zmniejszanie makrofagów przez liposomy zawierające Klodronian zmniejsza tworzenie się Neointymalne po urazie balonu u szczurów i królików

komórki zapalne odgrywają główną rolę w naprawie naczyń, zrekrutowane natychmiast po urazie.1,2 nacieki makrofagów w tkance aterektomii i stan aktywacji monocytów we krwi korelują ze zwiększonym tempem restenozy.3,4 wpływ makrofagów w restenozie prawdopodobnie jest spowodowany ich zdolnością do ekspresji licznych czynników wzrostu, cytokin i enzymów, które przyczyniają się do rozwoju restenozy.5 w związku z tym postawiono hipotezę, że systemowa inaktywacja monocytów i makrofagów może prowadzić do osłabienia tworzenia neointimalnego i że makrofagi odgrywają kluczową rolę w patogenezie restenozy.

zmniejszenie makrofagów można osiągnąć poprzez systemowe wstrzyknięcie liposomów zawierających klodronian.Klodronian należy do rodziny bisfosfonianów (BPs), leków poszukujących kości, które są silnymi inhibitorami osteoklastów. Podobnie jak inne BPs, klodronian ma słabą przepuszczalność błony komórkowej.7 liposomy są łatwo pobierane przez komórki układu siateczkowo-śródbłonkowego, w szczególności makrofagi. Dostarczanie klodronianu za pośrednictwem liposomów inaktywuje i zabija makrofagi po skutecznej fagocytozie8, ale nie jest toksyczne dla komórek niefagocytarnych.6

metody

liposomy

Klodronian (Sifavitor) i rodamina RE (lipidy Polarne Avanti) zostały zamknięte w liposomach złożonych z 50 µmol/L distearoilo-fosfatydyloglicerolu (Dspg) (Avanti), 100 µmol/l cholesterolu (Sigma Chemicals) i 150 µmol/l 1,2-distearoilo-SN-glicero-3-Fosfocholina (Dspc) (Avanti) metodą odwróconego odparowania fazowego, jak opisano w innym miejscu.9 średnia wielkość liposomów wynosiła odpowiednio 190±18 nm, 24,5 mmol/l i 20 mmol/l, klodronianu i lipidów.

walidację aktywności biologicznej LC oznaczono na makrofagowych surowych komórkach 264. LC, ale nie wolny klodronian, znacząco zmniejszał liczbę i proliferację żywych komórek w sposób zależny od dawki i nie wpływał na żywotność i proliferację komórek mięśni gładkich (SMCs) lub komórek śródbłonka (EC) w stężeniach do 500 µmol/L (dane nie zostały przedstawione), zgodnie z opublikowanymi danymi.8,10

Królik Model

Nowa Zelandia białe króliki (Harlan Laboratories, Jerozolima, Izrael) o wadze 2,5 do 3.5 kg zostały wykorzystane zgodnie z wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami Uniwersytetu Hebrajskiego w Jerozolimie i National Institutes of Health (USA). Zwierzęta były karmione dietą miażdżycową 2% cholesterolu i 6% oleju arachidowego, począwszy od 30 dni przed angioplastyką. Stwierdzono hipercholesterolemię (stężenie cholesterolu w osoczu >1200 mg/dL). Zwierzęta znieczulono ksylazyną (7 mg/kg) i ketaminą (40 mg / kg). Podawano heparynę (200 J. / kg mc.), atropinę (0,05 mg) i nikotynian norfloksacyny (70 mg). Uraz balonowy wykonano na lewej tętnicy szyjnej wspólnej cewnikiem balonowym 3 mm angioplastyki (Cordis, inflacja 2×1 min przy 8 atm). Zwierzęta losowo przydzielano do dożylnych liposomów lub wolnego klodronianu (15 mg / kg), pustych liposomów lub buforu. Badacz zaślepiony typem grupy eksperymentalnej przeprowadził eksperymenty. Po eutanazji za pomocą pentotalu tętnice utrwalano perfuzją in situ 150 mL 4% roztworu Formaldehydu (pH 7.4), przetwarzane do analizy morfometrycznej i barwione barwieniem elastyny Verhoeffa, hematoksyliną Mayera i eozyną oraz zmodyfikowanym pentachromem Movat.

szczury Model

samce szczurów Sabra (Harlan Laboratories), ważące od 350 do 420 g. Model urazu szyjnego szczura wykonano zgodnie z opisem powyżej.W dniach -1 i +6 wstrzyknięto 11,12 Liposomalnego klodronianu (15 mg / kg). Organy zostały pobrane w dniu 14 i przetworzone w sposób opisany powyżej.

Analiza Morfometryczna

8 do 10 sekcji w każdym slajdzie analizowano za pomocą komputerowej analizy morfometrycznej (Obraz NIH) przez badacza zaślepionego do rodzaju grupy Doświadczalnej. Analizowano odcinek z największym zwężeniem luminalnym przez neointimę, jak opisano wcześniej.11 bezpośrednio mierzono pozostałość światła, obszar ograniczony wewnętrzną elastyczną laminą (pierwotne światło) i obszar ograniczony zewnętrzną elastyczną laminą (całkowity obszar tętniczy). Stopień neointimalnego zgrubienia wyrażono jako stosunek powierzchni neointima do pierwotnego światła (%zwężenia) oraz jako stosunek powierzchni neointimalnej do powierzchni mediów (N / M). Stopień przebudowy, zwężenia (ujemnego) i ekspansji (dodatniego) oraz współczynnika przebudowy (RR) oszacowano przez porównanie stosunku całkowitego obszaru tętniczego odcinka uszkodzonego balonem z sąsiadującym, nieuszkodzonym segmentem referencyjnym.

cytometria przepływowa

krew przeciwzakrzepową (200 µL) inkubowano przez 30 minut (4°C, w ciemności) z anty-CD14 sprzężonym z RPE mysim (DAKO). Roztwór lizy FACS (rozcieńczenie 1: 20) dodawano przez 15 minut. Pozostałe komórki przemyto (×1500 obr. / min, 5 minut, 4°c) w podłożu FACS (PBS, 1% BSA, 0,02% azydku sodu) i zawieszono w 1 mL pożywce FACS do cytometrii przepływowej. Monocyty identyfikowano według ich względnej wielkości, rozpraszania bocznego i fluorescencji.

Dystrybucja liposomów

królikom wstrzyknięto liposomy znakowane rodaminą (0,4 mg/kg) i LC lub bufor w dniu -1 i uśpiono w dniach +1 i +6. Monocyty krwi oddzielano za pomocą gradientu Ficolla (Sigma) i odwirowywano (1500 obr. / min, 5 minut). Pobrane tkanki płukano solą fizjologiczną; sekcje montowano na szkiełkach i obserwowano za pomocą mikroskopii konfokalnej (Zeiss LSM 410).

Immunohistochemia

Eksplanowane próbki wycięto po krótkiej perfuzji solnej i natychmiast zamrożono w związku OCT do kriosekcjonowania (Ted Pella, Inc). Szkiełka poddano deparaffinizacji, inkubowano z 1% H2O2 w metanolu (10 minut) w celu zablokowania endogennej peroksydazy, a następnie z 10% surowicą końską PBS przez (20 minut). Pierwotne przeciwciała dla królika RAM-11 (DAKO) lub PCNA (PC10, DAKO) stosowano przez 1 godzinę w temperaturze 37°C. Sekcje następnie przemyto PBS, a następnie biotynylowane przeciwciało wtórne (końskie anty-mysie IgG, Laboratorium wektorowe) i Kompleks awidyny-biotyny-peroksydazy (ABC Elite kit, Laboratorium wektorowe) przez 30 minut każdy. Rozwój barwy uzyskano przez 5-minutową ekspozycję na tetrahydrochlorowodorek 3,3 ‘ – diaminobenzydyny (substrat peroksydazy DAB, Sigma Chemical Co) w obecności substratu peroksydazy (Sigma). Szkiełka lekko kontrastowały z hematoksyliną skrzelową nr 3 (Sigma). Dodatnie zabarwienie oceniano pod mikroskopem (Olympus, BX40)przy 2×/0,25 10× / 0.25 powiększeń i zdigitalizowanych klatek wideo. Częstość występowania makrofagów oceniano jako średni procentowy obszar zajmowany przez dodatnio zabarwione komórki w 5 do 6 polach o dużej mocy.

produkcja i transkrypcja IL-1β

do tych badań wykorzystano oddzielne grupy zwierząt. Tętnice i wątroby homogenizowano w buforze kolagenazy, a wyekstrahowano IL-1β za pomocą komercyjnych zestawów ELISA (Systemy R&D).

do analizy odwrotnej transkrypcyjnej reakcji łańcuchowej polimerazy (RT–PCR) RNA z tętnic szyjnych ekstrahowano przy użyciu zestawu do izolacji RNA (Life Technologies). Zbadano jakość, wielkość i ilość RNA, a wartości pasm znormalizowano do ekspresji mRNA β-aktyny.13

aktywność metaloproteinazy macierzy 2

supernatant homogeniatu tętnic w buforze kolagenazy analizowano pod kątem aktywności kolagenazy. Próbki oddzielono na impregnacji żelatyną (1 mg / mL: Difco) SPS 8% żele poliakryloamidowe w Warunkach niewykształcających, wstrząsane 30 minut w 2,5% Triton X-100 (BDH), inkubowane w buforze kolagenazy (16 godzin, 37°C) i barwione 0,5% Coomassie G 250 (BioRad) w metanolu/kwasie octowym/H2O (30:10:60). Intensywność pasma wyznaczano za pomocą komputerowej densytometrii (dynamika molekularna typu 300A).

statystyki

dane są wyrażone jako średnia±SD. Porównano wyniki histologiczne między grupą kontrolną i grupą leczoną za pomocą testu t niesparowanego ucznia. Porównano monocyty krwi i cytokiny w czasie za pomocą 2-drożnej analizy ANOVA. Różnice określono jako istotne statystycznie przy P<0, 05.

wyniki

zapobieganie rozrostowi Poangioplastyce

u zwierząt kontrolnych po urazie balonu obserwowano masową proliferację SMC i tworzenie się macierzy pozakomórkowej (ryc. 1, A i b). Nie stwierdzono istotnych różnic między leczeniem pustymi liposomami, roztworem soli fizjologicznej lub wolnym klodronianem w roztworze (wyniki zbiorcze jako grupy kontrolne). Stosunek N / m wynosił 1,4±0,44 (Fig. LC (15 mg/kg, dni -1 i +6) zmniejszyło stosunek N / m do 0,66±0,2 (Fig. Łagodna ekspansywna przebudowa wystąpiła w obu grupach kontrolnych (RR=1. 22±0,24) i zwierząt leczonych LC (RR=1,29±0,25). Leczenie LC nie miało wpływu na obszar przyśrodkowy, morfologię kości i skład mineralny (brak danych). Nie obserwowano jawnego zakażenia i nie obserwowano ogólnoustrojowych działań niepożądanych.

w celu ustalenia wpływu zubożenia makrofagów w niehypercholesterolemicznym modelu zwierzęcym (bez komórek piankowych)zastosowano model urazu szyjnego szczura.Oznaczona neointima została stłumiona przez leczenie LC, bez znaczących zmian w obszarze tętniczym przyśrodkowym i całkowitym(tabela).

mechanizm działania

zmniejszenie liczby monocytów we krwi i makrofagów tkankowych

wyjściowy poziom monocytów wynosił 2, 8±0, 5% białych krwinek (WBC). Przed operacją, 24 godziny po wstrzyknięciu LC, monocyty były znacznie zmniejszone do <0,2% całkowitej liczby WBC (rycina 2,A i b), podczas gdy liczba WBC pozostała niezmieniona. Trzy dni po zabiegu monocyty krwi nieznacznie wzrosły do 3,5±0,4% u zwierząt kontrolnych i 0,7±0,7% u zwierząt leczonych LC, powracając do poziomu wyjściowego po 6 dniach (Fig.2C).

makrofagi wątroby i śledziony zmniejszono przez barwienie LC (barwienie RAM 11) 6 dni po urazie (ryc. 3). Dodatnio zabarwiony obszar w wątrobie został znacząco zmniejszony z 21,5±4% do 14,7±2,9%, a w śledzionie z 33,3±1,5% do 11,4±3% odpowiednio u królików kontrolnych i leczonych LC. Podobnie, zmniejszone barwienie tętnic RAM – 11 dla makrofagów obserwowano u królików leczonych LC 3 i 6 dni po urazie (rycina 4).

redukcję monocytów i makrofagów Wykryto również poprzez wstrzyknięcie liposomów fluorescencyjnych (FL). Znaczne zmniejszenie sygnału fluorescencyjnego zaobserwowano w monocytach krwi (a także zmniejszoną liczbę) oraz w wątrobie i śledzionie zwierząt leczonych LC(ryc. 5). FL wykryto u rannych, ale nie w nienaruszonych tętnicach. FL w połączeniu z LC znacznie zmniejszyło sygnał fluorescencyjny w uszkodzonej ścianie tętniczej(ryc. 5).

PCNA, IL-1β i Metaloproteinaza macierzowa-2

obszar dodatnio zabarwiony na PCNA po 6 dniach po urazie został znacząco zmniejszony z 5,6±2,6% u zwierząt kontrolnych do 1,7±1,3% u królików leczonych LC (Fig.6, A i b). Rzadko obserwowano neointimę w tym wczesnym punkcie czasowym, w którym proliferacja SMC jest maksymalna.

Analiza poziomów IL – 1β w tkance tętniczej po urazie wykazała, że wzorzec w kształcie dzwonka osiąga szczyt po 6 dniach po urazie i powraca do poziomu podstawowego po 30 dniach (rycina 7a), a znaczny spadek poziomów IL-1β zaobserwowano po 3 i 6 dniach u zwierząt leczonych LC. U zwierząt kontrolnych transkrypcja mRNA IL-1β była silniejsza w dniu 3 niż słabsza ekspresja 1 dzień po urazie, ale oba były znacznie zmniejszone przez leczenie LC(Fig. 7b). Poziomy IL-1β w wątrobie były również zmniejszone po pojedynczym wstrzyknięciu LC w dniu -1, nachylając się do poziomu podstawowego po 30 dniach (dane nie zostały przedstawione).

aktywność metaloproteinazy macierzy tętniczej (MMP-2) zwiększyła się po urazie, wykazując wzorzec w kształcie dzwonka, który osiągnął szczyt po 6 dniach (292±46) i powrócił do poziomu podstawowego po 14 dniach (Fig. LC znacznie zmniejszyło aktywność MMP-2, a w dniu 6 było to tylko 52±17.

dyskusja

to badanie pokazuje po raz pierwszy, że inaktywacja makrofagów przez systemowe podawanie klodronianu w kapsułkach liposomowych hamuje utratę światła po uszkodzeniu balonu zarówno u szczurów, jak i u królików hipercholesterolemicznych. Wyniki te potwierdzają naszą hipotezę, że makrofagi odgrywają kluczową rolę w patogenezie przyspieszonych arteriopatii. Obserwowany wzrost obszaru luminalnego był osiągany głównie poprzez Zmniejszenie rozrostu neointimalnego. Wykazano również łagodny wzrost ekspansywnej przebudowy, ale jej udział w różnicy w obszarze luminalnym był minimalny.

Klodronian należy do rodziny BPs, leków stosowanych klinicznie w zaburzeniach związanych z kośćmi, w tym osteoporozie. Będąc wysoce hydrofilowymi i ujemnie naładowanymi, wolne BPs są prawie niezdolne do przekraczania błon komórkowych.Wychwyt BP przez resorbujące kości osteoklasty (pochodzące jako makrofagi z monocytów krwi) występuje, gdy komórki pochłaniają tkankę kostną pokrytą lekiem.7 ani wolny klodronian, ani LC Nie hamowały proliferacji SMC lub EC ani tworzenia neointymalnego. Skuteczną i selektywną endocytozę klodronianu w makrofagach uzyskuje się poprzez kapsułkowanie klodronianu w liposomach.9,10,14 po fagocytozie działanie lizosomalne zakłóca dwuwarstwy tłuszczowe liposomu i wolny klodronian jest uwalniany do komórki, powodując nieodwracalne uszkodzenie funkcjonalne i apoptozę.8,15

podawanie LC prawdopodobnie przerwało wczesną odpowiedź fazową na uszkodzenie, która jest pośredniczona przez migrację makrofagów w odpowiedzi na ekspresję MCP-1.16 wstrzyknięcie LC przed urazem gwałtownie uszczupliło monocyty krwi (ryc. 2) oraz liczbę i aktywność makrofagów w wątrobie, śledzionie i uszkodzonej ścianie tętniczej (ryc. 3, 4 i 5). Zmniejszenie liczby monocytów dostępnych w czasie urazu zmniejszyło rozrost intymny, być może podobny do efektów obserwowanych przy dezaktywacji monocytów krwi przez IL-10.17 blokujących migrację monocytów/makrofagów do uszkodzonego naczynia z światła i/lub adwentii (ryc. 5) zapobiegało wpływowi tych komórek na migrację i proliferację SMC.

poziomy IL-1β i MMP-2 zostały zmniejszone w uszkodzonych fragmentach tętnic po leczeniu LC. Te główne produkty aktywowanych makrofagów, wydzielane po urazie tętnicy, przyczyniają się do procesu proliferacji neointymalnej.18-20 zmniejszona proliferacja SMC może również przyczyniać się do redukcji IL-1β i MMP-2.21 niemniej jednak, ponieważ LC nie wpływa na SMCs i ECs i nie ma wpływu na fibroblasty,9 makrofag prawdopodobnie jest głównym celem dla LC. Hamowanie rozrostu intymnego w modelu szczura, bez komórek piankowych w tętnicy, dodatkowo wspiera systemowe wyczerpywanie makrofagów jako mechanizm napędzający zmniejszoną proliferację SMC i tworzenie neointimalne. Łącznie ten przejściowy układowy efekt immunomodulujący i przeciwzapalny zmniejszał migrację i proliferację SMC oraz restenozę tętnic.

nasze wyniki są zbieżne z korzystnymi efektami obserwowanymi po modulacji funkcji makrofagów przez różne modalności. Zmniejszone powstawanie neointima po urazie uzyskano u królików poprzez blokadę Mac-122 i u myszy z niedoborem Mac-1.Tak więc, zgodnie z najnowszymi doniesieniami, 9,17,22,23 proces zapalny odgrywa kluczową rolę w kaskadzie powstawania neointima. Wyczerpanie makrofagów zmniejsza również rozrost przeszczepów żył.Niezależnie od różnych patologii pod względem wyzwalania, uszkodzonego naczynia, płytki nazębnej w tętnicy angioplastycznej, składu tkanki stenotycznej i czasu trwania procesu, pozytywny efekt w modelu przeszczepu żyły sugeruje wspólną rolę makrofagów w stymulowaniu rozrostu intymnego naczyń.

implikacje i ograniczenia

wolny klodronian nie przenika przez komórki i ma krótki okres półtrwania w krążeniu ogólnoustrojowym.Klodronian wyciekający z martwych makrofagów i liposomów nie gromadzi się w znacznym stopniu w tkankach innych niż kości. Nie zaobserwowano wpływu na wzrost somatyczny ani na zawartość składników mineralnych w surowicy po leczeniu LC, ponieważ wynik postaci liposomalnej, podobnie jak w przypadku większości innych liposomów i układów dostarczania cząstek leku, znajdował się w układzie siateczkowo-śródbłonkowym. Ponadto dwa wstrzyknięcia 15 mg/kg wolnego klodronianu nie powinny mieć wpływu na prawidłową tkankę kostną.

inaktywacja makrofagów niesie ze sobą niebezpieczeństwo immunosupresji i zakażenia. Jednak, podobnie jak w badaniach na mice z niedoborem Mac-126 i szczurach,24 w naszym badaniu nie zaobserwowano jawnego zakażenia z przejściowym zmniejszeniem makrofagów. Monocyty krwi w pełni odzyskały w tym badaniu 6 dni po wstrzyknięciu, a stężenie IL-1β powróciło do poziomu podstawowego. Inne wykazały, że odzyskiwanie funkcji makrofagów od 4 do 6 dni po wyczerpaniu wywołanym LC nie powoduje długotrwałych efektów toksycznych.W badaniach klinicznych na ludziach należy dalej badać kliniczne implikacje przemijającego, częściowego wyczerpania makrofagów wątroby i śledziony z układową LC.

wiele doniesień o farmakologicznych próbach zahamowania rozrostu intymnego u zwierząt nie przekładało się na późniejsze zahamowanie restenozy u ludzi. Obecne badanie wykorzystuje LC jako narzędzie śledcze do wyjaśnienia roli zapalenia w naprawie naczyń krwionośnych i możliwej wartości modulowania odporności wrodzonej w redukcji postinjury intimal hyperplasia. Że korzyść zaobserwowano w dwóch modelach zwierzęcych, szczura i królika hipercholesterolemicznego, z różnymi obrażeniami i różnym stopniem zapalenia, wspiera główną rolę monocytów i makrofagów w naprawie naczyń krwionośnych i zwiększa wartość prognostyczną hamowania restenozy u ludzi.

obszary bogate w makrofagi są powszechne w zmianach miażdżycowych u pacjentów z niestabilną dławicą piersiową i ostrym zawałem mięśnia sercowego,3 i makrofagi prawdopodobnie pośredniczą w pęknięciu płytki miażdżycowej i nagłym wystąpieniu ostrych zespołów wieńcowych.Konieczne są dalsze badania mające na celu zbadanie, czy zubożenie makrofagów przez liposomalne bisfosfoniany może stanowić strategię stabilizacji innych naczyń naczyniowych i kardiomiopatii, w tym ostrych zespołów wieńcowych.

podsumowując, podawanie LC hamowało proliferację neointymalną po urazie balonu u szczurów i w modelach hipercholesterolemicznych królików. Sugerowanym mechanizmem jest systemowa selektywna, przejściowa modulacja aktywności monocytów/makrofagów. Makrofagi, choć stosunkowo skromne w tkance neointymalnej, odgrywają główną rolę w procesie proliferacji neointymalnej. Dlatego wczesna modulacja i inaktywacja makrofagów przez 1 tydzień po urazie znacznie zmniejszają zwężenie tętnic poangioplastyce w późniejszym czasie.

Przypisy