wykrywanie i identyfikacja metodą PCR Clostridium chauvoei w izolatach klinicznych, odchodach bydła i substratach z biogazowni

próbki z podejrzanych przypadków blackleg

w przypadku próbek mięśni z podejrzanych przypadków blackleg wyniki z hodowli na płytkach FAA, a następnie PCR z materiału Kolonii były zgodne lub wykonane jeszcze lepiej niż metoda identyfikacji biochemicznej (tabela 2). Wyniki te są zgodne z Uzal et al. . Badanie to wykazało, że przygotowanie DNA z hodowli przed PCR dawało lepsze wyniki niż PCR stosowane bezpośrednio na biomasie.

Hodowla poprzedzona biochemicznymi metodami identyfikacji jest skomplikowana w próbkach o wysokiej zawartości flory zanieczyszczającej ze względu na zapotrzebowanie na czystą hodowlę, a czułość była znacznie niższa niż w przypadku hodowli i PCR. W ośmiu przypadkach niemożliwe było wykrycie C. chauvoei przez kulturę i identyfikację biochemiczną, ale organizm został wykryty przez PCR (Tabela 2). W celu postawienia diagnozy blackleg, tkanka mięśniowa jest pobierana podczas autopsji, ponieważ ilość C. chauvoei prawdopodobnie jest wyższa w tkance mięśniowej niż we krwi. Pojedyncza próbka krwi została nieprawidłowo pobrana, ale pytanie było czarne.

podobnie, w poprzednim badaniu wybuchu blackleg, Kultura i wykrywanie przez PCR dały lepsze wyniki niż analiza biochemiczna . W jednym z przypadków pierwotna hodowla jednego mięśnia na płytce agarowej krwi została Zarośnięta przez C. septicum, ale dała wyraźne pozytywne wyniki dla C. chauvoei w PCR.

w większości przypadków klinicznych blackleg ilość C. chauvoei w zakażonej tkance jest wysoki i może być łatwo wykryty metodą PCR niezależnie od zanieczyszczającej flory. Co więcej, metoda PCR jest znacznie szybsza niż tradycyjna biochemiczna metoda wykrywania, która zajmuje co najmniej pięć dni, i ważne jest, aby mieć czystą kulturę szczepu, która może wymagać dodatkowego czasu na hodowlę. Aby uniknąć zanieczyszczenia flory, tkanka mięśniowa nie powinna być zbyt mała; około 100-200 g byłoby wystarczające. Bez czystej kultury żadne szczepy nie mogą być wykorzystywane do dalszych badań w przyszłości, co jest wadą stosowania detekcji PCR jako jedynej metody.

u bydła doświadczalnie zakażonego C. chauvoei przeprowadzono analizy PCR na zmielonych mięśniach i innych narządach, A C. chauvoei wykryto we wszystkich badanych narządach . Mielone kawałki mięśni z podejrzanych przypadków blackleg były bezpośrednio testowane przez PCR i porównywane z hodowlą. Wykrywanie metodą PCR dało lepsze wyniki niż identyfikacja kulturowa i biochemiczna, co jest sprzeczne z wynikami niniejszego badania, w którym tylko 12% (3 z 24) kawałków krwi lub mięśni było powyżej progu wykrywalności PCR, podczas gdy 9% próbek soku mięsnego było powyżej progu wykrywalności (Tabela 2). Substancje hamujące są prawdopodobnie obecne w tkankach mięśniowych. Inhibitory reakcji enzymatycznej amplifikacji PCR zidentyfikowano w wątrobie, śledzionie i nerkach i mogą być podobne inhibitory obecne w tkance mięśniowej. Wyniki z kawałków mięśni macerowanych w sterylnych próbkach soli fizjologicznej (26%) nie odpowiadały dobrze testowi biochemicznemu. Bezpośrednie PCR na tkance mięśniowej lub innych podobnych próbkach prawdopodobnie nie nadaje się do zastąpienia etapów hodowli, po których następują testy biochemiczne lub PCR.

próbki mięśni pobrane przez wymazy

w celu zbadania, czy konieczne jest wysłanie tkanki mięśniowej do analizy C. chauvoei, czy też wystarczające jest użycie wymazów do pobrania próbki, symulowano usługę pocztową. Spośród 22 badanych tkanek mięśniowych 64% było powyżej progu wykrywalności PCR. W przypadku wymazów z tych samych próbek po symulacji usługi pocztowej od 36% do 47% wymazów przekroczyło próg wykrywalności(Tabela 3). Bardziej praktyczne byłoby pobieranie próbek z wymazami zamiast tkanek mięśniowych, jeśli wymazy są wystarczające do analizy C. chauvoei. Jednak tkanki mięśniowe dały więcej pozytywnych próbek niż wymazy, gdy oba analizowano za pomocą hodowli i PCR(Tabela 3). Częstość występowania C. chauvoei na wymazach z dodatnich przypadków tkanki mięśniowej wydawała się być przypadkowa. Okazało się jednak, że nie ma różnicy, czy wymazy były przechowywane przez 1, 3 lub 6 dni.

próbki z biogazowni

Clostridium chauvoei wykryto w 3 próbkach z 11 w substratach biogazu przed pasteryzacją, ale nie można było go wykryć po pasteryzacji lub po trawieniu (Tabela 4). Bakterie w tego rodzaju próbkach mogą pochodzić z obornika lub produktów ubocznych pochodzenia zwierzęcego z ubojni, ponieważ oba te źródła są wykorzystywane do produkcji biogazu. Żadne z gospodarstw objętych badaniem nie wysyła obornika do biogazowni ze względu na odległość geograficzną, ale zwierzęta są wysyłane do lokalnej rzeźni. Odnotowano również przypadki występowania blackleg w zlewni biogazowni.

po przetworzeniu biogazu trawione pozostałości są wykorzystywane jako nawóz. Bakterie tworzące zarodniki mogą przetrwać pasteryzację i trawienie w biogazowniach, a trawione pozostałości z biogazowni mogą być zatem zdolne do rozprzestrzeniania się czarnej nory na nowe obszary. Jednak nie C. chauvoei wykryto w produkcie przetworzonym, więc być może środowisko w komorze fermentacyjnej nie jest odpowiednie dla C. chauvoei lub flora w komorze fermentacyjnej przerasta C. chauvoei. Zarodniki Clostridial mogą przetrwać w glebie przez długi czas , co należy wziąć pod uwagę w dalszych badaniach nad C. chauvoei w komorze fermentacyjnej.

próbki z gospodarstw

pomimo faktu, że wszystkie badane gospodarstwa zgłaszały w ostatnich latach podejrzane przypadki występowania blackleg, wszystkie próbki odchodów, gleby i kiszonki były ujemne na obecność C. chauvoei. Może być na to kilka wyjaśnień. Zarodniki mogą nadal być obecne w materiale, ale poniżej poziomu wykrywalności. Ponadto inhibitory PCR mogą być obecne w próbkach i PCR może być utrudnione . Odchody bydła zawierają lotne kwasy tłuszczowe (VFA), a próbki gleby mogą zawierać śladowe ilości metalu, o których wiadomo, że zakłócają reakcję PCR. Jednak etap hodowli przed PCR zmniejsza wpływ substancji hamujących.

Od C. chauvoei jest bakterią glebową mogą wystąpić pewne zmiany sezonowe, na przykład intensywne opady deszczu mogą przyczynić się do rozprzestrzeniania się zarodników, a ilość zarodników w glebie może być bardziej dostępna dla bydła. Większość próbek przeprowadzono wczesną jesienią, gdy pogoda była słoneczna, a zatem stężenie zarodników w próbkach powinno być niskie. Liczba próbek mogła być niewystarczająca do wykrycia zanieczyszczenia środowiska. Jednak ze względów praktycznych bardzo duża liczba próbek środowiskowych jest rzadko dostępna w terenie.

podejrzewane przypadki blackleg w gospodarstwach występowały głównie u cieląt i jałówek, ale jedno gospodarstwo zgłosiło przypadek u dorosłej krowy. Siedem z jedenastu gospodarstw A-K miało procedury szczepień w czasie pobierania próbek (Tabela 1).

dwa gospodarstwa składowały obornik przed rozsiewaniem, a pozostałe nie, ale żadne z gospodarstw nie rozsiewało obornika na pastwiskach. Miejscowi lekarze weterynarii zaobserwowali podobno więcej przypadków blackleg po polanie krzewów na wyspie Olandii, zwłaszcza na Alvaret (jałowa Równina wapienna, prawie 40 km długości i 10 km szerokości, ze specjalną florą w zależności od cienkiej gleby i wysokiego pH). Alvaret jest zwykle wykorzystywany jako pastwisko przez sąsiednie gospodarstwa. W roku pobierania próbek nie przeprowadzono zbyt wielu wycinek krzewów.

PCR

procedury kulturowe są kosztowne i czasochłonne, a zanieczyszczenie innymi bakteriami beztlenowymi, które wyrastają z C. chauvoei, często powoduje problemy . Podczas stosowania PCR DNA zarówno żywotnych, jak i nieżywotnych komórek ulega amplifikacji. W przypadku wykrycia tylko żywych komórek można zastosować etap wzbogacania . W tym badaniu zastosowano hodowlę na płytkach FAA przed PCR w celu uniknięcia wykrycia nieżywotnych bakterii i fałszywie dodatnich reakcji PCR. DNA jest łatwe do wzmocnienia z czystych kultur, ale problemy pojawiają się z zanieczyszczonych próbek, takich jak próbki z bioodpadów. Wykrywanie DNA przez PCR może być utrudnione przez liczne substancje, w tym kwasy humusowe, VFA, tłuszcze i białka . Jednak etap hodowli przed PCR był stosowany jako etap wzbogacania, a zatem zmniejsza wpływ substancji hamujących. Ze względu na rojącą się florę, nie można było dokonać oczyszczenia z płyt FAA.

próg wykrywalności metody PCR

poziom wykrywalności wynosił 200 jtk/g. może się to wydawać słabym poziomem wykrywalności, ale można to wytłumaczyć faktem, że próbki takie jak obornik, gleba i podłoże biogazowe są silnie zanieczyszczone otaczającą florą. Sasaki zgłosił poziom detekcji 10 jtk/g, najwyraźniej w czystszych próbkach. Jednakże, ponieważ poziom detekcji w naszym badaniu wynosił 200 cfu/g i ponieważ spodziewano się, że takie próbki zawierają Niską liczbę C. chauvoei. W związku z tym metoda zastosowana w niniejszym badaniu nie ma praktycznie zastosowania.

aspekty środowiskowe

próg wykrywalności metody PCR po okresie prekultury nie jest na obecnym etapie odpowiedni do zagwarantowania, że zwierzęta są wolne od infekcji lub do określenia statusu pastwisk. Zamiast tego należy stosować obecnie stosowane zalecenia, ponieważ metoda ta nie może być stosowana jako podstawa procedur szczepień. Na obszarach, gdzie czarna Lega jest endemiczna, zaleca się coroczne szczepienia przed wypasem, pomimo kosztów i wymaganego czasu.

badanie to dało pewne wskazówki, że C. chauvoei nie przechodzi przez proces biogazu. Liczba C. chauvoei w bioodpadach prawdopodobnie zmniejszyła się w komorze fermentacyjnej do poziomu poniżej progu wykrywalności metody, a zatem ryzyko rozprzestrzeniania się trawionych pozostałości jest znikome. Przed wyciągnięciem jednoznacznych wniosków potrzebne są dalsze badania na temat przetrwania clostridial w procesie biogazu. Jednak zalety trawionych pozostałości jako nawozu być może przewyższają ryzyko rozprzestrzeniania się blackleg.