wstrzykiwalne ludzkie rekombinowane matryce kolagenowe ograniczają niepożądaną przebudowę i poprawiają czynność serca po zawale mięśnia sercowego

projekt badania

tutaj przeprowadziliśmy badanie mające na celu (i) zaprojektowanie klinicznie istotnych hydrożeli kolagenowych przy użyciu rekombinowanych ludzkich kolagenów typu I i typu III; (ii) scharakteryzować i porównać właściwości fizyczne materiałów rHCI i rHCIII; (iii) ocenić potencjał terapeutyczny materiałów do leczenia MI u myszy; oraz (iv) zidentyfikować mechanizmy leżące u podstaw zaobserwowanych efektów terapeutycznych leczenia rHC. Do eksperymentów in vivo, podwiązanie tętnicy lad u myszy wybrano jako klinicznie istotny i ugruntowany model zwierzęcy zawału mięśnia sercowego. Dla oceny funkcjonalnej, histologicznej i molekularnej liczbę zwierząt na Grupę zminimalizowano do trzech do piętnastu myszy, jak określono na rysunku. Myszy losowo przydzielano do grup leczonych, a wszystkie analizy prowadzono w sposób zaślepiony.

przygotowanie i charakterystyka matryc rHC

otrzymano 1% roztwór kolagenu przez rozpuszczenie 0,1 g liofilizowanego kolagenu (rHCI i rHCIII, z Fibrogenu) w 10 ml ultra czystego ddh2o. siarczan chondroityny (CS; Wako), N-etylo-N-(3-dimetyloaminopropylo) karbodiimidu (EDC) i N-hydroksysukcynimidu (NHS) dodano w celu uzyskania ostatecznej mieszaniny o stosunku masy 1:4:0,5:0,3 dla kolagenu:CS:NHS:EDC. Materiały przygotowano na lodzie przy użyciu zamkniętego systemu, który umożliwia jednorodne mieszanie bez dodawania pęcherzyków. Po dokładnym wymieszaniu pH dostosowano do 7.4 przez NaOH (1.0 N). Podobnie przygotowano matryce bez CS, ale z dodatkiem PBS w celu skompensowania objętości CS. Matryce znakowane Alexa-Fluor ® 594-NHS przygotowano przez dodanie 20 µL roztworu podstawowego barwnika (1 mg/mL w DMSO) do żeli przed dodaniem NaOH (25 nmol barwnika na hydrożel), a następnie 20 etapów mieszania.

lepkość materiału

pomiary lepkości przeprowadzono przy użyciu Reometru Brookfield R/S plus (Brookfield) w temperaturze 37 °C. do ściśnięcia materiału (przemieszczenie 50 µm) na cokole o kontrolowanej temperaturze użyto stożkowego wrzeciona C25–2/30. Lepkość mierzono za pomocą bloku obrotowego rampy z prędkością 1/min jednostek wstępnie ustawionych z szybkością ścinania 5 jednostek w czasie 30 min.

stopień usieciowania

przeprowadzono eksperymenty z różnicową kalorymetrią skaningową (DSC) w celu oceny stopnia usieciowania. Krótko mówiąc, pomiary przeprowadzono w różnicowym kalorymetrze skaningowym Q2000 (TA Instruments) w zakresie od 8 do 80 °c z szybkością skanowania 5 °C min−1. Matryce kolagenowe (5-20 mg) suszono powierzchniowo papierem filtracyjnym i hermetycznie zamykano aluminiową pokrywką (Tzero; Instrumenty TA) w aluminiowej patelni próbnej (Tzero; Instrumenty TA). Temperaturę denaturacji (TD) mierzono na początku szczytu endotermicznego.

zawartość wody

zawartość wody w materiałach mierzono przez ważenie mokrej masy (W0) próbki, równoważonej w PBS przez 96 h w temperaturze 4 °C. Następnie materiał suszy się próżniowo w temperaturze pokojowej przez 96 h W celu uzyskania suchej masy (W). Następnie obliczono całkowitą zawartość wody w hydrożelach (Wt) według równania:

degradację

degradację enzymatyczną mierzono przy użyciu 50-100 mg hydrożelu umieszczonego w 5 ml kolagenazy typu i (10 U/ml w PBS) w temperaturze 37 °C. pozostałą masę ciała stałego mierzono przez okres do 24 godzin. szybkość degradacji oblicza się na podstawie początkowego nachylenia Wykresów pozostałej masy w stosunku do czasu i podaje się jako mg/min.

porowatość materiału

pomiary niskotemperaturowego skaningowego mikroskopu elektronowego (Cryo-sem) przeprowadzono w temperaturze -50 °C przy użyciu Tescan (Model: Vega II-XMU) wyposażonego w uchwyt na próbki w zimnym etapie, detektor elektronów rozproszenia wstecznego (BSE) i wtórny detektor elektronów (SE). Wielkości porów mierzono od co najmniej 250 pojedynczych od 4 do 6 przypadkowych obszarów próbki za pomocą oprogramowania ImageJ®. Średnicę porów oznaczono za pomocą osi wzdłużnej porów za pomocą narzędzia linii prostej. Obszar obrazu został dopasowany do paska skali wielkości uzyskanego z systemu Tescan Vega II65.

doświadczenia na zwierzętach

wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez Komitet Opieki nad zwierzętami Uniwersytetu w Ottawie i przeprowadzone zgodnie z przewodnikiem Narodowego Instytutu Zdrowia dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych.

model MI

MI indukowano u 9-tygodniowej samicy myszy C57BL/6 (Charles River; liczba myszy/grupy jest na rysunku legend) i podawanie leczenia przeprowadzono przy użyciu ustalonego protokolu26,27. Myszy znieczulono (2% izofluranu), intubowano, a serce odsłonięto za pomocą czwartej torakotomii międzyżebrowej. Lewa przednia zstępująca tętnica wieńcowa (LAD) została następnie podwiązana tuż poniżej jej wylotu z lewego przedsionka. Zabieg ten powoduje duże MI obejmujące przednio -, tylną i wierzchołkową część serca, co zostało potwierdzone w czasie operacji przez blanszowanie mięśnia sercowego w regionie dostarczonym przez tętnicę. Krótko działającą buprenorfinę podawano co najmniej godzinę przed zabiegiem, a długo działającą buprenorfinę podawano podskórnie bezpośrednio przed zabiegiem w celu znieczulenia okołooperacyjnego. W 1 tygodniu po zawale mięśnia sercowego (wartość wyjściowa), myszy losowo przydzielano do leczenia matryc PBS (control), rHCI lub rHCIII, podawanych w pięciu równomiernych iniekcjach śródmiokardialnych (10 µl w każde miejsce, łącznie 50 µl) za pomocą igły 27 G, z zastosowaniem procedury zamkniętej klatki piersiowej prowadzonej ultradźwiękami. Strzykawkę zabezpiecza się w mikromanipulatorze (VisualSonics), a przed wykonaniem wstrzyknięcia zarówno igła, jak i sonda głowicy skanującej RMV są ustawione wzdłuż długiej osi serca. Za pomocą pola widzenia ultradźwiękowego mikromanipulator służy do Ustawienia końcówki igły w żądanym miejscu w obrębie mięśnia sercowego w celu dostarczenia zastrzyków(patrz dodatkowe rys. 1 i dodatkowe Wideo 1). Myszy zabijano w znieczuleniu terminalnym w 2 dni lub 4 tygodnie po leczeniu, a serca pobierano do badań histologicznych i/lub pomiarów właściwości mechanicznych.

echokardiografia

echokardiografia Transthoraciczna została wykonana na widokach o długich osiach przy użyciu systemu Vevo770 w trybie B z sondą microvisualization scanhead serii 707b (VisualSonics). Obrazowanie wykonano przed rozpoczęciem leczenia (7 dni po zawale mięśnia sercowego) i po 28 dniach po wstrzyknięciu w celu określenia frakcji wyrzutowej lewej komory (LVEF), zmiany obszaru ułamkowego (FAC), końcowej objętości skurczowej (ESV), końcowej objętości rozkurczowej (EDV), objętości udaru i pojemności minutowej serca. Należy zauważyć, że LVEF, ESV i EDV są stosowane jako kliniczne predyktory HF i przeżycia po MI44.

obrazowanie Ex vivo matrycy znakowanej Alexa-Fluor®594

chemicznie oznakowane matryce rHC (25 nmol barwnika na hydrożel) wstrzyknięto do zawału serca myszy, jak opisano powyżej. Zwierzęta uśmiercano w ciągu 2 godzin, 2 dni i 7 dni po leczeniu, a serca zebrano i zobrazowano ex vivo za pomocą spektrum IVIS® (PerkinElmer) w celu zobrazowania rozkładu rHCI i rHCIII w sercach (λexcitation: 570 nm; λemission: 640 nm). Na potrzeby histologii, sekcje tkanek przygotowano w acetonie, a następnie barwiono DAPI, a następnie obrazowano za pomocą skanera slajdów Leica Aperio Versa o końcowym powiększeniu ×20 i stosu Z ośmioma krokami przy 1,5 µm.

analiza szczepu

echokardiografia Przezustoraciczna została wykonana na widokach o długich osiach przy użyciu systemu Vevo3100 w trybie B z sondą microvisualization scanhead serii MX400 w czasie rzeczywistym (VisualSonics). Obrazowanie wykonano przed rozpoczęciem leczenia (7 dni po zawale mięśnia sercowego) i po 2 dniach po wstrzyknięciu w celu określenia podłużnego napięcia wsierdzia w momencie zamknięcia zastawki aortalnej (reprezentującego końcowy skurcz). Szczep w segmencie 5 (przedni środkowy segment), odpowiadający obszarowi strefy granicznej docelowemu do iniekcji terapeutycznej, analizowano za pomocą aplikacji Vevostrain oprogramowania VEVO LAB 3.1.1 (VisualSonics)41. Reprezentatywne przykłady przeprowadzonych pomiarów przedstawiono na Rys. uzupełniającym. 10 dla wszystkich grup doświadczalnych plus zdrowe (niezakłócone) zwierzę.

Elektrokardiografia

Elektrokardiografia była wykonywana jednocześnie z echokardiografią przy użyciu systemu Vevo3100 (VisualSonics) przed rozpoczęciem leczenia (7 dni po zawale mięśnia sercowego) i po 2 dniach po wstrzyknięciu. Elektrokardiogramy zostały wyeksportowane z VEVO LAB 3.1.1. oprogramowanie (wizualizacje). Długość odstępów PR, QT i QRS określono za pomocą oprogramowania ImageJ (dodatkowa Tabela 1).

właściwości mechaniczne mięśnia sercowego

myszy uśmiercano przez końcowe znieczulenie w 2 lub 28 dni po zabiegu, a serca zebrano. Wycięto prostokątne kawałki (2,5 × 5 mm) lewej komory zawierające bliznę i strefę graniczną. W celu określenia sprężystości na rozciąganie tkanki (moduł Younga) próbki poddano badaniom mechanicznym w mechanicznym uniwersalnym testerze Instron (Model 3342, Instron) wyposażonym w oprogramowanie serii IX/s, przy użyciu prędkości poprzecznej 10 mm min−1.

Histologia/Immunohistochemia

z podgrupy serc przygotowano szkiełka sekcji tkanki mięśnia sercowego, które nie były wykorzystywane do pomiarów właściwości mechanicznych. Po 28 dniach od wstrzyknięcia serca zbierano, perfuzowano PBS, osadzono w OCT i zamroziono w ciekłym azocie. Odcinki 10 µm wycinano za pomocą kriostatu. W celu oceny wielkości blizn, fragmenty tkanek zostały ustalone w 4% PFA przez 1 godzinę i zabarwione metodą trichromu Massona (Sigma). Zdjęcia wykonane za pomocą mikroskopu Olympus BX50 z użyciem obiektywu 2 × i ośmiu sekcji na mysz zostały wykorzystane do pomiaru grubości ścianek i określenia wielkości blizn metodą łuku środkowego za pomocą oprogramowania Miquant66. W przypadku immunohistochemii, fragmenty tkanek utrwalano w acetonie przez 20 minut, przenikano 0,1% Tritonem przez 10 minut, a następnie blokowano w 10% surowicy przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Pierwotne przeciwciała nanoszono przez noc w temperaturze 4 °C w 10% surowicy, a następnie szkiełka płukano i traktowano przeciwciałami wtórnymi przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, a następnie montowano za pomocą fluorescencyjnego podłoża montażowego (DAKO). Do wykrywania naczyń krwionośnych i miofibroblastów, PECAM – 1 (znany również jako CD31; Santa Cruz 101454, 1:50) i α-SMA (Abcam 5694, 1:200) przeciwciała zostały użyte i wykryte odpowiednio dla AF594 przeciw szczurom (Life Technologies A11008, 1:500) i AF488 przeciw królikom (Life Technologies A11007, 1:500). Makrofagi M2 wykryto przez sprzężone z AF488 przeciwciało anty-CD206 (Biolegend 141710, 1: 50). W przypadku barwienia troponiny serca i, sekcje inkubowano z aglutyniną z zarodków pszenicy znakowanej AF488 (ThermoFisher, W11261) przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C, a następnie inkubowano z pierwotnym przeciwciałem troponiny serca koziego i (Abcam ab56357, 1:200) i wykryto przez przeciwciało wtórne przeciw koziemu af594 (Life Technologies a-11058, 1: 500). Na koniec, dla barwienia connexin 43, sekcje inkubowano z przeciwciałami pierwotnymi connexin 43/GJA1 (Abcam ab11370, 1:400) i troponiną sercową I (abcam ab188877, 1:200), a następnie wykrywano przeciwciałami wtórnymi AF488 przeciw królikowi (Life Technologies a11007, 1:500) i przeciwciałami wtórnymi af594 przeciw kozie (Life Technologies a-11058, 1:500). Fluorescencyjne obrazy uzyskano za pomocą mikroskopu obserwacyjnego Zeiss Axio z obiektywem ×20, A Dla sekcji barwionych connexin 43 zastosowano skaner slajdów Leica Aperio Versa z obiektywem 20×. Dla wszystkich plam IHC analizowano cztery sekcje na mysz, a dla każdej sekcji 2-4 obrazy w strefie przygranicznej, do analizy użyto obszarów zawału i odległych. W przypadku barwienia H&E, fragmenty tkanek zamocowano w 10% formalinie. Sekcje barwiono najpierw w roztworze nr 2 hematoksyliny Gilla przez 7 min, następnie różnicowano alkohol kwaśny, a następnie 0,5% eozyny przez 7 min, a następnie odwodniono (wszystkie roztwory z Sigma). Zdjęcia wykonano mikroskopem Olympus BX50. Strefa przygraniczna została wyznaczona jako FOV bezpośrednio przylegająca do obu stron obszaru zawału, który rozpoczyna się, gdy 50% LV stanowi tkanka włóknista blizny (patrz dodatkowe rys. 11 dla schematycznego przedstawienia).

eksperymenty na myszach Cx3cr1-EGFP

w celu oceny rekrutacji krążących komórek jednojądrzastych do mięśnia sercowego po leczeniu rHC, myszy B6.129p-cx3cr1 tm1litt/J (cx3cr1-EGFP) zakupiono w laboratorium Jacksona. Myszy te wyrażają wzmocnione zielone białko fluorescencyjne w monocytach, komórkach dendrytycznych, komórkach NK i mikrogleju mózgu i są modelem zgłoszonym do badania rekrutacji komórek jednojądrzastych do serca67. W 1 tygodniu po zawale mięśnia sercowego myszy otrzymywały 50 µl PBS, rHCI lub rHCIII, jak opisano powyżej. Zwierzęta zabijano 2 dni po leczeniu, a krew pobierano do rurek EDTA. Ponadto, serca były perfuzowane z PBS i prawej komory i regionu wierzchołkowego lewej komory zebrano. Tkanki płukano HBSS i trawiono w 2.4U/ml dispase I (Roche) i 1 mg/ml Collagenase B (Roche) przez 40 minut w temperaturze 37 °C. próbki przemywano trzykrotnie PBS, odwirowywano przez 5 minut w temperaturze 400 g, a wyizolowane komórki przygotowywano do cytometrii przepływowej (FACS Aria III; Becton Dickinson). Komórki zostały oznaczone APC anti-mouse/human CD11b (Biolegend 101211), PE anti-mouse Ly-6g/6C (Biolegend 108407), PE/Cy5 anti-mouse F4/80 (Biolegend 123111), PE/Cy7 anti-mouse CD38 (Biolegend 102717) i Alexa Fluor® 700 anti-mouse CD206 (Biolegend 141733), po rozcieńczeniach zalecanych przez producenta (0.25 µg/l na 1 × 106 komórek dla CD11b, Ly-6g/6C, CD38 i CD206 oraz 1 µg/l na 1 × 106 komórek dla F4/80). Zob.Dodatkowe Rys. 12 dla strategii sortowania / bramkowania.

izolacja komórek i cytometria przepływowa dla podgrup monocytów

dwa dni po leczeniu myszy iniekcyjne zabito przez inhalację CO2, a następnie zwichnięcie szyjki macicy. Krew pobierano od myszy poprzez nakłucie serca w roztworze EDTA o średnicy 50 mM i RBC lizowano buforem do lizy krwinek czerwonych (RBC) zgodnie z protokołem producenta (Biolegend 420301). Komórki wyizolowano z zebranego serca myszy stosując bufor do trawienia zawierający: Dnazę i (50 U/µL; Sigma D5025), kolagenazę typu II (400 U/mL; ThermoFisher 17101015), kolagenazę d (0,15 U/mL; Sigma 11088866001) i hialuronidazę (10 U/mL; Sigma H3506). Po godzinnym trawieniu w temperaturze 37 °C, wyizolowane komórki serca przepuszczono przez filtr 70 µm. Na koniec zebraną mysią śledziony tłuczono i roztarto przez filtr 70 µm, a następnie inkubowano z buforem do lizy krwinek czerwonych (RBC). Granulki komórkowe zbierano przez odwirowanie w temperaturze 400 g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Wyizolowane komórki ze wszystkich tkanek inkubowano z utrwalającym się barwnikiem żywotności Zombie Aqua (1: 500, Biolegend 423101) przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Następnie receptory Fc blokowano odczynnikiem Trumain X (1: 100, Biolegend 103319) przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Następnie komórki inkubowano z koktajlem przeciwciałowym przez 45 minut w temperaturze pokojowej zawierającym CD45-APC/Fire 750 (1:160, Biolegend 30-F11), CD11b-PE/Cy7 (1:80, Biolegend M1/70), Ly6G-PerCP/Cy5.5 (1:160, Biolegend 1A8), CD3-PE (1:160, Biolegend 17a2), B220-af488 (1:50, biolegend RA3-6B2), F480-Af647 (1:100, BIOLEGEND BM8) i Ly6C-BV421 (1: 80, BD Biosciences AL-21). Cytometrię przepływową przeprowadzono za pomocą BD FACS Aria III, a dane analizowano za pomocą oprogramowania FlowJo V10.5. 2 (Patrz dodatkowe ryc. 12 dla strategii sortowania/bramkowania). Całkowitą żywotną liczbę komórek dla każdej tkanki po izolacji oznaczono metodą wykluczenia błękitu trypanu za pomocą hemocytometru. Całkowitą liczbę komórek w każdej populacji leukocytów oznaczono na podstawie odsetka żywych komórek dla danej populacji komórek, a całkowitą liczbę żywych komórek zliczono po izolacji, która następnie została znormalizowana do mg tkanki lub mL pobranej krwi. Strategia bramkowania: pojedyncze komórki były bramkowane w oparciu o FSC – a i FSC-H. żywe pojedyncze komórki były bramkowane na niskim barwieniu dla żywego/martwego barwnika Zombie Aqua. Z tej populacji żywych pojedynczych komórek leukocyty były CD45+. Podgrupy leukocytów charakteryzowano następująco: neutrofile CD45+Cd11b+Ly6G+, ly6c niskie monocyty CD45+CD11b+Ly6G−F480−Ly6C−, Ly6C wysokie monocyty CD45+CD11b+Ly6G−F480−Ly6C+, makrofagi CD45+CD11b+Ly6G−F480+, komórki T CD45+CD11b−Ly6G−CD3+B220− i komórki B CD45+cd11b−ly6g−CD3−B220+. Uwaga dla wyrażenia blood F480 nie została użyta w strategii bramkowania. Bramki ustawiono względem kontroli izotypu.

badania kardiomiocytów noworodka

miocyty komorowe noworodka szczura (Nrvm) zostały świeżo wyizolowane przy użyciu ustalonego protokolu68. Lewe Komory pobrane od 2-dniowych szczurów Sprague-Dawley (Harlan) były trawione przez trypsynę (Amersham Biosciences) i kolagenazę typu II (Worthington Biochemical). Wyizolowane komórki ponownie zawieszono w pożywce m-199 (Life Technologies) uzupełnionej 10% FBS, 19,4 mm glukozą, 2 mM l-glutaminą, 2 U/mL penicyliną, 0,8 µg/mL witaminą B12, 10 mM HEPES i 1 × MEM (Sigma-Aldrich). Przeprowadzono dwie rundy 60-minutowego wstępnego powlekania, podczas których fibroblasty serca przyczepiają się do dna naczynia, wzbogacając w ten sposób populację nienadającą się do RWS. Następnie nonadherentne komórki (Nrvm) były wysiewane do różnych matryc kolagenowych w 24-studzienkowych płytkach (40 000 komórek/cm2). Do testu przeżycia, 3-dniowe hodowlane Nrvm poddano mediom m-199 zawierającym 50 µM nadtlenku wodoru przez 3 godziny, po czym przeprowadzono test końcowego deoksynukleotydotransferazy dUTP Nick-End Labeling (TUNEL) i policzono martwe komórki w trzech losowych polach widzenia.

Kultury komórkowe

stosując ustalony protokół, makrofagi Pochodzące ze szpiku kostnego wyizolowano z 8-12-tygodniowego C57BL/6J mice69. Myszy uśmiercano przez inhalację CO2 i zwichnięcie szyjki macicy, a kości piszczelowe zebrano i przepłukano mediami w celu wyizolowania szpiku kostnego. Izolat szpiku kostnego był wielokrotnie pipetowany w celu uzyskania zawiesiny jednokomórkowej, która następnie była przepuszczana przez sitko komórkowe. Świeżo wyizolowane komórki hodowano przez 1 tydzień w DMEM uzupełnionym 10% FBS, 20% pożywkami uwarunkowanymi L929 i penicyliną-streptomycyną, a następnie ponownie platerowano hydrożelami rHC przez 3 dni. Komórki Pobrano z hydrożeli rHC przy użyciu 3 mM roztworu buforowego CaCl2 Hanka zawierającego 250 jednostek kolagenazy I (Gibco). Polaryzację makrofagów oceniano za pomocą cytometrii przepływowej (FACS Aria III; Becton Dickinson) przy użyciu CD86 i CD206 (Biolegend) w celu identyfikacji makrofagów M1 i M2, odpowiednio. W celu izolacji komórek jednojądrzastych pobrano szpik kostny z kości piszczelowych, jak opisano powyżej. Komórki jednojądrzaste oczyszczano przez odwirowanie gradientu gęstości przy użyciu Histopaque® (Sigma) zgodnie z instrukcjami producenta. Komórki oznaczono 0.5 µg / ml DAPI (Sigma) przez 30 minut w temperaturze 37 °C.

test adhezji makrofagów

komórki jednojądrzaste izolowano przez przepłukanie piszczeli i kości udowych myszy w wieku od 6 do 12 tygodni. Komórki oczyszczono przez odwirowanie gradientu gęstości przy użyciu Histopaque® (Sigma) zgodnie z instrukcjami producenta. Komórki jednojądrzaste liczono i znakowano DAPI. Komórki platerowano na różnych biomateriałach w stężeniu 50 000 komórek / cm2 przez 24 godziny. komórki utrwalano 4% PFA przez 5 minut i liczono komórki. Dane zostały wyrażone w stosunku do kontroli (odwierty niekryte, tj., TCPS), aby zminimalizować wpływ zmienności między dawcami komórek.

test migracji makrofagów

komórki jednojądrzaste szpiku kostnego hodowano w DMEM uzupełnionym 10% FBS, 20% pożywką uwarunkowaną L929 i Pen/Strep przez 7 dni w celu wytworzenia makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego (BMDMs) i znakowano DAPI, jak opisano powyżej. Bmdm (2 × 105) następnie ponownie zawieszono w EBM bez czynników wzrostu i surowicy i załadowano do górnej komory płytki Transwella (Life Technologies) pokrytej 100 µL rHCI lub rHCIII. Dolna komora zawierała pełne media makrofagowe, jak opisano powyżej. Po 24 godzinach wkładki usunięto, a liczbę Bmdm, które migrowały przez biomateriał, oznaczono ilościowo w sposób zaślepiony za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego Zeiss Z1. Dane wyrażono w stosunku do kontroli (bez powłoki studzienki, TCPS) w celu zminimalizowania wpływu zmienności między dawcami komórek.

test polaryzacji makrofagów

BMDMs uzyskano w DMEM uzupełnionym 10% FBS, 20% pożywką uwarunkowaną L929 i Pen/Strep przez 7 dni, jak opisano powyżej. W eksperymentach z aktywacją makrofagów komórki stymulowano przez 3 dni lipopolisacharydem (1 µg/ml; Sigma) plus IFN-γ (50 ng/ml; Sigma) do aktywacji M1 lub IL-4 (20 ng/ml; r&d) do aktywacji m2. Całkowity RNA ekstrahowano przy użyciu odczynnika Tri (Zymo Research), zgodnie z protokołem producenta. Pierwsza nić cDNA została zsyntetyzowana za pomocą odwrotnej transkryptazy Smartscribe (Takara bio USA) i starterów random hexamer (Fisher Scientific). Docelowe poziomy mRNA w genie oceniano za pomocą ilościowego RT-PCR za pomocą LightCycler 480 SYBR Green i Mastermix (Roche) i LightCycler 480 Real-Time PCR System (Roche). Sekwencje dla par starterów są wymienione w dodatkowej Tabeli 2. Względne zmiany ekspresji mRNA oznaczono metodą ∆∆Ct, wyrażoną jako poziomy w stosunku do 18S. dane wyrażono w stosunku do kontroli (bez powłok, TCPS)w celu zminimalizowania wpływu zmienności między dawcami komórek.

przeżywalność po ekspozycji na H2O2

komórki hodowano przez 7 dni w DMEM uzupełnionym 10% FBS, 20% pożywką uwarunkowaną L929 i Pen / Strep. W dniu 7 pożywkę zmieniono na dmem zawierającą 0,5 mM nadtlenek wodoru, a komórki hodowano przez 3 godziny, zanim zabarwiono 7-AAD w celu analizy za pomocą cytometrii przepływowej. Dane wyrażono w stosunku do kontroli (bez powłoki studzienki, TCPS) w celu zminimalizowania wpływu zmienności między dawcami komórek.

analiza statystyczna

analiza statystyczna została wykonana przy użyciu Kaleida Graph 4.5®. Wszystkie dane są przedstawione jako średnia ± SEM. W celu porównania danych in vivo między zabiegami zastosowano ANOVA, a następnie korektę Holma dla wielokrotnych porównań. Rozmiar blizny analizowano stosując wielokrotną regresję, w tym grupę leczoną (rHCI, rHCIII i PBS) i wyjściowy LVEF. rHCI i rHCIII w porównaniu z PBS były znaczącymi predyktorami wielkości zawału, oprócz wyjściowego LVEF. Współczynnik korelacji dla modelu wynosi 0,6 przy użyciu wielokrotnej regresji liniowej STATA. In vitro NRVM, makrofag i fibroblastów serca dane analizowano albo przez test t Studenta lub przez jednokierunkową ANOVA z korekcją Holma dla wielokrotnych porównań, jak określono w legendach rysunku.

podsumowanie sprawozdań

więcej informacji na temat projektu badawczego można znaleźć w podsumowaniu sprawozdań z badań przyrodniczych powiązanym z tym artykułem.