transformacja opornego pestycydu chlordekonu przez Desulfovibrio sp.

Izolacja Desulfovibrio sp.

86 uzyskano z konsorcjum degradującego chlordekon 865 przy użyciu warunków redukcji siarczanów. Ponieważ bakteryjne konsorcjum 86, zdolne do transformacji chlordekonu, otrzymano ze wzbogaconego podłoża mineralnego (MM) o nazwie MM + 5, uzupełnionego chlordekonem, utrzymano główny skład chemiczny, ale zmodyfikowano donory i akceptory elektronów. Kilka preparatów mediów stosowanych do wzbogacania bakterii redukujących siarczany wykorzystuje kwasy organiczne, np. mleczan, jako źródła węgla i energii (donor elektronów) oraz siarczan,który jest używany jako akceptor eletronu15,16,17, 18. W tym kontekście pirogronian w medium ciekłym MM + został zastąpiony mleczanem i dodano siarczan (medium ciekłe MMD, patrz sekcja “Metody”). Wzbogacenie rozprowadzano na agarze MMD, a brązowe kolonie bakteryjne podobne do vibrio (obserwowane pod mikroskopem optycznym) oczyszczano dalej przez dwa dodatkowe smugi płytki (Fig. S1). Stwierdzono, że wyizolowany szczep bakterii jest identyczny z Desulfovibrio Sp.86 z konsorcjum 86 na podstawie 100% tożsamości genów 16S rRNA (1538 bp każdy).

analiza genomu desulfovibrio Sp.86

cały genom składa się z pojedynczego kolistego chromosomu o długości 3 464 070 bp. Analiza checkm19 przeprowadzona na 61 genomach i 284 liniach wskazuje, że genom należy do Deltaproteobakterii, a kompletność CheckM wynosi 100% (Brak znacznika zerowego). Średnia zawartość G + C dla DNA wynosi 58,06%. Przewidywano łącznie 3342 kodujące sekwencje DNA (CDSs) dla chromosomu, 4 pseudogenów i 10 różnych RNA (misc-RNA), 3 operonów rRNA i 54 genów tRNA.

trzy geny 16S rRNA Desulfovibrio Sp.86 jest identycznych. Ich najlepsze BLAST hits (NCBI) były z uncultured Desulfovibrio sp. klony z mikrobiologicznych ogniw paliwowych, takich jak MFC63A04 (numer akcesyjny Genbanku : FJ823865; zasięg 98%; tożsamość 99,87%)20. Drzewo filogenetyczne wykorzystujące dostępne 16S rRNA bakterii uprawnych potwierdziło podobieństwa między Desulfovibrio sp.86 i Desulfovibrio simplex dsm4141 (Genbank 16S rRNA numer akcesyjny: Nr_117110; pokrycie 99%; tożsamość 99, 22%; Sekwencja genomowa niedostępna) (rys. S2) 21. Na poziomie genomowym Desulfovibrio Sp.86 zajmuje pierwsze miejsce w grupie Desulfovibrio desulfuricans subsp. ul. odsiarczająca ATCC 27774 Genom (GenBank:NC_011883). Niemniej jednak Desulfovibrio Sp.86 dzieli tylko 1408 genów (43%) Z D. odsiarczkami (ponad 80% identyczności aminokwasów i 80% pokrycia). Ponadto średnia tożsamość nukleotydowa (ANI) pomiędzy Desulfovibrio sp.86 i zsekwencjonowane genomy Desulfovibrio są niższe niż 95% wartość odcięcia ANI ogólnie akceptowana dla wyznaczania gatunków (Fig . S3) 22. Wyniki te wskazują, że Desulfovibrio sp.86 to najprawdopodobniej nowy gatunek z rodzaju Desulfovibrio. Obecność dwóch dysmutaz ponadtlenkowych i jednego genu katalazy odpowiada za względną tolerancję tlenu. Zgodnie z oczekiwaniami, Desulfovibrio Sp.Genom 86 wykazuje rozległy dopełniacz genów dla metabolizmu siarki, obejmujący szlaki oddychania siarki ze źródłami nieorganicznymi, takimi jak siarczan, siarczyn, wodorosiarczyn i tetrationan jako akceptory elektronów. Organiczne źródła siarki mogą być dostarczane przez produkty fermentacji biomasy siarki (sulfochinowozy lipidów sulfochinowozylowych) sulfooctanu, nie proteogennego aminokwasu siarki tauryny przez aldehyd sulfooctowy lub alkanosulfonaty23.

Desulfovibrio Sp. z o. o.86 rozkłada chlordekon do znanych produktów transformacji, jak również nieoczekiwany związek zawierający siarkę

zdolność rozkładania chlordekonu wyizolowanego Desulfovibrio Sp.Szczep badano stosując techniki GC-MS (chromatografia gazowa spektrometria Mas) I LC-HRMS (chromatografia cieczowa spektrometria masowa wysokiej rozdzielczości) w warunkach wzrostu z powodzeniem zastosowanych dla Desulfovibrio sp.86 izolacja (MMD medium ciekłe). Jako reduktor zastosowano Na2S, a w atmosferze beztlenowej N2/H2 (98/2; V / V) zastosowano system schowka. Te warunki inkubacji doprowadziły do całkowitego zaniku sygnału chlordekonu w GC-MS i LC-HRMS i doprowadziły do podobnych profili GC-MS i LC-HRMS TP, jak te uzyskane z Citrobacter sp.866: monochlordekon A1, pentachloroinden B1, tetrachloroinden B3-B4 i kwasy polichloroindenokarboksylowe C1-C2 i C3-C4 (Fig. 1a, b). W systemie schowka przeprowadzono hodowle bakterii przy użyciu szklanych fiolek o pojemności 100 mL z hydrofobową porowatą folią, aby umożliwić wymianę gazową i uniknąć zanieczyszczenia. Ten warunek inkubacji został uznany za warunek “odnowionej atmosfery” (RA). W tym systemie atmosfera była regularnie odnawiana o N2/H2 (98/2; V/V), A Skrzynka nie była kontrolowana termostatycznie, więc temperatura wahała się między 25 a 33 °C. Aby lepiej kontrolować warunki wzrostu i degradacji, Desulfovibrio sp.86 kultur umieszczano w pożywce MMD przy użyciu szklanych fiolek o pojemności 100 mL, zamkniętych przegrodą z kauczuku butylowego, w piecu w temperaturze 30 °C. zamknięte fiolki wstępnie przepłukano gazem N2 / H2 (98/2; V/V) w celu zapewnienia beztlenowości. Ten warunek inkubacji był uważany za Warunki “ograniczonej atmosfery” (CA).

GC-MS i LC-HRMS monitorowanie, w trybie pełnego skanowania (Dowolna Jednostka), transformacji chlordekonu przez Desulfovibrio Sp.86 w Warunkach RZS (w schowku, beztlenowa (N2 / H2, 98/2, V / V), Temperatura pokojowa, otwarte fiolki z porowatą folią, w pożywce MMD uzupełnionej 40 mg/L chlordekonu) i w Warunkach CA (w piekarniku, beztlenowa (wstępnie oczyszczona N2/H2, 98/2, V/V), 30 °C, zamknięte fiolki, w pożywce MMD uzupełnionej 40 mg/L chlordekonu); oraz identyfikacja TP F1. a) monitorowanie GC-MS transformacji chlordekonu przez Desulfovibrio Sp.86 w Warunkach RZS. B) monitorowanie LC-HRMS transformacji chlordekonu przez Desulfovibrio Sp.86 w Warunkach RZS. C) monitorowanie przez GC-MS transformacji chlordekonu przez Desulfovibrio Sp.86 w Warunkach OK. d) monitorowanie LC-HRMS transformacji chlordekonu przez Desulfovibrio Sp.86 w Warunkach OK. In each graph, green circles represent chlordecone, red circles F1, blue triangles 10-monohydrochlordecone A1, pink squares 2,4,5,6,7-pentachloroindene B1 and purple diamonds 2,5,6,7-tetrachloroindenecarboxylic acid and 2,4,5,6-tetrachloroindenecarboxylic acid C1–C2. In RA conditions traces of B3-B4 and C3–C4 TPs were also detected. (e) Chlordecone transformation over the time in CA conditions, OD600 corresponds to the optical density at 600 nm in biotic conditions. (f) GC mass spectrum of F1 TP and its interpretation.

po sześciu tygodniach inkubacji z chlordekonem pestycyd nie był już wykrywalny za pomocą tych samych technik analitycznych. Jednocześnie pojawił się jeden nieznany związek chlorowany o nazwie F1. Był wykrywalny tylko przez GC-MS (25,6 min) (rys. 1c). Podobnie jak w wcześniej opisywanych kulturach degradacji chlordekonu5,6, główna transformacja chlordekonu pojawiła się podczas fazy stacjonarnej (Fig. 1e). Ponieważ w LC-HRMS nie można było zaobserwować widocznego piku chlorowanego (Fig. 1D), opieraliśmy strukturalne Wyjaśnienie F1 na interpretacji danych GC-MS (rys. 1f). Zakładając, że wyższy wzór izotopowy wyśrodkowany w m/z 507.8 zawierał jon cząsteczkowy, postawiliśmy hipotezę o dwóch możliwych neutralnych wzorach dla F1, C10Cl10O2H2 i C10Cl10SH2. Fragmenty In-source były bardzo podobne do tych obserwowanych w polichlorowanych strukturach opartych na biszomokubanie, w tym chlordekonie, hydrochlordekonach, chlordekolu i mirex5,6,24. Rzeczywiście, wzorce izotopowe w m/z 201.0, 235.9 i 271.9 prawdopodobnie powstał ze znanej retrocyklodimeryzacji biszomokubanu i odpowiadał dodatnio naładowanym fragmentom C5. Porównanie z symulacjami izotopowymi ograniczyło możliwość do następujących jonów rodnikowych: + · + · i+*, przy n = 0,1. Ten ostatni bis-utleniony wzór ogólny okazał się wysoce nieprawdopodobny, ponieważ wymagał obecności funkcji gem-diol lub ugrupowania Gem-chlorohydryny w pierścieniu cyklopentenylowym, które musiało wytrzymać surowe warunki chromatograficzne GC (> 200 °C). Zamiast tego doszliśmy do wniosku, że cząstka siarki, tj. funkcja tiolowa, była prawdopodobnie obecna na policyklu bishomocubane. Zaproponowaliśmy dla F1 konstrukcję przedstawioną na Rys. 2A i zasugerował nazwę chlordektiol, Analog siarki chlordekolu (alkohol chlordekonowy).

synteza wzorca chemicznego chlordektiolu i jego pełna charakterystyka. a) schemat reakcji chemicznej syntezy chlordektiolu i przesunięć NMR w CD2Cl2: przesunięcie 1H NMR, kursywą i podkreśleniem oraz przesunięcie 13C NMR, pogrubioną czcionką; podobnie kolorowe okręgi oznaczają równoważne atomy węgla. B) symulacja m / z C10Cl10O2H -, C) symulacja m / z c10cl10sh -, d) wyodrębnione spektrum masowe syntetycznego chlordektiolu o wysokiej rozdzielczości w trybie ujemnym (LC-HRMS).

synteza wzorca chlordektiolu i potwierdzenie, że produkt transformacji F1 jest identyczny z chlordektiolem

w celu potwierdzenia struktury F1, wzorcowy chlordektiol został zsyntetyzowany chemicznie i w pełni scharakteryzowany. Aby osiągnąć chemiczne redukcyjne siarczkowanie chlordekonu, potrzebne były dwa kroki. Pierwszy polegał na przekształceniu funkcji gem-diolowej chlordekonu w równowadze z odpowiadającym mu formą ketonową 20,25 w analog siarki, tj. ugrupowanie Gem-tiol/tiokarbonyl. Aby wykonać ten etap, stosuje się zwykle odczynniki siarki zawierające fosfor26, 27. Tutaj użyliśmy decasiarczku fosforu (P4S10) zwanego również odczynnikiem Berzelius27,28 zgodnie z protokołem Zaidi i współpracowników, którzy z powodzeniem zsyntetyzowali kamfortiol29 (Fig. 2A). Drugi etap polegał na redukcji półproduktu gem-tiolowego przy użyciu NaBH4. Po oczyszczeniu otrzymano białe ciało stałe z ogólną wydajnością 73% (Fig. 2A). Analizy 1D – i 2D-NMR potwierdziły strukturę chlordektiolu: (i) dwa sygnały 1H integrujące każdy dla jednego protonu i sprzężone ze sobą (δ 3,78 ppm, d, J = 5,5 Hz i δ 2,01 ppm, D, J = 5,5 Hz), przy czym ten Przy δ 3,78 ppm skorelowany jest z sygnałem 13C przesuniętym w dół (δ 55,1 ppm) w eksperymencie HSQC, które doskonale uwzględniają ugrupowanie CH obok funkcji tiolowej I (ii) całkowitą liczbę cząsteczek CH W SZEŚĆ widocznych sygnałów 13c odzwierciedlających płaszczyznę symetrii zachowaną w obecnej strukturze bishomocubane (rys. 2A, figi. S19–23). Chociaż w transformacji mikrobiologicznej F1 nie można było wykryć przy użyciu narzędzia LC-HRMS w rozwiniętych warunkach, skoncentrowana próbka syntetycznego wzorca chlordektiolu dostarczyła znaczącego sygnału. Potwierdzono obecność atomu siarki i oczekiwanego neutralnego wzoru C10Cl10SH2 (Fig. 2c, d) i wykluczono surowe wzory C10Cl10O2H2 (Fig. 2b). Wreszcie, analiza GC-MS wykazała idealne dopasowanie (tj. ten sam czas retencji 25,6 min i te same widma masowe w źródle Fig. S6) pomiędzy standardem syntetycznym a TP F1, definiując go jako chlordektiol. Rzeczywiście, F1 reprezentuje pierwszego członka nowej rodziny TPS chlordekonu posiadającego po raz pierwszy atom siarki.

zdolność Desulfovibrio Sp. z o. o.

związki A1, B1, C1-C2 i F1 reprezentujące cztery rodziny TPs prawdopodobnie powstałe w obecności Desulfovibrio Sp.86 zostało zsyntetyzowanych zgodnie z wcześniej zgłoszonymi protokołami chemicznymi6 i opracowanych dla F1. Każda z nich została inkubowana w obecności Desulfovibrio sp.Kultury w warunkach, w których wykazano, że sprzyjają redukcyjnemu siarczkowaniu (zamknięta fiolka; warunki CA) lub dechlorowaniu z otwarciem pierścienia (Otwarta fiolka; warunki RA). Przeprowadzono podwójny monitoring GC-MS i LC-HRMS wszystkich próbek.

po miesięcznej inkubacji w Warunkach CA, 10-monohydrochlordekon A1 został całkowicie przekształcony w dwa nieznane związki chlorowane ledwo oddzielone przy użyciu GC-MS (czasy retencji: 24,3 min F2 i 24,5 min F3, Fig. 3, figi. S7-S11). Wykazali identyczne widmo masowe u źródła, które było bardzo podobne do wzorca fragmentacji F1 (Fig. S8). Wszystkie wykryte fragmenty u źródła okazały się posiadać o jeden atom chloru mniej niż ich analogi w widmie masowym F1. Związki F2 i F3 uznano zatem za diastereoizomery 10-monohydrochlordektiolu (Fig. 3c). Zostało to potwierdzone przez chemiczną syntezę dwóch wzorców 10-monohydrochlordektiolu z 10-monohydrochlordekonu A1 przy użyciu procedury stosowanej wcześniej do syntezy chlordektiolu F1 (Fig. S24–27). Te wzorce chemiczne miały te same czasy retencji (24,3 i 24,5 min) i te same widma masowe w porównaniu z biologicznymi F2 i F3 (Fig. S8). TPs B1, C1-C2 i F1 pozostały niezmienione nawet po sześciomiesięcznej inkubacji z Desulfovibrio sp.86 w Warunkach CA.

losy produktów przemiany chlordekonu z Desulfovibrio Sp.86 w zależności od warunków inkubacji. a) przekształcenie chlordekonu w Warunkach RZS oraz b) w Warunkach CA. Przekształcenie (c) A1, (d) F1, (e) B1 i (f) C1–C2.

po sześciomiesięcznej inkubacji w Warunkach RZS chlordektiol F1 został częściowo przekształcony w 10-monohydrochlordektiole F2 i F3, a dwa inne nieznane gatunki chlorowane wykryto za pomocą GC-MS, o nazwie F4 (czas retencji: 17,9 min) i F5 (czas retencji: 26,6 min) (Fig. 3d, rys. S12). Żaden z tych dwóch związków nie dał żadnego wykrywalnego sygnału w LC-HRMS. Analiza GC-MS umożliwiła zaproponowanie c10cl6sh4 jako surowego wzoru dla F4 (rys. S14) i C11Cl10SH4 dla F5 (rys. S15). Chlordeksiarczek metylu zsyntetyzowano chemicznie i w pełni scharakteryzowano NMR (Fig. S28-31). Doskonała zgodność czasów retencji GC i widm masowych GC chlordeksiarczku metylu i biologicznego F5 (rys. S13) potwierdza jego postulowaną tożsamość. Na uwagę zasługuje struktura F5 (rys. 3d) reprezentuje s-metylowaną formę F1. Dokładna natura F4 pozostaje do wyczyszczenia (patrz si-tekst uzupełniający). Wszystkie pozostałe TPs pozostały niezmienione w Warunkach RA.

podsumowując, A1 (utworzony w Warunkach RZS) został poddany redukcyjnemu siarczkowaniu, podobnie jak chlordekon; w obu warunkach inkubacji polichloroindenes (B1 i C1-C2) nie wydawał się ulegać rozkładowi przez Desulfovibrio Sp.86, podczas gdy F1 (produkowany w Warunkach CA) może być przekształcony w Warunkach RA (rys. 3).

badanie warunków inkubacji prowadzących do siarczkowania redukcyjnego bakterii

w celu zakwestionowania parametrów fizykochemicznych lub fizjologicznych wpływających na szlaki przemian chlordekonu w kulturach Desulfovibrio Sp.86, wybrano monitorowanie GC-MS (obecność B1 i F1 jako dowody, odpowiednio, RZS i CA).

dwa związki nieorganiczne zawierające siarkę, reduktor Na2S i akceptor elektronów Na2SO4, były obecne w oryginalnym ciekłym medium MMD. Pierwsza seria eksperymentów w zamkniętych fiolkach z podstawieniem Na2S innymi środkami redukującymi, siarkowymi lub nie, tj. cysteiną i cytrynianem tytanu (III) (TiCi) doprowadziła do porównywalnego poziomu chlordektiolu F1 (Tabela 1). Ślady TP B1 zaobserwowano również we wszystkich eksperymentach, w tym w kontroli pozytywnej Na2S (Tabela 1).

drugi zestaw eksperymentów został zaprojektowany z wykorzystaniem Na2S jako środka redukującego i alternatywnych akceptorów elektronów na bazie siarki w zamkniętych fiolkach(Tabela 2). Zastosowanie siarczanu nieorganicznego wzbogaconego w 90% 34S spowodowało, że produkt chlordektiolu wykazywał podobny poziom wzbogacenia 34S (90% 34s-F1/10% F1, Fig. S16). Analiza GC-MS w przestrzeni nadproża wykazała również obecność H234S i H3c34sh (Fig. S16), wykazując tym samym, że Desulfovbibrio Sp.86 wytwarza H2S z siarczanu. Gaz ten wykryto w przestrzeni nad głową hodowli w Warunkach CA, przy użyciu czynnika MMD, podczas gdy nie było go w przestrzeni nad głową hodowli w Warunkach RA, które odpowiadały atmosferze schowka (rys. S17). Brak siarczanu nie hamował działania leku Desulfovibrio sp.Wzrost, jednak spowodował powstanie B1 (Tabela 2)5. Remplacement siarczanu przez siarczyn, wodorosiarczyn lub tiosiarczan prowadził we wszystkich przypadkach do powstania chlordektiolu F1.

trzecia seria eksperymentów z użyciem słoików badała wpływ natury fazy gazowej w kontakcie z kulturą. Pomiędzy stanem RA przy użyciu otwartych fiolek w schowku a stanem CA przy użyciu zamkniętych fiolek w piecu, różniło się kilka parametrów (charakter i objętość atmosfery, temperatura). Wykorzystując system słoików zawierający kilka fiolek, selektywnie badamy wpływ odnowy atmosfery na transformację chlordekonu przez Desulfovibrio Sp.86 w MMD medium. W każdym przypadku otwarte fiolki z hydrofobowymi porowatymi filmami umieszczano w słoikach wstępnie oczyszczonych wybranym gazem. Wszystkie słoiki inkubowano w temperaturze 30 °C. Niektóre z nich były kilkakrotnie przepłukiwane, aby naśladować system schowka, podczas gdy inne były zamknięte.

słoiki 1-4 zawierały dwie identyczne otwarte fiolki wypełnione MMD, chlordekonem i Desulfovibrio Sp.86 inokulum i jedna negatywna Kontrola abiotyczna. Wśród nich dwa słoiki płukano dwa razy w tygodniu, słoik 1 z (N2/H2 (98/2; V / V)), słoik 2 z N2 (rys. 4A), natomiast słoiki 3 i 4, wstępnie oczyszczone N2 i (N2 / H2 (98/2; V / V)) pozostawiono odpowiednio nie przepuszczone (rys. 4B).

Schematyczne przedstawienie eksperymentów kontrolowanych gazem. a) słoiki płukane, b) słoiki nie płukane, c) słoiki bez siarczanu Desulfovibrio Sp.86 kultur.

dwa ostatnie słoiki (słoik 5 i 6) zawierały trzy otwarte fiolki wypełnione MMD, chlordekonem i Desulfovibrio Sp.86, plus jedna kultura bez siarczanu. Słoiki te były początkowo przepłukiwane (N2/H2 (98/2; V / V)) i pozostawione bez przelewu przez 2 miesiące (rys. 4c).

równolegle do słoików, dwie zamknięte fiolki wypełnione MMD bez siarczanu, chlordekonu i Desulfovibrio Sp.86 przepłukano z czasem zsyntetyzowanym H2S (rys. S4).

po dwumiesięcznej inkubacji w temperaturze 30 °C, TP B1 wykryto w fiolkach umieszczonych w wypłukanych słoikach 1 i 2 (Tabela 3a), podczas gdy TP F1 stwierdzono tylko w fiolkach umieszczonych w niezamrożonych słoikach 3 i 4 (Tabela 3b). W kontrolach abiotycznych nie stwierdzono obecności TP. W słoikach 5 i 6 F1 był obecny zarówno w Bezsiarczanowym, jak i bezsiarczanowym Desulfovibrio Sp.86 kultur otwartych (tabela 3c). W ten sam sposób Desulfovibrio Sp.86 hodowli wolnych od siarczanów, przepłukanych H2S, wykazało znaczące poziomy TP F1, podczas gdy nie zaobserwowano transformacji w kontroli negatywnej (tabela 3d).

przeprowadzono dodatkowy eksperyment chemiczny w celu oceny wpływu H2S na transformację chlordekonu. Zastosowano klasyczny protokół chemiczny umożliwiający tworzenie TPs B I C (chlordekon, cytrynian tytanu, witamina B12, woda). W atmosferze N2 uzyskano B I C TPs, jednak w atmosferze H2S wyprodukowano tylko A1 (rys. S18).

wyniki te wyraźnie pokazują, że tworzenie chlordektiolu F1 wymaga zamkniętego systemu inkubacji z atmosferą redukcyjną. H2 jako początkowa atmosfera gazowa nie jest jednak obowiązkowa, podczas gdy obecność H2S jest wymagana. Chemicznie obecność H2S zapobiega procesowi dechlorowania otwieranego pierścienia.

znaczenie dla środowiska redukcyjnego siarczkowania chlordekonu

ponownie zbadaliśmy naszą poprzednią kolekcję próbek środowiskowych zanieczyszczonych chlordekonem Z Wyspy Martynika (osiem gleb i dwa osady złożowe), w których zgłoszono różne poziomy TPs chlordekonu6. Wśród zgłoszonych tu nowych TPs zawierających siarkę znaleźliśmy znaczące poziomy F1 w próbkach osadów z dwoma złożami (927 i 928) przy stężeniu szacowanym odpowiednio na około 50 µg/kg i 20 µg/kg mokrego osadu (tabela S1). Równolegle, dane o różnorodności populacji bakterii wydane z analizy metabarcoding tych próbek (rys. 5, rys. S5) zostały przetworzone w celu odzyskania hierarchicznego klastrowania próbek środowiskowych zgodnie z ich składem taksonomicznym6. Zauważono, że bakterie redukujące siarczany były znacznie bardziej obecne w osadach złożowych niż w innych przedziałach,jak wcześniej informowano 30,31, 32.

Dendrogram generowany z hierarchicznego grupowania próbek środowiskowych w zależności od różnorodności populacji bakterii (z pakietu r pvclust V. 1.3-2, https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btl117). 200 000 sekwencji pobrano dla każdej próbki środowiska i znormalizowano. Odsetek wykrytych bakterii phyla przedstawiono tutaj, koncentrując się na bakteriach redukujących siarczany z klasy Deltaproteobacteria, Firmicutes i Nitrospirae phyla. Na Czerwono jest reprezentowana bezstronna (au) wartość p, a na Zielono wartość prawdopodobieństwa bootstrap (bp). SRB = bakterie redukujące siarczany.