stabilizacja heterochromatyny przez zegar promuje odmłodzenie komórek macierzystych i regenerację chrząstki

przeciwciała

dla Western blotting: anty-CLOCK (#5157, 1:1000), anty-HP1a (#2616s, 1:1000) i anty-HP1y (#2619, 1:3000) z technologii sygnalizacji komórkowej; anty-Kap1 (Ab22553, 1:2000), anty-LBR (ab16048, 1:1000) i anty-LBR (Ab32535, 1:1000) z abcam; anty-β-aktyna (SC-69879, 1:3000) z Santa Cruz biotechnology.

For immunostaining: anti-Ki67 (ZM0166, 1:500) from ZSGB-BIO; anti-γH2AX (05-636, 1:400) from Millipore; anti-53BP1 (A300-273A, 1:500) from Bethyl Laboratories; anti-FOXA2 (8186S, 1:100) from Cell Signaling Technology; anti-SMA (A5228, 1:100), and anti-TuJ1 (T2200, 1:100) from Sigma-Aldrich; anti-H3K9me3 (Ab8898, 1:500) and anti-NANOG (Ab21624, 1:200) from Abcam; anti-Lamin A/C (sc-376248, 1:500), anti-OCT3/4 (sc-5279, 1:200) and anti-SOX2 (sc-17320, 1:100) from Santa Cruz Biotechnology; anti-Aggrecan (AF1220, 1:100), anti-Osteocalcin (MAB1419, 1:100), and anti-FABP4 (AF3150, 1:100) z systemów R&D.

dla cytometrii przepływowej: anty-CD73 (550257, 1:200), anty-CD90 (555595, 1:200), anty-CD44 (550989, 1:200), anty-HLA-ABC (560168, 1:100), anty-CD34 (555822, 1:200), anty-CD43 (560198, 1:200), anty-CD45 (555482, 1:200), anty-CD14 (555398, 1:200) i anty-CD19 (555415, 1:200) z BD Biosciences; anty-CD105 (17-1057-41, 1:200) i anty-pDPN (17-9381-42, 1:200) od ebioscience (San Diego, CA, USA); anty-cd29 (303004, 1:200) i anty-cd13 (301705, 1:200), anty-cd166 (343903, 1:200) i anty-cd164 (324805, 1:200) od biolegend (San Diego, CA, USA).

hodowle komórkowe

CLOCK+/+ hESCs (hESCs, line H9, WiCell Research Institute) i CLOCK−/− hESCs były utrzymywane na warstwach podajnika, które składały się z mitomycyny C-inaktywowanych mysich fibroblastów zarodkowych (MEFs) w pożywce hodowlanej hESC. Pożywka do hodowli hESC zawierała DMEM / F12( Thermo Fisher Scientific), 20% zamiennik surowicy KnockOut (Thermo Fisher Scientific), 0.1 mM aminokwasów nieistotnych (NEAAs, Thermo Fisher Scientific), 2 mM GlutaMAX (Thermo Fisher Scientific), 55 µM β-merkaptoetanolu (Thermo Fisher Scientific), 1% penicyliny/streptomycyny (Thermo Fisher Scientific) i 10 ng/mL bFGF (Joint Protein Central, Incheon, Korea). Alternatywnie, hesc hodowano na płytkach Matrigel (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) w podłożu mTeSR (STEMCELL Technologies, Vancouver, Kanada).

zarówno hmsc pochodzące z hESC, jak i pierwotne hmsc były utrzymywane w pożywce MSC zawierającej MEMa (Thermo Fisher Scientific) uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) (Nr kat. 10099-141, nr Lot 1616964, Thermo Fisher Scientific), 0,1 mM NEAAs (Thermo Fisher Scientific), 1% penicyliną/streptomycyną (Thermo Fisher Scientific) i 1 ng/mL bFGF (Joint Protein Central, Incheon, Korea).

edycja genów za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w hESCs

edycja genów za pośrednictwem CRISPR / Cas9 została przeprowadzona za pomocą wcześniej opisanych metod z pewnymi modyfikacjami.33,34,65 w skrócie, przewodnik RNA ukierunkowany na ekson 5 zegara (CLOCK-gRNA) został sklonowany do wektora klonującego gRNA (#41824, Addgene) (informacja uzupełniająca, tabela S1). Po leczeniu inhibitorem skały y-27632 (S1049, Selleck) przez 24 godziny, hESCs (5 × 106) zawieszono w 100 µL produktu Opti-mem (Thermo Fisher Scientific) zawierającego koktajl plazmidowy, który składał się z plazmidu dawcy zawierającego ramiona homologiczne, CLOCK-gRNA i hCas9 (#41815, Addgene) i poddano elektroporacji w układzie 4D-Nukleofektorowym (Lonza). Komórki były następnie wysiewane na komórkach podajnika MEF. G418 (100 µg/mL, 11811023, Thermo Fisher Scientific) dodano w celu rozpoczęcia pozytywnej selekcji 2-4 dni po elektroporacji. Po 2 tygodniach selekcji klony Odporne Na G418 zostały wybrane i przeniesione na 96-studzienkową płytkę w celu dalszej charakterystyki i rozbudowy. Genomic PCR i western blotting wykorzystywali dla genomic editing identyfikacja. Dodatkowo usunęliśmy kasetę oporności na neomycynę w zegar – / – hESCs poprzez elektroporację wektorem pCAG-FLpo-2A-puro. Trzy dni po transfekcji, 1 µg/mL puromycyny (Thermo Fisher Scientific) użyto do wzbogacenia komórek opornych na puromycynę przez 48 godzin. po 8-12 dniach selekcji, nowe kolonie zostały wybrane i rozszerzone do dalszych badań.

generacja i charakterystyka hMSC

hmsc zostały odróżnione od hESCs zgodnie z wcześniej opublikowanym protokołem.25,86,87 krótko mówiąc, hESCs dysocjowano do ciał embrionalnych (EBs) i traktowano pożywką różnicującą (MEMa (Invitrogen) uzupełnioną 10% FBS (Nr kat. 10099-141,nr Lot 1616964, Thermo Fisher Scientific), 0.1 mm NEAAs (ThermoFisher Scientific), 10 ng/mL bFGF, 5 ng/mL TGFß i 1% penicyliny / streptomycyny (Gibco)) na płytkach pokrytych Matrigelem przez 10 dni, aż do zbiegu 95%. Następnie zestawione komórki podobne do MSC trawiono i platerowano płytkami powlekanymi matrycą, traktowanymi pożywką hodowlaną MSC zawierającą MEMa (Invitrogen) uzupełnioną 10% FBS, 0,1 mM NEAAs, 1 ng/mL bFGF i 1% penicyliną/streptomycyną (Gibco). Następnie zbiegające się komórki MSC zostały przeniesione do płytek pokrytych żelatyną. HMSC oczyszczano różnymi przeciwciałami odpowiadającymi markerom specyficznym dla hmsc (CD73, CD90 i CD105) za pomocą FACS. Komórki triple-dodatnie CD73, CD90 i CD105 dodatkowo charakteryzowały się markerami antygenu powierzchniowego, w tym markerami dodatnimi, takimi jak CD44, CD166, CD29, HLA-ABC i CD13, oraz markerami ujemnymi, takimi jak CD34, CD43, CD45, CD164, CD14, CD19 i PDPN. Funkcjonalność hmsc została dodatkowo zweryfikowana poprzez różnicowanie w kierunku chondrocytów, adipocytów i osteoblastów. Osteoblasty, chondrocyty i adipocyty pochodzące z hmsc charakteryzowały się barwieniem von Kossa (GMS 80045.3, GenMed Scientific Inc., USA) i barwienie osteokalcyną (wskazujące na osteogenezę), barwienie toluidyną (T3260, Sigma) i aggrecan (wskazujące na chondrogenezę) oraz barwienie czerwienią olejową O (O1391, Sigma) (wskazujące na adipogenezę) zgodnie z instrukcjami producenta.

izolacja i kultura pierwotnych hMSCs

pierwotne hMSCs izolowano z dziąseł różnych osób.23,33,34,65 tkanki oddzielone od dziąseł pocięto na małe (1 mm2) kawałki za pomocą nożyczek w enzymie TrypLE™ Express (1×) plus Dispase IV i dalej inkubowano w temperaturze 37 °C przez 30 minut. Trawione zawiesiny tkankowe zneutralizowano za pomocą pożywki hodowlanej MSC i odwirowano w temperaturze 200 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Otrzymane granulki ponownie zawieszono w pożywce hodowlanej MSC zawierającej MEMa (Invitrogen) uzupełnionej 10% FBS (Gibco), 1 ng/mL bFGF i 1% penicyliny/streptomycyny (Gibco) i pokryto płytkami powlekanymi żelatyną w celu wzrostu pierwotnych hmsc.

test reporterowy Lucyferazy

plazmid PER2-dLuc był miłym prezentem od E. E. Zhanga.88 komórek zawierających PER2-dLuc hodowano do zbiegu w 24-studzienkowych płytkach hodowlanych i synchronizowano z forskoliną 20 µM (S2449, Selleck) przez 2 godziny. pożywkę zastąpiono pożywką msc zawierającą 0,25 mM lucyferyny (LUCK-1g, GoldBio). Komórki monitorowano w luminometrze LumiCycle w temperaturze 37 °C przez 5-7 dni; wygenerowane dane analizowano za pomocą oprogramowania do analizy LumiCycle (Actimetrics). Dane z pierwszego 24-godzinnego cyklu zostały wyłączone z naszej analizy statystycznej.

in vitro synchronizację hMSC i analizę dobową

hmsc platerowano na płytkach pokrytych żelatyną z pożywką MSC do 95% zbiegu. W celu synchronizacji komórki potraktowano następnie forskoliną 20 µM przez 2 godziny i ponownie przechowywano w pożywce MSC po dwukrotnym przemyciu PBS. Komórki pobierano od 24 h po zsynchronizowaniu w odstępach 3-godzinnych przez 9 punktów czasowych, a następnie ekstrakcję RNA i detekcję RT-qPCR. Test nieparametryczny jtk_cycle został użyty do weryfikacji oscylacji okołodobowych, jak opisano wcześniej.89 wątków przebiegu hmsc z wartościami p i q < 0,05 uznano za rytmiczne.

Western blotting

komórki lizowano w buforze SDS zawierającym 4% SDS i 100 mm Tris-HCl. Stężenie białka oznaczono ilościowo za pomocą zestawu do oznaczania ilościowego BCA (Thermo Fisher Scientific), a ~20 µg białka na próbkę poddano SDS-PAGE i elektrotransferowano do membran PVDF (Millipore). Następnie błonę blokowano 5% mlekiem i inkubowano z przeciwciałami pierwotnymi, a następnie z przeciwciałami wtórnymi sprzężonymi z peroksydazą chrzanową (HRP). Zespoły immunoreaktywne wizualizowano w systemie ChemiDoc XRS+ (Bio-Rad). Analizy statystyczne były kwantyfikowane przez oprogramowanie Image J (NIH). Każda grupa miała trzy niezależne eksperymenty. Znaczenie statystyczne oceniano za pomocą testu t-Studenta z dwoma ogonami.

transmisyjna mikroskopia elektronowa

późne Przejście (P9) CLOCK+/+ i CLOCK-/− hMSCs zebrano enzymatycznie za pomocą Trypla (Thermo Fisher Scientific) i odwirowano w temperaturze 500 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Otrzymane granulki utrwalano 4% paraformaldehydem (PFA) w PBS (pH 7,4) na lodzie przez noc. Komórki następnie odwodniono w stopniowanej serii etanoli, permeabilizowano i osadzono w żywicy Lowikrylowej HM20. Sekcje (200 nm) otrzymano i zobrazowano za pomocą mikroskopu elektronowego Spirit transmission (Fei Company) pracującego przy napięciu 100 kV.

barwienie Immunofluorescencyjne

komórki zaszczepione na pokrywach (Thermo Fisher Scientific) przemywano dwukrotnie PBS. Następnie komórki utrwalano 4% PFA przez 30 minut, przenikano 0,4% Triton X-100 w PBS przez 30 minut i blokowano 10% osła w PBS (Jackson Immuno Research) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Po zablokowaniu komórki inkubowano z pierwotnymi przeciwciałami w temperaturze 4 °C przez noc. Następnie komórki przemyto trzy razy PBS, inkubowano z drugorzędowymi przeciwciałami w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę i przemyto trzy razy PBS. Jądra zostały zabarwione Hoechst 33342 (H3570, Thermo Fisher Scientific). Obrazowanie wykonano za pomocą systemu konfokalnego Leica SP5. Statystyczna analiza liczby, intensywności i powierzchni sygnałów fluorescencyjnych została określona ilościowo za pomocą oprogramowania Image J (NIH). Komórki Pobrano z trzech replikatów biologicznych. Znaczenie statystyczne oceniano za pomocą testu t-Studenta z dwoma ogonami. Rekonstrukcja 3D barwienia H3K9me3, jak pokazano na Fig. 2f był wykonywany przez szeregowe dzielenie stosu z w odstępach 50 nm w trybie konwencjonalnym dla maksymalnie 50 obrazów z systemem konfokalnym Leica SP5 i dalej przetwarzany do rekonstrukcji 3D przez oprogramowanie Imaris (Wersja 7.4.2), jak wcześniej opisano.

test barwienia SA-β-gal

barwienie SA-β-gal przeprowadzono zgodnie z opisem we wcześniejszych badaniach.33,34 krótko mówiąc, komórki utrwalano buforem utrwalającym (2% formaldehydu i 0.2% aldehydu glutarowego) przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Następnie stałe komórki barwiono świeżym roztworem barwiącym w temperaturze 37 °C przez noc. Pola widzenia były losowo wybierane w każdej studni, a procent komórek SA-β-gal-dodatnich oznaczano za pomocą oprogramowania ImageJ. Każda grupa miała trzy biologiczne replikaty. Znaczenie statystyczne oceniano za pomocą testu t-Studenta z dwoma ogonami.

test ekspansji klonalnej

przeprowadzono test ekspansji klonalnej zgodnie z wcześniejszymi doniesieniami.34,65 krótko mówiąc, 6000 komórek na studzienkę zaszczepiono w 6-studzienkowe płytki i hodowano przez 9-12 dni. Komórki przemyto dwukrotnie PBS, utrwalono 4% PFA i zabarwiono 0,2% fioletem krystalicznym przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Pola widzenia były skanowane przez skaner, a następnie mierzone przez oprogramowanie ImageJ (NIH). Każda grupa miała trzy biologiczne replikaty. Znaczenie statystyczne oceniano za pomocą testu t-Studenta z dwoma ogonami.

co-IP

komórki HEK293T transfekowane plazmidami wyrażającymi Flag-Luc lub Flag-CLOCK i hmscs lizowano w buforze lizy CHAPS (120 mM NaCl, 0.3% CHAPS, 1 mM EDTA, 40 mM HEPES (pH 7,5) i kompletny koktajl inhibitora proteazy (Roche)) w temperaturze 4 °C przez 4 godziny, a następnie wirowano w temperaturze 14 500 × g w temperaturze 4 °C przez 40 minut. W przypadku Co-IP z białkami egzogennymi supernatanty mieszano z koralikami sprzężonymi z przeciwciałami anty-Flag (A2220, Sigma) i obracano przez noc w temperaturze 4 °C. W przypadku Co-IP z białkami endogennymi supernatanty mieszano ze wskazanymi przeciwciałami przez noc w temperaturze 4 °c z rotacją, a następnie inkubowano z białkiem A/G PLUS koralikami Agarozowymi (sc-2003, Santa Cruz) przez kolejne 4 godziny w 4 °c z rotacją. Perełki przemyto sześć razy buforem żuchwowym, a następnie eluowano peptydami flagowymi lub gotując w buforze załadowczym 1× SDS przez 10 minut w celu wytworzenia Western blotting.

analiza LC-MS/MS i identyfikacja białek

eluowane białka otrzymane przez immunoprecypitację poddano 10% SDS-PAGE i zabarwiono coomassie brilliant blue (WB-0101, Beijing Dingguo Changsheng Biotechnology Co. Ltd). Taśmy żelowe zawierające próbki białka wycięto, pocięto na małe zatyczki, odwodniono (100% acetonitryl), zredukowano (10 mM DTT w 25 mM NH4HCO3 przez 45 minut w temperaturze 56 °C) i alkilowano (40 mM jodoacetamid w 25 mM NH4HCO3 przez 45 minut w temperaturze pokojowej w ciemności). Następnie zatyczki żelowe suszono i trawiono modyfikowaną sekwencjonowaniem trypsyną (40 ng na pasmo) w 25 mM NH4HCO3 przez noc w temperaturze 37 °C. w celu zakończenia reakcji enzymatycznej zastosowano kwas mrówkowy o stężeniu końcowym 1%. Otrzymany roztwór przeniesiono następnie do fiolki z próbką w celu analizy LC-MS / MS.

eksperymenty nanoLC-MS/MS przeprowadzono na precyzyjnym spektrometrze mas Q (Thermo Scientific) w trybie zależnym od danych,co pozwoliło na pozyskanie danych MS w wysokiej rozdzielczości 70 000 (m/z 200) w zakresie m/z 300-1 600. Surowe dane z analizy dokładnej Q analizowano za pomocą Proteome Discovery (Wersja 1.4) przy użyciu Sequest ht search engine do identyfikacji białek i Perkolator do analizy false discovery rate (FDR). Dane przeszukiwano w bazie białka ludzkiego UniProt (aktualizacja: 06-2013). Analizę FDR przeprowadzono za pomocą perkolatora, a FDR < 1% określono jako próg identyfikacji białka. Pewność peptydu została ustawiona na wysoką dla filtrowania peptydów.

RT-qPCR i RNA-Seq

całkowity RNA ekstrahowano z hodowanych komórek ludzkich lub stawów myszy za pomocą Trizolu (Thermo Fisher Scientific), a genomowy DNA usunięto za pomocą zestawu wolnego od DNA (Thermo Fisher Scientific). cDNA został wygenerowany za pomocą systemu odwrotnej transkrypcji Go Script (Promega). RT-qPCR przeprowadzono przy użyciu qPCR Mix (Toyobo) w systemie czasu rzeczywistego Cfx384 (Bio-Rad). Każda grupa miała po cztery studnie. Znaczenie statystyczne oceniano za pomocą testu t-Studenta z dwoma ogonami. Wszystkie eksperymenty RT-qPCR przeprowadzono z użyciem co najmniej trzech replik doświadczalnych i niezależnie powtarzano co najmniej dwa razy. W przypadku RNA-seq stawu kolanowego próbki RNA stawu kolanowego z tej samej grupy leczonej starszych myszy wstrzyknięto lentywirusami wyrażającymi Luc (n = 12 myszy) lub CLOCK (N = 12 myszy) mieszano jednakowo masowo, a RNA-seq przeprowadzono z dwoma technicznymi replikatami. Dla hmsc RNA-seq zbadano dwa biologiczne replikaty. Biblioteka sekwencjonowania została skonstruowana przy użyciu NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit Dla Illumina zgodnie z protokołem producenta. Wygenerowane biblioteki zostały zsekwencjonowane na platformach Illumina HiSeq X-Ten z sekwencjonowaniem sparowanym z długością odczytu 150 bp. Kontrola jakości i sekwencjonowanie zostały przeprowadzone przez NoVo Gene Bioinformatics Technology. Startery stosowane do qPCR przedstawiono w informacji dodatkowej, tabela S2.

przetwarzanie danych RNA-seq

wcześniej opisano proces przetwarzania danych RNA-seq.W oprogramowaniu Trim Galore (wersja 0.4.5) przycinano 34 surowe odczyty sparowane (https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore). Czyste odczyty zostały zmapowane do ludzkiego genomu HG19 UCSC lub mysim genomu mm10 przy użyciu hisat2 (Wersja 2.0.4).91 pliki sam zostały przekonwertowane do plików BAM przez SAMtools z parametrem “- S-b-q 10”.92 następnie Liczba odczytów została obliczona przez HTSeq (wersja 0.11.0) i tylko wysokiej jakości odczyty mapowane (jakość mapowania > 20) zostały zachowane.93 wartość fragmentów Na Kilobazę na milion (FPKM) dla każdego genu obliczono przy użyciu StringTie (Wersja 1.2.3).94 geny differentially expressed genes (DEGs) obliczono przy użyciu pakietu DESeq2 (wersja 1.22.2) z odcięciem “Q value (adjusted P value, padj) < 0,05 i |log2 (fold change)| > 1 dla hmscs lub |log2 (fold change)| > 0,5 dla stawów myszy”. Analiza wzbogacenia ontologii genów (GO) została przeprowadzona za pomocą ToppGene.95 analiza wzbogacania zestawu genów została przeprowadzona przez GSEA (Wersja 2.2.4). Zestaw genów SASP uzyskano z poprzedniego badania.42

DamID-seq

pLgw V5-EcoDam i Plgw EcoDam-V5-EMD zostały podarowane przez Prof. Basa van Steensela (Netherlands Cancer Institute (NKI)). DamID-seq wykonano zgodnie z opisem, 58 z modyfikacjami. Krótko mówiąc, lentywirusy Dam i Dam-EMD wytworzone z komórek HEK293T zatężono przez ultracentryfugację w temperaturze 19 400× g przez 2,5 h. granulki wirusa zawieszono w PBS. CLOCK+ / + i CLOCK – / – hMSCs były wysiewane w 6-studziennych naczyniach z 2 × 105 komórek na studzienkę. Każda grupa miała trzy biologiczne replikaty. Następnego dnia podłoże hodowlane zastąpiono 2 mL świeżego podłoża hodowlanego zawierającego lentiwirus Dam lub Dam-EMD. Po 72 godzinach po transdukcji pobrano komórki i wyizolowano genomowy DNA przy użyciu zestawu tkankowego Dneasy Blood & (69504, Qiagen). Dpnii (R0176s, New England Biolabs) trawienie, ligacja adaptera, dpnii (R0543s, New England Biolabs) trawienie, amplifikacja PCR i oczyszczanie przeprowadzono jak wcześniej opisano.58 w celu przycinania adaptera amplifikowane DNA poddano sonikacji i strawiono AlwI (R0513s, New England Biolabs). Biblioteka DNA została skonstruowana przy użyciu zestawu NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit Dla Illumina (E7370S, New England Biolabs). Biblioteki zostały połączone i poddane sparowanemu sekwencjonowaniu końcowemu z długością odczytu 150 bp na sekwencerach Illumina NovaSeq.

przetwarzanie danych DamID-seq

surowe odczyty danych Dam i Dam-EMD dla CLOCK+/+ i CLOCK−/− hmsc zostały przycięte w oprogramowaniu Trim Galore (wersja 0.4.5) (https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore). Przycięte odczyty zostały zmapowane do ludzkiego genomu UCSC hg19 przy użyciu Bowtie 2 (Wersja 2.2.9).96 duplikatów PCR zostało usuniętych za pomocą MarkDuplicates.program jar w narzędziach Picard. Następnie odczyty zostały posortowane za pomocą SAMtools (Wersja 1.6). Aby zminimalizować efekt sekwencjonowania odchylenia i głębokości, przetworzone odczyty z trzech replikatów dla każdej próbki zostały połączone. Następnie losowo wybrano tę samą liczbę (110 milionów) wysokiej jakości odczytów dla każdego typu komórki do dalszej analizy. Aby zobrazować sygnały DamID, obliczyliśmy stosunek log2 odczytów na Kilobazę na milion zmapowanych odczytów (RPKM) sygnałów Dam-EMD i Dam (log2 (Dam-EMD/Dam)) w zegarze+/+ i zegarze−/− hMSCs dla każdego 10-bp bin za pomocą programu bamCompare w oprogramowaniu deepTools (wersja 2.5.4-2-5ee467f).

do identyfikacji regionów LAD w CLOCK+/+ i CLOCK−/− hMSCs, najpierw obliczyliśmy sygnały DamID (stosunek log2 RPKM sygnałów Dam-EMD i Dam (log2 (Dam-EMD/Dam)) w CLOCK+/+ i CLOCK−/− hMSCs dla każdego 2-kb bin za pomocą programu bamCompare w oprogramowaniu deepTools (wersja 2.5.4-2-5ee467f). Następnie zaimplementowaliśmy pakiet R dla ukrytych modeli Markowa z emisją t (HMMt) (Wersja 0.1), aby zidentyfikować LADs (https://github.com/dinovski/asDamID/blob/master/scripts/hmmt_functions.R).

aby porównać sygnały DamID w regionach LAD między zegarem+/+ i zegarem−/− hMSCs, połączyliśmy regiony lad zidentyfikowane w zegarze+/+ i zegarze−/− hmscs w unijne i obliczyliśmy względny sygnał DamID (sygnał DamID w zegarze−/− hmscs minus sygnał DamID w zegarze+/+ hMSCs) dla każdego regionu lad Unii. Następnie względne sygnały DamID dla regionów LAD zostały wykreślone za pomocą Rideogramu pakietu r (Wersja 0.2.2), jak pokazano w informacji dodatkowej, Fig. S4d.97

ChIP-qPCR i ChIP-seq

krótko mówiąc, 1 × 106 CLOCK+/+ i CLOCK−/− hMSCs usieciowano w 1% (obj./obj.) formaldehydu w PBS przez 8 minut w temperaturze pokojowej, a reakcję zakończono przez inkubację z 125 mM glicyną przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Próbki następnie lizowano na lodzie przez kolejne 10 minut. Po sonikacji w Covaris S220 koncentruje ultradźwięków (Covaris) i odwirowywania przez 10 minut w 12,000 × g w 4 °C, supernatanty inkubowano przez noc w 4 °C z białkiem Dynabeads (Thermo Fisher Scientific, 10004d) skoniugowane z przeciwciałem anty-zegar, przeciwciałem anty-h3k9me3 lub IgG królika. Następnie elucję i odwrotne sieciowanie przeprowadzono w temperaturze 68 °C przez 2 godziny w termomikserze. Następnie DNA izolowano poprzez ekstrakcję alkoholem fenolowo-chloroform-izoamylowym i wytrącanie etanolem. Oczyszczone DNA poddano qPCR w celu oceny zajęcia zegara lub h3k9me3 w sekwencjach powtarzalnych. Wzbogacone fragmenty zostały skonstruowane w bibliotekach bez włączania sterowników spike-in za pomocą zestawów Kapa Hyper Prep z PCR Library Amplification / Illumina Series (KK8504, New England Biolabs) zgodnie z instrukcjami producenta. Wszystkie eksperymenty przeprowadzono co najmniej dwa razy z podobnymi wynikami. Znaczenie statystyczne oceniano za pomocą testu t-Studenta z dwoma ogonami.

przetwarzanie danych ChIP-seq

do przetwarzania danych ChIP-seq H3k9me3, surowe odczyty zostały przycięte za pomocą oprogramowania Trim Galore (wersja 0.4.5) (https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore). Przycięte odczyty zostały zmapowane do ludzkiego genomu UCSC hg19 przy użyciu Bowtie 2 (Wersja 2.2.9).96 zduplikowanych odczytów zostało usuniętych za pomocą Markduplikatów.program jar w narzędziach Picard. Następnie odczyty zostały posortowane za pomocą SAMtools (Wersja 1.6). Aby zminimalizować efekt sekwencjonowania odchylenia i głębokości, przetworzone odczyty z trzech replikatów dla każdej próbki zostały połączone. Następnie losowo wybrano tę samą liczbę (130 milionów) wysokiej jakości odczytów dla każdego typu komórki do dalszej analizy. Aby zwizualizować sygnały ChIP-seq, obliczyliśmy znormalizowane odczyty, określając wartości RPKM dla każdego 10-bp bin. Dla wywołania szczytowego H3K9me3 zastosowano SICER (Wersja V1.1) z parametrem “-w 200-g 3”.98 tylko zwane piki h3k9me3 z odcięcia FDR 1% lub wyższe zostały zachowane.

w celu identyfikacji “gór H3K9me3″ obliczono sygnał H3K9me3 w liczbach na milion (CPM) w każdym piku H3K9me3. Następnie uszeregowaliśmy piki H3K9me3 w kolejności zwiększania sygnału H3K9me3 i wykreśliliśmy zajętość układu h3k9me3 w zegarze + / + i zegarze – / – hMSCs, jak pokazano w informacji dodatkowej, rys. S4F. działki te pokazały wyraźny punkt, w którym sygnał zajętości H3K9me3 zaczął gwałtownie rosnąć. Następnie wyznaczono punkty przegięcia tych krzywych. Dodatkowo zdefiniowaliśmy szczyty h3k9me3 powyżej punktów przegięcia jako” góry h3k9me3″, a szczyty h3k9me3 poniżej tych punktów jako typowe szczyty H3K9me3.

ATAC-seq

ATAC-seq wykonano zgodnie z opisem wcześniej.W skrócie, łącznie 50 000 komórek przemyto dwukrotnie PBS i zawieszono w 50 µL buforu lizy (10 mM tris-HCl (pH 7,4), 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 0,1% (v/v) substytut Nonidetu P40). Zawiesinę jąder odwirowywano następnie w temperaturze 500 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C, a następnie dodano 50 µL mieszaniny reakcji transpozycji (10 µL buforu 5 × TTBL, 4 µL mieszaniny TTE i 36 µL H2O wolnego od nukleaz) z zestawu Prep Biblioteki DNA TruePrep V2 dla Illumina (Vazyme Biotech). Następnie próbki inkubowano w temperaturze 37 °C przez 30 minut. Biblioteki następnie Amplifikowano i oczyszczano przy użyciu TruePrep DNA Library Prep Kit V2 dla Illumina (Vazyme Biotech). Jakość biblioteki oceniano za pomocą analizatora fragmentów. Ostatecznie biblioteki zostały zsekwencjonowane na platformach Illumina HiSeq X-Ten z sekwencjonowaniem sparowanym z długością odczytu 150 bp.

przetwarzanie danych ATAC-seq

do przetwarzania danych ATAC-seq, surowe odczyty zostały przycięte za pomocą oprogramowania Trim Galore (wersja 0.4.5) (https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore). Przycięte odczyty zostały zmapowane do ludzkiego genomu UCSC hg19 przy użyciu Bowtie 2 (Wersja 2.2.9) z parametrem “- X 2000-N 1-L 25-no-mixed-no-discordant-t”.96 duplikatów odczytów zostało usuniętych za pomocą MarkDuplicates.program jar w narzędziach Picard. Następnie odczyty zostały posortowane za pomocą oprogramowania SAMtools (Wersja 1.6). Następnie, przetworzone odczyty z trzech replikatów dla każdej próbki zostały połączone. Aby zobrazować sygnały ATAC, rozszerzyliśmy każdy odczyt o 250 bp i znormalizowaliśmy odczyt o wartość RPKM dla każdego 10-bp bin. Dla wywołania szczytu ATAC MACS2 (wersja 2.1.1.20160309) został użyty z parametrem “–nomodel –shift 0 –extsize 250 –call-summits”.100 pików ATAC o wartościach q < 0,01 zostało zachowanych. Piki Atac zidentyfikowane w CLOCK+/+, ale nie w CLOCK−/− hMSCs zostały zdefiniowane jako “zamknięte” piki ATAC; piki Atac zidentyfikowane w CLOCK−/−, ale nie w CLOCK+/+ hMSCs zostały zdefiniowane jako “otwarte” piki ATAC. Oszacowanie rozkładu genomowego użytych pików ATAC annotatePeaks.pl program w homer software.101

ocena odtwarzalności danych sekwencjonowania

aby ocenić odtwarzalność danych H3k9me3 ChIP-seq i ATAC-seq, odległość euklidesową między replikatami obliczono w następujący sposób: odczyty były liczone i normalizowane przez RPKM przy rozmiarze 2 kb. Następnie odległość euklidesową obliczono w R (Wersja 3.5.1) w celu oceny odtwarzalności. Mniejsze odległości Euklidesowe oznaczają większe korelacje. W celu oceny odtwarzalności danych DamID-seq przeprowadzono analizę głównych składników (PCA) w r (Wersja 3.5.1). W celu oceny odtwarzalności danych RNA-seq narysowano wykresy rozproszenia na podstawie znormalizowanego logarytmu (RLOG) z liczbą odczytu DESeq2 i obliczono współczynnik korelacji Pearsona między replikatami.

doświadczenia na zwierzętach

do analizy tworzenia potworniaka, myszy NOD/SCID (w wieku 6-8 tygodni, zakupione od Beijing Vital River Laboratory Animal Technologies Co. Ltd) wstrzyknięto 3 × 106 CLOCK+/+ lub CLOCK−/− hESCs w roztworze Matrigel: mTeSR (1: 4). Potworniaki zebrano 8-12 tygodni po wstrzyknięciu do dalszej analizy.

w przypadku testów transplantacyjnych hmsc, 1 × 106 CLOCK+/+ lub CLOCK−/− hmsc transdukowane lentywirusami wyrażającymi Luc wstrzyknięto do mięśnia ta nagich myszy (w wieku 6-8 tygodni). Myszy potraktowano następnie D-lucyferyną (LUCK-1g, GoldBio) i zobrazowano za pomocą systemu obrazowania spektrum Ivis (Xenogen, Caliper, Waltham, MA, USA). Obrazy bioluminescencyjne pozyskiwano w trybie “auto”. Każda grupa miała sześć replik biologicznych. Znaczenie statystyczne oceniano za pomocą testu t-Studenta z dwoma ogonami.

w celu wykrywania poziomu zegara związanego ze starzeniem, myszy w różnym wieku (młode, 1 miesiąc, N = 5 myszy; stare, 15 miesięcy, N = 10 myszy) poddano eutanazji, a stawy zebrano do analizy RT-qPCR. Znaczenie statystyczne oceniano za pomocą testu t-Studenta z dwoma ogonami.

w celu oceny, czy lentywiralne podawanie zegara może złagodzić zespoły związane ze starzeniem się, lentywirusy z ekspresją Luc (n = 14 myszy) lub CLOCK (N = 13 myszy) wstrzyknięto do jam stawowych 18-miesięcznych myszy (zakupionych z SPF (Beijing) Biotechnology) i uzupełniono po 8 tygodniach wstrzyknięcia. Eksperyment przeprowadzono w czasie 15 tygodni po pierwszym wstrzyknięciu lentywirusów wyrażających Luc lub CLOCK. W szczegółach myszy trenowano na bieżni (SA101, SANS) na nachyleniu 5° przez 3 dni przez 20 minut każdego dnia, z prędkością przyspieszaną od 0 do 20 m / min. W dniu testu myszy biegły po bieżni z początkową prędkością 0 m/min, a następnie prędkość została zwiększona o 2 m/min do 20 m / min. Cały czas biegu ustalono na 20 min. Częstość występowania łagodnego bodźca szoku elektrycznego była rejestrowana i analizowana (Luc, N = 14 myszy; CLOCK, N = 13 myszy). Tomografię komputerową wykonano w czasie 16 tygodni po pierwszym wstrzyknięciu (Luc, N = 14 myszy; zegar, N = 13 myszy). Myszy poddano eutanazji, a stawy zebrano do oceny histologicznej (Luc, N = 14 myszy; zegar, N = 13 myszy) i kwantyfikacji mRNA (Luc, N = 12 myszy; zegar, N = 12 myszy). Znaczenie statystyczne oceniano za pomocą testu t-Studenta z dwoma ogonami.

Histologia i immunohistochemia

do analizy histologicznej pobrane stawy myszy utrwalano 4% PFA przez 2 dni i osadzano w parafinie po odwapnieniu przez 14-21 dni. Sekcje (5 µm) zabarwiono szybko zielonym FCF (0,02%) i safraniną O (0.1%) zgodnie z instrukcją producenta.

barwienie immunohistochemiczne przeprowadzono metodą barwienia DAB, jak opisano wcześniej, z pewnymi modyfikacjami.33,34,102 po pierwsze, szkiełka poddano deparaffinizacji i ponownie nawodniono za pomocą ksylenu i różnych stężeń alkoholu. Pobieranie antygenu przeprowadzono stosując trawienie trypsyny (ZLI-9010, ZSGB-BIO) przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Nadtlenek wodoru (3%) stosowano do blokowania endogennej aktywności peroksydazy przez inkubację przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Następnie szkiełka blokowano 10% surowicą osła przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej i inkubowano z przeciwciałem anty-P16 (Ab54210, Abcam, 1: 200) w temperaturze 4 °C przez noc i z przeciwciałem wtórnym (PV-6002, ZSGB-BIO) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej przed barwieniem DAB (ZLI-9017, ZSGB-BIO).

deklaracje etyczne

eksperymenty zaangażowane w to badanie były zgodne z zasadami formatu wniosku o zatwierdzenie etyczne dla badań z udziałem zwierząt i zostały wcześniej zatwierdzone przez Institutional Animal care and Use Committee Instytutu Zoologii (Chińska Akademia Nauk). Znieczulenie myszy przeprowadzono za pomocą izofluranu, a eutanazję za pomocą CO2, a następnie zwichnięcie szyjki macicy.

analiza statystyczna

analizy statystyczne przeprowadzono przy użyciu oprogramowania Graph-Pad Prism. Dane są prezentowane jako średnie ± SEM lub SD. Porównania przeprowadzono z dwuogonowym niesparowanym testem t Studenta. Wartość P (p) < 0, 05 została zdefiniowana jako statystycznie istotna.