synteza kolagenu
regulacja syntezy kolagenu kostnego
synteza kolagenu w hodowlach narządów gryzoni calvariae i kulturach komórkowych została oceniona za pomocą kilku różnych testów . W najczęściej stosowanym teście Kalwaria i komórki inkubuje się z znakowaną radioizotopem proliną przez kilka godzin przed zakończeniem hodowli. Włączenie znakowanej radioizotopem proliny do białka strawnego kolagenazy (znakowanie CDP) i białka noncollagen (znakowanie NCP) mierzy się w ekstraktach z kultur przy użyciu wysoce oczyszczonej kolagenazy bakteryjnej . Procent syntezy kolagenu oblicza się na podstawie wartości CDP i NCP po skorygowaniu pod kątem większej obfitości proliny w kolagenie w stosunku do białek niemolagenowych . Produkcję kolagenu można również określić, mierząc zawartość hydroksyproliny w kulturach komórkowych lub organowych, ponieważ hydroksyprolina jest praktycznie unikalna dla kolagenów. Metody te nie rozróżniają różnych rodzajów kolagenu włóknistego. Jednak kolagen syntetyzowany przez Kultury narządów kostnych i większość kultur komórek osteoblastycznych jest w dużej mierze typem i (>95%), tak że wartość znakowania CDP zwykle odzwierciedla syntezę kolagenu typu I. W razie potrzeby, produkcję różnych typów kolagenu można odróżnić za pomocą chromatografii jonowymiennej i elektroforezy w żelu poliakrylamidowym znakowanych radioizotopem ekstraktów kultur komórkowych lub organowych . Ekspresję kolagenu typu i w hodowlach komórek ludzkich oceniano również poprzez pomiar wydzielania prokolagenu i-końcowego propeptydu . Wreszcie, specyficzne sondy cDNA w Northern blotting i startery specyficzne dla alleli w testach reakcji łańcuchowej odwrotnej transkryptazy-polimerazy zostały wykorzystane do oceny ekspresji mRNA kolagenu w modelach kości. Pomiar wpływu 1,25 (OH) 2D3 na syntezę kolagenu i poziom mRNA dał porównywalne wyniki przy użyciu tych różnych testów.
1,25 (OH)2D3 hamuje syntezę kolagenu w kulturach organowych 21-dniowych płodów szczura calvariae i noworodka myszy calvariae, z niewielkim lub żadnym wpływem na syntezę białek niecollagenowych. Maksymalne zahamowanie syntezy kolagenu o 1,25 (OH) 2D3 u szczura (około 50%) zachodzi przy 10 nM . 1,24 R,25-(OH)3D3 hamuje również syntezę kolagenu, ale jest słabszy niż 1,25(OH) 2D3 . 25 – (OH) D3 i 24R,25(OH)2D3 nie zmieniają syntezy kolagenu poniżej 100 nM . Metabolity witaminy D hamują syntezę kolagenu i stymulują resorpcję kości długich płodu szczura o podobnej względnej mocy, która koreluje z powinowactwem metabolitów do szkieletowych VDRs . W celu określenia selektywności komórkowej hamowania syntezy kolagenu przez 1,25(OH)2D3, hodowle narządów płodu szczura calvariae traktowano 1,25 (OH)2D3 przez 22 godziny, a następnie inkubowano z tritiowaną proliną przez ostatnie 2 godziny hodowli. Kość Środkowa (Dojrzałe osteoblasty) została rozcięta bez okostnej (mniej Dojrzałe osteoprogenitory i fibroblasty), a oba przedziały analizowano oddzielnie pod kątem włączenia tritiowanej proliny. 1,25 (OH)2D3 zmniejsza syntezę kolagenu w kości Środkowej, ale nie w okostnej, co wskazuje na selektywność efektu 1,25(OH) 2D3 dla dojrzałych osteoblastów . Stosując protokół in vivo, w którym noworodkom szczurów podawano wiele wstrzyknięć tritiowanej proliny do nowo zsyntetyzowanej macierzy kostnej, 25 ng 1,25(OH)2D3 podawanych w dniach 1, 3 i 5 hamowało syntezę macierzy kostnej, ocenianą histomorfometrią autoradiografów kości piszczelowej i calvariae .
1,25 (OH)2D3 hamuje również produkcję kolagenu w komórkach osteoblastycznych kostniakomięsaka Ros 17/2 , 8 szczura , pierwotnych komórkach osteoblastycznych szczura i myszy oraz nieśmiertelnej linii komórek osteoblastu myszy (MMB-1). 1,25 (OH) 2D3 ma większy wpływ hamujący na syntezę kolagenu typu I podczas wzrostu pierwotnych mysich komórek osteoblastycznych w fazie log, niż w momencie zbiegu, być może dlatego, że proliferujące komórki zawierały więcej VDRs . Podobnie, 1,25 (OH)2D3 hamowanie syntezy kolagenu jest większe w rzadkich hodowlach komórek MMB-1, które mają wyższy poziom VDR niż zbiegające się komórki MMB-1 . 1,25 (OH)2D3 hamowanie syntezy kolagenu jest równoważne w rzadkich i zbiegających się pierwotnych komórkach osteoblastycznych szczura, ale liczba VDR nie zmienia się podczas wzrostu komórek . Łącznie dane te pokazują, że stopień zahamowania syntezy kolagenu przez 1,25 (OH) 2D3 jest w dużej mierze determinowany przez komórkową ilość VDRs. 1,25 (OH) 2D3 hamuje poziom mRNA kolagenu w fazie proliferacji długoterminowych hodowli pierwotnych komórek osteoblastycznych szczura i zapobiega powstawaniu zmineralizowanych guzków kostnych przez te kultury . Badania te pokazują, że 1,25(OH)2D3 hamuje różnicowanie osteoprogenitorów, które tworzą zmineralizowane guzki w pierwotnych hodowlach komórek osteoblastycznych szczura . Jednakże zahamowanie tworzenia się guzków przez 1,25 (OH) 2D3 może być wtórne do zahamowania syntezy kolagenu typu I w kulturach.
w przeciwieństwie do działania hamującego opisanego powyżej, 1,25 (OH) 2D3 przejściowo stymuluje syntezę kolagenu i białek niecollagenowych (około dwukrotnie), która osiąga szczyt między 12 a 24 h, w nieśmiertelnej mysiej linii komórek osteoblastycznych MC3T3-E1. W tym badaniu nie odnotowano procentowego udziału kolagenu syntetyzowanego przez Kultury (kolagen w stosunku do całkowitej syntezy białek) ; w rezultacie nie było możliwe określenie selektywności efektu 1,25 (OH)2D3 dla syntezy kolagenu. 1,25 (OH) 2D3 zwiększa również ekspresję kolagenu w linii komórek kostniakomięsaka ludzkiego MG-63 i pierwotnych hodowlach ludzkich komórek osteoblastycznych . Co ciekawe, wzrost syntezy kolagenu o 1,25 (OH) 2D3 w komórkach MG63 jest blokowany przez białko wiążące insulinopodobny czynnik wzrostu 5, które oddziałuje bezpośrednio na VDR i zapobiega heterodimeryzacji z receptorem retinoidowym X RXR . Jednak w innych badaniach wykazano, że 1,25(OH)2D3 zmniejsza procentową syntezę kolagenu w komórkach MC3T3-E1 . MC3T3 – E1 i MG-63 reprezentują komórki preosteoblastyczne, które in vitro podlegają różnicowaniu osteogennemu z kwasem askorbinowym; 1,25(OH)2D3 hamuje wzrost komórek i zwiększa ekspresję osteokalcyny i aktywność fosfatazy alkalicznej w obu liniach komórkowych. Komórki MC3T3E1, podobnie jak większość osteoblastycznych linii komórkowych, wykazują znaczną zmienność fenotypową . Dlatego niektóre z tych rozbieżnych wyników mogą być spowodowane zmianami w komórkach używanych do eksperymentów. Łącznie dane te sugerują, że 1,25(OH)2D3 może działać jako hormon różnicujący we wczesnych komórkach linii osteoblastów, co powoduje zwiększoną ekspresję kolagenu typu I. Natomiast 1,25 (OH) 2D3 hamuje ekspresję kolagenu typu i w dojrzałych osteoblastach.
