Refining the phylogeny Chlorobi by resolving the phylogeny and metabolic potential of the representative of a deeply branching, uncultivated lineage

Genomic reconstruction of NICIL-2

analiza składu społeczności mikrobiologicznej termofilnych konsorcjów bakteryjnych przystosowanych do wzrostu na substratach biomasy (celuloza, ksylan i switchgrass) jako ich jedyne źródło węgla w temperaturze 60 °C konsekwentnie zidentyfikowało wszechobecny OTU97, który był daleko spokrewniony z hodowanymi członkami rodzaju Chlorobi (Eichorst et al., 2013, 2014). Metagenomiczne sekwencjonowanie konsorcjum przystosowanego do wzrostu na jonowo-cieczowej wstępnie przetworzonej switchgrass, w której obfite było Chlorobi-related OTU97, przeprowadzono w celu zrozumienia filogenezy i potencjału metabolicznego populacji reprezentowanej przez ten OTU97. Montaż (patrz materiały i metody) i automatyczne binning (Wu et al., 2014) z metagenomu tego konsorcjum uzyskano 20 pojemników genomowych (tabela uzupełniająca S3), wśród których najliczniejsze pojemniki stanowiły populację blisko spokrewnioną z szczepem Chitinophagaceae nyfb (61,8%), która została wyizolowana z pokrewnego wzbogacenia uprawianego na celulozie (Eichorst et al., 2013 r.), a kosz związany z Chlorobi (23,1%). Pojemniki obecne w >1% obejmowały wiele niekulturalnych populacji skupiających się z Paenibacillaceae (pojemniki 003 i 006), niekulturalną populację skupiającą się z Verrucomicrobia podpodział 3 (bin 004) i populację blisko związaną z thermobipora bispora (bin 005), termofilem aktynobakteryjnym.

Pojemnik związany z Chlorobi został nazwany NICIL – 2 (dla kompostu z Newby Island Ionic Liquid-2nd pod względem liczebności). Analiza białek przewidywanych z genomu NICIL-2 była zgodna z jego identyfikacją jako populacji odlegle spokrewnionej z członkami superphylum FCB, przy czym Bacteroidetes (33%) i Ignavibacteria (15,7%) miały najbliżej spokrewnione sekwencje białkowe (Fig.1). Odzyskany Genom projektowy NICIL-2 był stosunkowo mały (2,67 Mb / s) i prawie kompletny (95,3%; 102 ze 107 genów markerowych z pojedynczą kopią w 152 rusztowaniach). Długość N50 dla genomu projektu NICIL-2 wynosiła 168 929 bp, a największy contig 1.1 MB, co sugeruje, że większość rusztowań stanowiła wysokiej jakości montaż (Tabela 1).

rozkład najlepiej dopasowanej linii dla wszystkich białek NICIL-2. Wartości procentowe są szacowane przez podzielenie liczby białek dopasowanych do każdej linii względem liczby wszystkich białek NICIL-2. Szczegóły w materiałach i metodach.

analiza filogenetyczna NICIL-2

Gen 16S rRNA (1451 bp) został odzyskany z projektu genomu NICIL-2. Rybotyp najbardziej związany z genem 16S rRNA NICIL-2 (> 99% identyczny) zsekwencjonowano z klonu fosmidu (JFF029_06) odzyskanego ze strumienia termicznego (70 °C) w sekwencji japońskiej kopalni złota (Nunoura et al., 2005). Geny 16S rRNA od hodowanych przedstawicieli Bacteroidetes i Chlorobi były <85% identyczne z sekwencją NICIL-2. Drzewo filogenetyczne skonstruowane przez wyrównanie sekwencji genu 16S rRNA związanych z NICIL – 2 wykazało, że linia zawierająca NICIL-2 różni się od Bacteroidetes i Chlorobi (fig.2). Linia NICIL-2 zawierała dwie linie opadania oparte na temperaturze środowiska próbkowania. Klaster wysokotemperaturowy (przedstawiony na rysunku 2 na Czerwono) obejmował rybotypy odzyskiwane głównie ze środowisk o wysokiej temperaturze w zakresie od 55 °C do 80 °C, takich jak klon OPB56 (Hugenholtz et al., 1998). Drugi klaster obejmował rybotypy pozyskiwane głównie ze środowisk o umiarkowanej temperaturze od 20 °C do 32 °C (pokazane na Zielono na fig.2). Ponieważ OPB56 był pierwszym odkrytym klonem, który jest powiązany z tym kladem filogenetycznym, linia zawierająca NICIL-2 jest określana jako klad OPB56. Rozszerzony widok drzewa genu 16S rRNA przedstawiono na rysunku uzupełniającym S1.

drzewo filogenetyczne o maksymalnym prawdopodobieństwie zbudowane dla nowej linii NICIL-2 przy użyciu genu rybosomalnego RNA 16S. Klad najbliżej gatunku NICIL-2 pochodził z fosmidu wyizolowanego z japońskiej kopalni złota (Nunoura et al., 2005). Zakresy temperatur gatunku określono na podstawie literatury związanej z każdym numerem przystąpienia NCBI. Temperatura dla gatunku oznaczona była kolorem czerwonym (>55 °C), zielonym (20-32 °C) lub czarnym (nieokreślona). Pasek skali oznacza 0,05 zmiany na miejsce nukleotydu. SzczegóŠ‘y budowy drzew sÄ … podane w materiaĹ’ ach i metodach. Rozszerzone drzewo filogenetyczne pokazujące wszystkie węzły można znaleźć na rysunku uzupełniającym S1. Pełna wersja kolorystyczna tego rysunku jest dostępna na stronie internetowej ISME Journal.

aby dokładniej ustalić filogenetyczną przynależność NICIL-2 i kladu OPB56, dodatkowe sekwencje białek rybosomalnych uzyskano z danych Odzyskanych z próbek naturalnych. Homology 22 zachowanych genów rybosomalnych w NICIL-2 znaleziono w dwóch japońskich klonach fosmidów ze źródłami termicznymi (JFF029_C06 i JFF027_B02). Ten zestaw 22 białek rybosomalnych został użyty do wyszukiwania zestawów danych metagenomicznych ze środowisk o wysokiej temperaturze. Kompletne zestawy tych konserwowanych genów rybosomalnych zidentyfikowano w czterech zestawach danych metagenomicznych uzyskanych ze środowisk o wysokiej temperaturze. Automatyczne binowanie tych zestawów danych odzyskało sześć prawie kompletnych (> 90% kompletnych) genomów projektowych, które zawierały sekwencje dla konserwowanych 22 białek rybosomalnych w genomie NICIL-2 i Klonach fosmidu japońskiej kopalni złota (tabela uzupełniająca S4). Pięć z sześciu połączonych sekwencji białek skupionych w linii OPB56 z NICIL-2, podczas gdy jedna z sekwencji z Yellowstone Fairy Falls skupiona jest z Ignavibacteria (Fig.3a). To drzewo filogenetyczne wykazało, że Chlorobea, Ignavibacteria i OPB56 tworzą klad monofiletyczny z dużym zaufaniem (97%). Bacteroidetes utworzyły odrębną gromadę, a rodzina Rhodothermaceae, której przynależność do Bacteroidetes została zakwestionowana (Nolan et al., 2009), były powiązane z Bacteroidetes z dużym zaufaniem (>80%). Drugie drzewo filogenetyczne zostało skonstruowane przez połączenie 86 pojedynczych kopii genów dzielonych między Bacteroidetes, Chlorobi i Fibrobacter (rysunek 3b). Drzewo to odtworzyło topologię obserwowaną dla genu zbudowanego z 22 genów rybosomalnych, dodatkowo potwierdzając przynależność Chlorobea, Ignavibacteria i OPB56.

drzewo filogenetyczne o maksymalnym prawdopodobieństwie zbudowane dla nowej linii NICIL-2 z wykorzystaniem (a) 22 białek rybosomalnych i (b) 86 białek jednokrotnikowych dzielonych między Bacteroidetes, Chlorobea, Ignavibacteria, opb56 i klastry Fibrobactera. Pasek skali oznacza 0,1 zmiany na miejsce aminokwasowe. SzczegóŠ‘y budowy drzew sÄ … podane w materiaĹ’ ach i metodach.

komplementarnym podejściem do zrozumienia ewolucyjnych związków między Bakteriodetami i Chlorobi było zidentyfikowanie indeli w konserwowanych białkach (Gupta i Lorenzini, 2007). Insercje w POLIMERAZIE DNA III (28 aa) i syntetazie alanylo-tRNA (12-14 aa), które są zachowane wśród GSB i nieobecne wśród Bakteriodetów, przypisano jako charakterystyczne dla rodzaju Chlorobi. Dopasowanie tych dwóch białek (dodatkowe figury S2 i S3) wskazuje, że insercja polimerazy DNA III w sekwencjach białka GSB nie jest obecna w przewidywanych białkach z genomów Ignavibacteriae i NICIL-2, podczas gdy 2-3 aminokwasy insercji w sekwencjach syntetazy alanylowo-tRNA GSB są zachowane w sekwencjach białka Ignavibacteria i NICIL-2.

rekonstrukcja metaboliczna NICIL-2

fizjologia NICIL-2 została wywnioskowana przez rekonstrukcję metaboliczną i jej potencjał metaboliczny w porównaniu z przedstawicielami GSB (Chlorobaculum tepidum), Bacteroidetes (Rhodothermus marinus i Salinbacter ruber) i Ignavibacteria (Ignavibacterium album i Meliobacter roseus). Geny kodujące białka związane z fotosyntezą, w tym homologi C. fotosyntetyczne podjednostki centrum reakcji tepidum (ct1020, pscB, psC, pscD), białka otoczki chlorosomów (csmABCDEFHIJX) i białka bakteriochlorofilu a (fmoA) są nieobecne we wszystkich innych genomach, wyróżniając GSB w tym zestawie porównawczym (Eisen et al., 2002). Wizualne podsumowanie rekonstrukcji metabolicznej przedstawiono na rycinie 4. Pełne informacje o genach, numery pól i skróty znajdują się w tabelach uzupełniających S5 i S6.

zrekonstruowany metabolizm NICIL-2 wywnioskowany z ponownie złożonego genomu. Pełne informacje o genach, numery pól i skróty znajdują się w tabelach uzupełniających S5 i S6. Czerwony tekst przedstawia enzymy lub szlaki biosyntetyczne, których brakuje w genomie. Niebieskie, zielone i fioletowe strzałki wskazują odpowiednio przepływ ATP, NADH i NADPH.

metabolizm węgla

Genom NICIL-2 koduje kompletny zestaw genów dla glikolizy, cyklu TCA i glukoneogenezy(ryc. 4). Geny dla cyklu rTCA, które są obecne i wyrażone dla autotroficznego wiązania węgla w GSB, są nieobecne. Ponadto obecność genów kodujących kofaktory zawierające kwas liponowy w kompleksach dehydrogenazy pirogronianowej i dehydrogenazy α-ketoglutaranowej sugeruje, że cykl TCA funkcjonuje w kierunku oksydacyjnym. Większość cyklu rTCA została zrekonstruowana u R. marinusa i I. album, w tym wiele oksydoreduktaz pirogronianowo-ferredoksynowych i α-ketoglutaranowo-ferredoksynowych, dwa niezbędne enzymy do cyklu rTCA. W genomach I. album i R. marinus brakuje zależnej od ATP liazy cytrynianowej, enzymu krytycznego do zakończenia cyklu rTCA (Buchanan and Arnon, 1990). Zaproponowano, że I. album może używać niezależnej od ATP liazy cytrynianowej do działania w cyklu rTCA, chociaż twierdzenie to nie jest testowane eksperymentalnie i ani I. album, ani R. marinus, nie wykazano, aby rosły autotropowo (Liu et al., 2012a).

pomimo wysokiej względnej obfitości w przystosowanych kulturach rosnących na biomasie roślinnej, NICIL-2 miał zaskakująco ograniczoną zdolność enzymatyczną do dekonstrukcji złożonej biomasy. Porównanie potencjału metabolicznego hydrolizy polisacharydów wśród 20 pojemników wyekstrahowanych z metagenomu ze wstępnie przetworzonego wzbogacenia trawy przełączkowej wykazało, że NICIL-2 ma stosunkowo mniej genów dla dekonstrukcji celulozy i hemicelulozy w porównaniu z innymi członkami wspólnoty drobnoustrojów (rysunek uzupełniający S4). W szczególności szczep nyfb, populacja verrucomicrobial i wiele Gram-dodatnich Firmicutes mają szerszy repertuar genów dla hydrolizy polisacharydów. Dodatkowa kontrola zrekonstruowanych genomów powiązanych z OPB56 z naturalnych próbek wysokotemperaturowych wykazała, że brak genów dla hydrolizy polisacharydów był wspólny dla tego kladu. Wśród genomów grupujących się z Bacteroidetes i Chlorobi, R. marinus, M. roseus i Yellowstone Obsydian Pool Bin 062, które łączą się z Ignavibacteria, posiadały szeroki repertuar hydrolaz glikozydowych do dekonstrukcji biomasy roślinnej. Analizy te sugerują, że NICIL-2 i pokrewni członkowie kladu OPB56 prawdopodobnie nie są zaangażowani w pierwotną dekonstrukcję biomasy w przystosowanej społeczności i środowiskach naturalnych. Możliwe jest, że NICIL-2 może rosnąć na monomerach cukrowych lub oligomerach; jednak tylko jeden przewidywany Gen transportera disacharydów został zidentyfikowany w genomie.

chociaż selekcja NICIL-2 nastąpiła w warunkach tlenowych, może posiadać zdolność do fermentacji. Geny fermentacyjnej produkcji etanolu są obecne (przez dehydrogenazę alkoholową, EC 1.1.1.1), podczas gdy geny mrówczanu (przez liazę mrówczanową pirogronianową, EC 2.3.1.54), mleczanu (przez dehydrogenazę mleczanową, EC 1.1.1.27) i propionianu (przez transferazę karboksylową metylmalonylo-CoA, 2.1.3.1) są nieobecne. Genom NICIL-2 koduje Gen fosfotransacetylazy (EC 2.3.1.8), ale nie kinazy octanowej (EC 2.7.2.1), z których oba są wymagane do produkcji octanu fermentacyjnego. Zarówno I. album, jak i M. roseus zawierają geny do produkcji mleczanów i octanów, podczas gdy C. tepidum nie.

metabolizm azotu i siarki

geny asymilacji amonu, syntazy glutaminy (EC 6.3.1.2) i syntazy glutaminianu (EC 1.4.1.13) wykryto w genomie NICIL-2. Jednak nie zidentyfikowano genów dla dysymilacyjnej redukcji azotanów, asymilacyjnej redukcji azotanów, denitryfikacji, wiązania azotu i nitryfikacji. C. tepidum koduje geny nif wymagane do fiksacji N2, podczas gdy M. roseus (Kadnikov et al., 2013), I. album (Liu et al., 2012a) i R. marinus (Nolan et al., 2009) nie. C. tepidum jest zobowiązanym utleniaczem siarki i dlatego może utleniać siarczek, tiosiarczan, siarczyn i siarkę elementarną. C. tepidum preferencyjnie utlenia siarczek do siarki elementarnej, a następnie siarkę elementarną i tiosiarczan do siarczanu (Chan i wsp ., 2008). Dodatkowo siarczan może być utleniony, gdy jest dostarczany w pożywce wzrostu, ale nie może utrzymać C. tepidum jako jedynego donora elektronów (Rodriguez et al., 2011). NICIL-2, I. album, M. roseus i R. marinus nie posiada wszystkich genów potrzebnych do utleniania zredukowanych związków siarki.

Biosynteza aminokwasów

w genomie NICIL-2 brakuje wielu kluczowych genów do biosyntezy aminokwasów. Kompletne szlaki kodowane są dla alaniny, argininy, asparaginy, asparaginianu, β-alaniny, glutaminianu, glicyny, lizyny i metioniny. NICIL-2 nie ma ilvC i leuABCD, a zatem posiada niekompletne szlaki biosyntezy waliny, leucyny i izoleucyny. Podobnie I. album genomu brakowało wszystkich genów wymaganych do biosyntezy waliny, leucyny i izoleucyny z pirogronianu, z wyjątkiem aminotransferazy o rozgałęzionych łańcuchach (ilvE), podczas gdy M. roseus i C. tepidum zawierają kompletne szlaki. Ani NICIL-2, ani I. album nie kodują genów niezbędnych do biosyntezy proliny z glutaminianu (proBAC), podczas gdy zarówno C. tepidum, jak i M. roseus. Gen seryny do biosyntezy brakuje w NICIL-2, I. album, M. roseus, i znajduje się w niektórych GSB, w tym C. tepidum. NICIL-2 może również wykorzystywać aminokwasy jako substraty wzrostu. Complete degradation pathways are present for branched-chain amino acids (leucine, isoleucine and valine), similar to pathways observed in ‘Candidatus Thermochlorobacter aerophilum’ (Liu et al., 2012b).

Electron transport

The major electron transport chain components were identified in the NICIL-2 genomes including: NADH:ubiquinone oxidoreductase (Complex I, EC 1.6.5.3), membrane-bound succinate dehydrogenase (Complex II, EC 1.3.5.1), quinol-oxidizing alternative Complex III (ACIII) (Yanyushin et al., 2005; Pereira et al., 2007), several cytochrome c oxidases (Complex IV, EC 1.9.3.1) and an F-type H+-transporting ATPase (Complex V, EC 3.6.3.14). NICIL-2 contains one complete set of genes for NADH:ubiquinone oxidoreductase (14 subunits, nuoABCDEFGHIJKLMN), although they are not assembled in one operon (Supplementary Figure S6). Zamiast tego większość genów jest ułożona niezależnie na największym rusztowaniu NICIL-2 (nuoGHI, nuoJK, nuoF, nuoD, nuoE i nuoMN), a pozostałe geny znajdują się na trzech mniejszych rusztowaniach (nuoAB, nuoL i nuoC), co wskazuje, że brak struktury operon nie jest artefaktem montażu. C. tepidum zawiera jeden zestaw genów kodujących NADH: oksydoreduktazę ubichinonową pozbawioną nuoEFG (11 podjednostek). I. album i M. roseus zawierają po dwa zestawy nuoABCDHIJKLMN i po jednym zestawie nuoEFG każdy (rysunek uzupełniający S6). Co ciekawe, Kompleks i z NICIL-2 jest najbliżej spokrewniony z Rhodothermus marinus i Salinibacter ruber z Bacteroidetes, z których oba zawierają jeden kompletny zestaw genów dla NADH: oksydoreduktazy ubichinonu(Fig.5a). Homologi dla 11 podjednostek kompleksu I zidentyfikowano również we wszystkich sześciu pojemnikach związanych z NICIL – 2 Odzyskanych z Yellowstone i Great Boiling Spring, oraz połączonego zespołu tych sekwencji białkowych skupionego z sekwencjami z NICIL-2.

sąsiaduje z niezkorzenionymi połączonymi drzewami białkowymi kompleksu i (A) i alternatywnego kompleksu III (b). Liczby w nawiasach oznaczają liczbę podjednostek użytych do budowy drzewa. Pasek skali oznacza zmiany x na miejsce aminokwasu.

ACIII jest nową klasą oksydoreduktaz bakteryjnych błon znalezionych w organizmach, które często nie mają kompleksu bc1 (Yanyushin et al., 2005). ACIII z R. marinus (Pereira et al., 2007; Refojo et al., 2013) i włóknistą bezoksygeniczną fototroficzną bakterią Chloroflexus aurantiacus (Gao et al., 2009, 2013). Ostatnio, duża liczba klastrów genów kodujących podjednostki ACIII, z różnicami w budowie i organizacji, znaleziono w zakresie genomów bakteryjnych (Refojo et al., 2013). Na przykład, R. marinus zawiera geny actABCDEF w operon, który koduje sześć podjednostek ACIII; homologów tego klastra genów zostały zidentyfikowane w wielu członków Bacteroidetes (Thiel et al., 2014). Drzewo filogenetyczne przedstawia pokrewieństwo ACIII od NICIL-2 do jego najbliższych krewnych (rysunek 5b). GSB nie posiadają ACIII i dlatego nie są reprezentowane w tym drzewie. Jednak ” Candidatus Thermochlorobacter aerophilum, który nie jest członkiem GSB, koduje ACIII, który prawdopodobnie działa w oddychaniu tlenowym (Liu et al., 2012b). Ważne jest, aby zauważyć, że zarówno I. album, jak i M. roseus są unikalne wśród tego zestawu ACIII, ponieważ zawierają pięć podjednostek, z podjednostkami actDE zidentyfikowanymi jako białko fuzyjne. Pełny zestaw genów kodujących wszystkie podjednostki ACIII, które zostały odzyskane z dwóch pojemników genomowych związanych z NICIL-2 z metagenomów Yellowstone, stwierdzono, że zawierają fuzję actDE i zgrupowane z I. album i M. roseus. NICIL-2 nie zawiera tej fuzji, a geny jego kompleksu ACIII są bliżej spokrewnione z R. marinusem i S. ruberem.

końcowe akceptory elektronów NICIL-2 obejmują oksydazę cytochromu C Typu aa3 (Kompleks IV) i możliwe alternatywne oksydazy cytochromu c, oznaczone jako CoxMOP. Jest mało prawdopodobne, aby NICIL-2 był mikroaerofilny, ponieważ oksydazy typu cbb3 nie zostały wykryte w genomie. Ponadto nie wykryto cytochromu bd. Dla porównania, zarówno genomy I. album, jak i M. roseus zawierają geny dla oksydazy cytochromu c Typu cbb3 i kompleksu cytochromu bd.

Genom NICIL-2 zawiera niekompletny zestaw genów męskich do syntezy menachinonu. Kompletny Szlak biosyntetyczny menachinonu zawiera menFDHCEBAG (Bentley and Meganathan, 1982), a Genom NICIL-2 zawiera tylko menBAG. Dla porównania, C. tepidum i ja. album zawiera kompletne ścieżki men, podczas gdy genomy M. roseus i R. marinus mają adnotacje dla wszystkich wymaganych genów, z wyjątkiem menB i menH, odpowiednio. Homology genów kodujących enzymy alternatywnego szlaku biosyntetycznego menachinonu, szlaku futalozyny (Arakawa et al., 2011), były niewykryte w NICIL-2. Brak jest również genów biosyntetycznych ubichinonu. Genom NICIL-2 może mieć niepełne pokrycie w tym obszarze i dodatkowe geny męskie mogą być znalezione z całkowicie zmontowanym genomem. Alternatywnie, NICIL – 2 może angażować się w wymianę chinonów z innymi członkami społeczności, jak zaobserwowano dla konsorcjum fototropowego “Chlorochromatium aggregatum” (Liu et al., 2013).

geny wici i chemotaksji

kodujące białka dla ciała podstawnego, haka i zespołu włókien są obecne w genomie NICIL-2. Jednak NICIL-2 brakuje genów kodujących chemotaksję, oprócz jednego białka regulatorowego, CheY. GSB są uważane za nielotne i pozbawione chemotaxis i flagella, podczas gdy I. album, M. roseus i R. marinus mają flagellar i chemotaxis machinery.