOLON) zostały pobrane w czasie operacji po znormalizowanej procedurze w celu uzyskania wysokiej jakości RNA . Następnie próbki hybrydyzowano z ludzkim genomem U133 Plus macierzami 2,0 (Affymetrix Inc., Santa Clara, CA).

aby zidentyfikować nowe cele terapeutyczne dla terapii opartej na przeciwciałach w mCRC, porównaliśmy profile ekspresji genów w prawidłowych próbkach tkanek błony śluzowej (n = 17), guza pierwotnego (N = 20) i przerzutów do wątroby (n = 19).

ponieważ heterogeniczność CRC musi być brana pod uwagę przy porównywaniu profili ekspresji genów, pierwotne próbki nowotworu (n = 143) zostały sklasyfikowane przy użyciu klasyfikacji molekularnej CRC opartej na profilach ekspresji genów zaproponowanych przez trzy niezależne grupy oraz według niedawnej klasyfikacji konsensusowej . Krótko, De Sousa E. Melo et al. zaproponowano grupowanie nowotworów w trzech klasach: CCS1 (CRC z niestabilnością mikrosatelitarną, MSI), CCS2 (rak z niestabilnością chromosomalną, CIN) i CCS3 (nowy Podtyp). Sadanandam et al. zidentyfikowano pięć podtypów molekularnych, opartych na fenotypie komórki: podobny do kielicha, Amplifikujący tranzyt (TA), Enterocyt, podobny do łodygi i zapalny . Marisa i in. opisano sześć podtypów molekularnych (C1 do C6) o następujących głównych cechach: C1 = CIN i obniżona Regulacja szlaków immunologicznych, C2 = MSI, C3 = zmutowany KRAS, C4 = fenotyp podobny do komórek macierzystych, C5 = CIN i obniżona Regulacja szlaków WNT oraz C6 = CIN i normalny profil ekspresji genów . Wreszcie, wychodząc od sześciu wcześniej opublikowanych podpisów, międzynarodowe konsorcjum przedstawiło klasyfikację z czterema podtypami konsensusu: MSI (CMS1), canonical (CMS2), metabolic (CMS3) i mesenchymal (CMS4) (do przeglądu ). Rozkład próbki CRC według podtypu molekularnego przedstawiono w dodatkowym pliku 1: Tabela S1.

analiza Immunohistochemiczna

próbki zmontowano w tkance micro-array (TMA) przy użyciu trzech rdzeni tkankowych (każdy o średnicy 0,6 mm), jak opisano wcześniej . Krótko, 3-µm odcinki TMA były de-parafinowane i ponownie nawodnione w stopniowanych alkoholach. Indukowane Cieplnie pobieranie antygenu przeprowadzono przez inkubację sekcji TMA w buforze EDTA (pH 9) w temperaturze 98 °C w łaźni wodnej przez 20 minut. Po neutralizacji endogennej aktywności peroksydazy, sekcje TMA inkubowano z poliklonalnym przeciwciałem anty-CLDN1 (JAY-8, ZYMED laboratories Inc, CA, USA) lub rozcieńczalnikiem przeciwciała (DAKO, Glostrup, Dania) przez 60 minut. Pierwotne Wiązanie przeciwciał było wizualizowane za pomocą systemu Envision® i DAKO Autostainer® (DAKO, Glostrup, Dania). Odsetek komórek CLDN1-dodatnich i intensywność barwienia (0, bez barwienia; 1, żółtawy; 2, brązowy; i 3, ciemnobrązowy) oceniano dla każdej pojedynczej plamki TMA.

Analiza Western blot

próbki tkanek nowotworowych od pacjentów mielono bezpośrednio w buforze do lizy (150 mM NaCl, 10 mM tris pH 7,4, 1 mm EDTA, 1 mm EGTA, 1% SDS, 1% Triton X-100, 0,5% NP-40, 2 mM PMSF, 100 mM NaF, 10 mM ortowanadan sodu, jedna tabletka inhibitora proteazy koktajlowej na 10 ml) za pomocą mieszalnika Mill® mm 300 (QIAGEN, Valencia, CA). Stężenie białka oznaczano metodą Bradforda (Pierce Coomassie Plus Protein Assay). Następnie 50 µg wszystkich białek zostało rozdzielone przez 12% SDS-PAGE i przeniesione na błony nitrocelulozowe (Whatman® Protran®, wielkość porów 0,45 µm). Nieswoiste miejsca wiązania blokowano 5% (w/obj.) mlekiem beztłuszczowym w PBS z 0,1% (obj.) Tween 20 (PBS-T) w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę, a następnie błony inkubowano w temperaturze 4 °C z poliklonalnym przeciwciałem anty-CLDN1 (JAY-8) przez noc. Membrany następnie przemywano i inkubowano z odpowiednim przeciwciałem wtórnym sprzężonym z peroksydazą chrzanową przez 1 h. rewelację przeprowadzono za pomocą systemu chemiluminescencyjnego (Amersham Biosciences); do normalizacji użyto ekspresji β-tubuliny.

Subkomórkową ekstrakcję białka

ekstrakcję białka przeprowadzono zgodnie z wcześniej opisanym opisem . Dla każdej próbki wycinano odcinki o grubości 20 µm za pomocą kriotomu, mieszano w ciekłym azocie i delikatnie mielono mikromacierzem. Do subkomórkowej ekstrakcji białka zastosowano zestaw do Subkomórkowej ekstrakcji Proteoextract zgodnie z instrukcjami producenta (Calbiochem). Frakcje subkomórkowe (10 µg/każda) załadowano na 12% żeli SDS-PAGE. Immunoblotting przeprowadzono w sposób opisany powyżej z następującymi pierwotnymi przeciwciałami: anty-CLDN1 (JAY-8), -CD71 (Invitrogen),- Histonem H3 (Pierce) i-β-tubuliną (Sigma T4026).

linie komórkowe

użyto następujących ludzkich linii komórkowych CRC: SW480 (ATCC CCL-228), SW620 (ATCC CCL-227), Caco-2 (ATCC HTB-37), Difi (prezent od C. Montagut, Department of Medical Oncology, Hospital del Mar, Barcelona, Hiszpania), HCT116 (CCL-247) i ls174t (ATCC CL-188). W celu uzyskania linii komórkowej CLDN1-dodatniej SW480 (SW480-CLDN1), komórki SW480 stabilnie transfekowano ludzkim klonem cDNA CLDN1 (Invitrogen MGC collection) lub pustym wektorem (pcDNA) przy użyciu odczynnika do transfekcji jetPRIME™ (Polyplus-transfection Inc., Francja). Klony cldn1-dodatnie wyselekcjonowano poprzez wzrost transfekowanych komórek w obecności 500 µg/ml genetycyny. W celu wyciszenia CLDN1, SW620 transdukowano z wektorem psirenowym zawierającym shRNA przeciwko CLDN1 (SW620shCLDN1) lub przeciwko lucyferazie (shLUC, Kontrola negatywna). Po 24 godzinach, komórki wyselekcjonowano 1 µg/mL puromycyny i połączono stabilne klony. Wszystkie przejściowe transfekcje przeprowadzono przy użyciu odczynnika do transfekcji jetPRIME™.

wytwarzanie anty-CLDN1 mAb 6 F6

w celu wytwarzania przeciwciał, 6-8-tygodniowe samice myszy BALB / c (Harlan, Gannat, Francja) były poddawane badaniom przez wstrzyknięcie dootrzewnowe (IP) 4 milionów komórek NIH myszy transfekowanych przejściowo cDNA CLDN1 (komórki NIH-CLDN1) co dwa tygodnie (łącznie pięć wstrzyknięć). Komórki NIH-CLDN1 zmieszano z kompletnym adiuwantem Freunda (Sigma) w pierwszym wstrzyknięciu i z niekompletnym adiuwantem Freunda (Sigma) w pozostałych czterech wstrzyknięciach. Dożylne wstrzyknięcie przypominające komórek NIH-CLDN1 podano trzy miesiące po piątej immunizacji. Trzy dni później komórki śledziony immunizowanych myszy połączono z mysią linią komórek szpiczaka P3-X63-Ag.8.653 do produkcji hybrydom myszy. Supernatanty z nowo wygenerowanych klonów przesiewano za pomocą sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) przy użyciu komórek SW480-CLDN1 i SW480 (Kontrola negatywna). Wyniki badań przesiewowych potwierdzono wykonaniem i dodatkowym badaniem przesiewowym z wykorzystaniem komórek SW620 i SW620-shCLDN1. Klon anty-cldn1 hybridoma 6 F6 wybrano i sklonowano przez ograniczenie rozcieńczenia. Izotypowanie przeciwciał wykazało, że 6 F6 było IgG3k.

wszystkie eksperymenty na zwierzętach przeprowadzono zgodnie z wytycznymi rządu francuskiego dotyczącymi eksperymentalnych badań na zwierzętach (umowa CEEA-LR-12052).

znakowanie radioizotopem i obrazowanie SPECT-CT

samice nagich myszy athymicznych (w wieku 6-8 tygodni) zostały zakupione w Harlan. 6 f6 mAb znakowano radioizotopem 125i (Perkin Elmer) o aktywności właściwej 370 MBq/mg do obrazowania z emisją pojedynczych fotonów w tomografii komputerowej (SPECT) przy użyciu IODO-GEN (Pierce Chemical Co.) metoda. Po wstrzyknięciu żyły ogonowej 16 MBq/50 µg 125i znakowanych 6 F6, obrazy z pojedynczej fotonowej tomografii emisyjnej całego ciała/tomografii komputerowej (SPECT / CT) uzyskano za pomocą 4-głowicowej multipleksującej wielootworowej Kamery NanoSPECT (Bioscan Inc., Waszyngton, USA) w różnych okresach (48, 72 i 96 h). Równocześnie uzyskano zdjęcia mikrotkograficzne całego ciała w celu współrejestracji anatomicznej z danymi SPECT. Zrekonstruowane dane SPECT i CT były wizualizowane i wspólnie rejestrowane przy użyciu Invivoscope®.

test Klonogenny

komórki raka jelita grubego wysiewano w 6-studzienkowej płytce (150, 250 lub 400 komórek/studzienkę) i pozostawiono do przylegania w temperaturze 37 °C przez noc. Następnie do każdej studzienki Dodano 1 ml RPMI z lub bez 6 f6 mAb (stężenie końcowe: 100 µg / ml) i komórki hodowano przez sześć dni. Po kolejnych sześciu dniach w pożywce bez przeciwciał odczytano płytki przy użyciu cytometru obrazującego Celigo™ i aplikacji “single colony verification”. Cytometr Celigo™ jest stacjonarnym systemem analizy komórkowej in situ, który zapewnia obrazy studni przy użyciu oświetlenia jasnego pola (Nexcelom Bioscience, MA, USA).

tworzenie trójwymiarowych (3D) kultur sferoidalnych

Ultra-niskie mocowanie, okrągłe DNA 96-studzienne płytki (Corning Costar) zostały wykorzystane do tworzenia sferoidów. Komórki SW480, SW480-CLDN1 lub SW620 wysiewano przy gęstości 5 × 104. Komórki zagregowane i połączone w sferoidy 3D w ciągu 24-72 godzin. Zdjęcia studzienek wykonano mikroskopem kontrastowym fazowym przy użyciu obiektywu 5× lub za pomocą cytometru obrazowego Celigo™ przy użyciu aplikacji “Tumorosphere”. Żywotność komórek oceniano za pomocą testu żywotności komórek luminescencyjnych CellTiter-Glo (Promega, Madison, WI, USA). Po dodaniu 100 µl odczynnika CellTiter Glo do każdej studzienki przez 10 minut zmierzono luminescencję na czytniku mikropłytek MicroBeta TriLux Luminescence 1450 (Perkin Elmer).

analiza cyklu komórkowego i proliferacji w sferoidach

sferoidy przygotowywano przez poszycie 1000 komórek DiFi na studzienkę w płytkach 96-studzienkowych o bardzo niskim przyłączeniu i hodowlę w obecności 100 µg/ml 6 f6 mAb lub nieistotnego MAB (retuksymabu) przez 5 dni. Do analizy cyklu komórkowego komórki granulowano, trypsynizowano, przemyto PBS, utrwalono w 75% etanolu i zabarwiono jodkiem propidium 40 µg/ml w obecności 100 µg ml−1 RNazy (Qiagen). Rozkład cyklu komórkowego oznaczono za pomocą Cytometru przepływowego Fc500 Beckman Coulter z wykorzystaniem kanału FL-3. Komórki były ogrodzone na wykresie punktowym, który wyświetlał pik DNA-pulse vs obszar dna-pulse, aby wykluczyć dublety. Rozkład cyklu komórkowego zilustrowano za pomocą oprogramowania do analizy Flow Jo (Treestar, FLOWJO, Ashland, or, USA).

w 4 dniu hodowli zmierzono proliferację komórek przez inkubację komórek z 5-etynylo-2′ – deoksyurydyną (EdU) przez 24 godziny. EdU jest włączany do DNA podczas aktywnej syntezy DNA. Następnie, po trypsynizacji komórek i fiksacji / permeabilizacji w 75% etanolu / PBS, wbudowany EdU oznaczono i wykryto za pomocą zestawu do oznaczania cytometrii przepływowej Alexa Fluor 488 Click-iT EdU (Invitrogen). Następnie komórki inkubowano z 1 µg/ml 4′,6-diamidino-2-fenylindolu (dapi) w PBS / 0,1% Triton X100 w 37 °C przez 30 minut. Aplikacja Celigo™ “Expression Analysis” (Target 1 + Mask) została wykorzystana do ilościowego określenia sygnału fluorescencyjnego oraz do analizy danych. Komórki identyfikowano za pomocą plamki jądrowej dapi, a syntezę DNA oceniano ilościowo przez pomiar inkorporacji EdU.

modele Ksenogeniczne myszy

1,5 × 106 komórek SW620 lub 3 × 106 komórek DiFi zawieszono w pożywce hodowlanej i wstrzyknięto podskórnie (s.c.) w prawą flankę 6-8-tygodniowych samic athymicznych nagich myszy z Harlan. Gdy objętość guza osiągnęła około 100 mm3, myszy randomizowano w różnych grupach i leczono wstrzyknięciem IP 0,9% NaCl lub 6f6 mAb (15 mg/Kg na wstrzyknięcie) dwa razy w tygodniu przez trzy kolejne tygodnie w pierwszym eksperymencie i trzy razy w tygodniu w drugim eksperymencie. Guzy mierzono dwutygodniowo suwmiarką, a objętości obliczano według wzoru: D1 x D2 x D3 / 2.

Intrasplenowy model kolonizacji wątroby

w każdym eksperymencie wstrzyknięto 2 miliony komórek SW620 z ekspresją lucyferazy (komórki SW620-LUC) do śledziony 6-8-tygodniowych samic athymicznych nagich myszy. Śledzionę usunięto 2 min po wstrzyknięciu komórek. W 1. dniu po wstrzyknięciu myszy losowo podzielono na dwie grupy po 10 myszy, którym podawano 15 mg/kg 6 f6 mAb lub 0,9% NaCl przez wstrzyknięcie IP, trzy razy w tygodniu. W celu oceny powstawania i rozprzestrzeniania się przerzutów, ekspresję lucyferazy monitorowano za pomocą obrazowania luminescencyjnego po wstrzyknięciu lucyferyny (Camera Ivis Lumina II, PerkinElmer®) raz w tygodniu. W 5. tygodniu po zabiegu uśmiercano myszy, usuwano wątroby, fotografowano i liczono widoczne makroskopowo przerzuty na powierzchni wątroby.

analiza statystyczna

Analiza statystyczna została wykonana przy użyciu oprogramowania STATA 13.0 (StataCorp). W przypadku ekspresji genów lub eksperymentów immunohistochemicznych różnice między grupami analizowano za pomocą testu Kruskalla Wallisa / Dunna. Korelacje między ekspresją genu CLDN1 a przeżywalnością bez progresji (PFS) i całkowitym przeżyciem (OS) oceniano w całej grupie (N = 143 pacjentów) i według molekularnego podtypu guza. W tym celu 143 pacjentów podzielono na dwie grupy na podstawie mediany ekspresji genu CLDN1 (tj. 9,75). Wartości PFS i OS porównywano metodą Kaplana-Meiera, a różnice między rozkładami przeżycia oceniano za pomocą testu log-rank.

sparowany test t został użyty do porównania efektu inkubacji z 6 F6 mAb w doświadczeniach in vitro.

w doświadczeniach in vivo zastosowano liniowy model regresji mieszanej w celu określenia zależności między wzrostem guza a liczbą dni po wstrzyknięciu. Stała część modelu obejmowała zmienne odpowiadające liczbie dni po przeszczepieniu i różnym grupom leczenia. Warunki interakcji zostały wbudowane w model; przypadkowe przechwyty i losowe nachylenia zostały uwzględnione w celu uwzględnienia efektu czasowego. Współczynniki modelu oszacowano na podstawie maksymalnego prawdopodobieństwa. Wskaźniki przeżywalności oszacowano od daty wstrzyknięcia do daty, kiedy guz osiągnął objętość 1500 mm3 metodą Kaplana-Meiera. Krzywe przeżycia porównano za pomocą testu log-rank. W przypadku eksperymentów kolonizacji wątroby różnice między grupami oceniano za pomocą testu U Manna-Whitneya. Dla wszystkich eksperymentów różnice uznano za znaczące, gdy P < 0,05.