Infektiöse nekrotische Hepatitis verursacht durch Clostridiumnovyi Typ B bei einem Pferd: Fallbericht und Überprüfung Derliteratur | Jiotower

Die infektiöse nekrotische Hepatitis (INH) wird durch Clostridium novyityp B verursacht.6 Obwohl angenommen wird, dass INH auch bei anderen Tierarten wie Rindern, Ziegen und Pferden vorkommt, liegen nur sehr begrenzte Informationen über diese Krankheit bei anderen Tieren als Schafen vor.2,3,19,15 Darüber hinaus wird aufgrund seiner strengen anaeroben Natur eine Isolierung und Identifizierung von C. novyi Typ B selten erreicht.15 Aus diesem Grund beschränken sich Berichte über INH üblicherweise auf eine vermutete Diagnose basierend auf Histopathologie, Fluoreszenzantikörpertest (FAT) und / oder Immunhistochemie (IHC). Die Art von C. novyi ist seltenbestimmt. Hier präsentieren wir einen bestätigten Fall von Pferde-INH verursacht durch C.novyi Typ B, und überprüfen Sie auch die Literatur über die Krankheit.

Ein 14 Jahre alter, 511 kg schwerer Bay Quarter Horse Wallach wurde der San Bernardinobranch des California Animal Health and Food Safety Laboratory Systems zur postmortalen Untersuchung und diagnostischen Aufarbeitung vorgelegt. Das Tier hatte eine 3-d-Geschichte progressiver neurologischer Symptome, eine Rektaltemperatur von 38,8–40,5 ° C und war vor dem Tod erfolglos mit nichtsteroidalen Antirheumatika behandelt worden.Eine vollständige Autopsie wurde ~ 6 h nach dem Tod durchgeführt.

Bei der Autopsie befand sich das Pferd in einem guten Ernährungszustand mit ausreichenden Fettreserven und in einem moderaten Zustand der postmortalen Zersetzung. Es gab eine gelbliche Verfärbung der Sklera, des Unterhautgewebes und des Fettgewebes sowie der Gelenkknorpel. Multifokale ekchymotische bis suffusive Blutungen waren in den meisten vorhandenmuskeln, Serosa des Darmtraktes, Mesenterium, Milz, Pleura und Inpapillarmuskeln des Herzens. Venöses Blut war tiefrot-schwarz. Der Perikardsack wurde mit einer großen Menge serosanguinöser Flüssigkeit aufgebläht, und es befanden sich ~ 5 L einer ähnlichen Flüssigkeit, die reichlich Fibrinstränge in der Bauchhöhle enthielt.Die Leber war deutlich vergrößert und hatte abgerundete Kanten; Der linke Lappen war fest, dunkelrot bis schwarz und hatte zahlreiche subkapsuläre und tiefe parenchymale Gasblasen und reichlich Fibrin über der Kapsel (Abb. 1A). Auf dem Schnittabschnitt dieses Lappens befand sich ein blasser Bereich mit einem Durchmesser von ~ 15 cm, der von einem dünnen hämorrhagischen Rand umgeben war (Abb. 1B). Die Meningeüber dem Gehirn und dem Rückenmark waren diffus verstopft, und es gab petechiale Blutungen in der gesamten Großhirnrinde. Im Rest des Schlachtkörpers wurden keine weiteren signifikanten Grossläsionen beobachtet.

Proben von Gehirn, Lunge, Herz, Zwerchfell, Leber, Milz, Magen, Darm, Pankreas, Nebenniere, Mesenterium, Niere und Harnblase wurden gesammelt und in 10% gepuffertem Formalin (pH 7,2) für 48 h fixiert und routinemäßig für die Herstellung von 4 µm dickem Hämatoxylin und Eosin (H & E) -gefärbten Abschnitten verarbeitet. Leber- und Nierenschnitte wurden ebenfalls mit Gram- bzw.

Leberproben wurden aseptisch entnommen und auf 5% Schaf-Agarplatten 48 h aerob und anaerob kultiviert. Die PCR wurde für das West-Nil-Virus (WNV) an gepoolten Proben des Zentralnervensystems und für das equide Herpesvirus 1 (EHV-1) an einem Nasenabstrich durchgeführt. Ein Schwermetallsieb einschließlich Blei, Mangan, Eisen, Quecksilber,Arsen, Molybdän, Zink, Kupfer und Cadmium wurde an Leberproben durchgeführt.Cerebrospinalflüssigkeit wurde unter Verwendung eines indirekten Fettes auf Antikörper gegen Sarcocystisneurona getestet. Leberausstriche wurden mit Fett für Clostridium chauvoei, Clostridium septicum, Clostridium sordelli und C. novyi unter Verwendung kommerzieller Konjugate (VMRD, Pullman, WA) verarbeitet. Zusätzlich wurden formalinfixierte, in Paraffin eingebettete Leberabschnitte durch eine indirekte Immunoperoxidasetechnik für C. novyi unter Verwendung eines kommerziellen Kits (RTU VECTASTAINElite ABC System, Vector Laboratories, Burlingame, CA) verarbeitet. Die endogene Peroxidaseaktivität wurde mit einer 3% igen Wasserstoffperoxidlösung gelöscht, gefolgt von einer Pepsinbehandlung zur Antigengewinnung. Die Proben wurden dann mit BackgroundPunisher (Biocare Medical, Concord, CA) inkubiert, um die unspezifische Bindung zu blockieren, bevor sie mit Ziegen–Anti-C. novyi-polyklonalen Antikörpern (VMRD) bei 37 ° C für 60 min inkubiert wurden. Vector NovaRED Chromogen wurde zur Visualisierung verwendet (VectorLaboratories). Leberabschnitte, die mit normalem Ziegenserum inkubiert wurden, anstelle Vonprimärantikörper wurden als Negativkontrolle verwendet. Leber von einer Kuh, in derc. novyi war durch Kultur identifiziert worden, und PCR wurde als Positivkontrolle verwendet.

Leberproben wurden für die DNA-Extraktion (QIAamp DNA FFPE tissue Kit, Qiagen, Hilden, Deutschland) gemäß den Anweisungen des Herstellers verarbeitet. Die extrahierte DNA wurde als Template für einen Multiplex-PCR-Assay zur Amplifikation von Segmenten der Flagellingene (fliC) von C. septicum, C.novyi Typ A, C verwendet. novyi Typ B, C.chauvoei und Clostridium haemolyticum, wie zuvor beschrieben.17 Zusätzlich entwickelten wir eine konventionelle PCR, um ein Segment von theC zu amplifizieren. novyi Typ B alpha Toxin (TcnA) Gen (GenBank accession JENV01000127.1), der Hauptvirulenzfaktor von diesemmikroorganismus. Die folgenden Oligonukleotidsequenzen wurden entworfen: 5′-TGATGTTGACCATCCTTGCTCT-3′ (CNtBaF) und 5′-CCTTATGCAAAGGGATGGCG-3′ (CNtBaR), die ein ~ 342-bp-DNA-Fragment des Zielgens amplifizieren. Konventionelle PCR wurde in einem Gesamtvolumen von 25 µL durchgeführt, das 5 µL extrahierte DNA enthielt, 0.25 µL Primer (10 µM), 7 µL nukleasefreies Wasser und 12,5 µL PCR Master Mix (2X, Promega, Madison, WI), enthaltend Taq DNA Polymerase (pH 8,5, 50 U/ml), dNTPs (400 µM) und MgCl2 (3 mM). Die Thermocyclerprofile waren wie folgt: 94 ° C für 5 min, 30 Zyklen von 94 ° C für 1 min, 55 ° C für 1 min und 72 ° C für 1,5 min, gefolgt von einem abschließenden Verlängerungsschritt bei 72 ° C für 7 min. Die Proben wurden bei 4°C gehalten, bis die PCR-Reaktionen unter ultraviolettem Licht in Ethidiumbromid (Amresco, Solon, OH) -gefärbten 1% Agarosegelen (Agarose SFR, Amresco) sichtbar gemacht wurden. Dnaextrahiert von C. novyi Typ B (ATCC 25758), C.novyi Typ A, C. septicum, C.chauvoei und C. haemolyticum Kulturen wurden als Positivkontrollen verwendet. Wasser anstelle von DNA wurde in negativer Kontrolle verwendetreaktionen.

Mikroskopisch war die Leberkapsel von reichlich Fibrin bedeckt, das mit Zelldebris gemischt war, und es gab subkapsuläre und tiefe parenchymale emphysematöse Bullae verschiedener Größen. Der auffälligste Befund war eine multifokale bis fokal ausgedehnte koagulative Nekrose, umgeben von einem Rand aus einer großen Anzahl lebensfähiger und degenerierter neutrophiler Granulozyten, Blutungen, Fibrin, Zelltrümmern und großen Aggregaten grampositiver Bakterienstäbe, von denen einige subterminale Sporen aufwiesen (Abb. 1C, ,D).D). In Intervenierenparenchym und in der weniger betroffenen Leber gab es Gallenstauung, multifokale Blutungen und segmentale bis diffuse fibrinoide Nekrose von Blutgefäßen, viele vondie auch Fibrinthromben enthielten. Das Nierentubulusepithel wies eine milde zytoplasmatische Vakuolisierung auf, und im Lumen der Nierentubuli waren Protein- und Granulatabdrücke vorhanden. Die mit Okajima-Beize positiv gefärbten Abgüsse (Abb. 1E). Im Gehirn gab es diffuse Stauung, multifokale und zufällig verstreute perivaskuläre Blutungen und moderate bis deutliche Ausdehnung des Virchow-Robin-Raumes mitacidophiles Ödem. Das viszerale Peritoneum war mit reichlich Fibrin bedeckt, dem eine große Anzahl lebensfähiger und degenerierter Neutrophiler beigemischt war; Die meisten peritonealen Blutgefäße waren verstopft und / oder enthielten Fibrinthromben. Ein paar kleine Arterien undvenen im Cortex und Medulla der Nebenniere hatten auch Fibrinthromben. Thespleen hatte Gefäßstauung und multifokale parenchymale und Kapselblutungen. Die Lungen waren diffus verstopft und hatten multifokale Blutungen und Ödeme, zusätzlich zu einigen Blutgefäßen, die Fibrinthromben enthielten. Multiplesubendocardial, subepicardial und subpleuralblutungen wurden gesehen.

Die große Mehrheit der in der Leber beobachteten intraläsionalen grampositiven Stäbchen warpositiv für C. novyi IHC (Abb. 1F). FETT war positiv für C.novyi, aber negativ für die anderen getesteten Clostridienarten. Leberproben waren positiv für C. novyi Typ B fliCand TcnA-Gene und negativ für die fliC-Gene der anderen getesteten Clostridien (Abb. 2). Proben von Liquor cerebrospinalis waren negativ für S.neurona Immunfluoreszenz-Antikörper-Assay. PCR für WNV und EHV-1 warnegativ. Durch aerobe oder anaerobe Kultur wurde kein signifikantes Bakterienwachstum erreicht. Das Schwermetallsieb ergab eine erhöhte Konzentration von Eisen Inleberproben (1.500 ppm; Referenzintervall: 100-300 ppm).

Wir machten eine vermutliche Diagnose von INH basierend auf groben und mikroskopischen Veränderungen, gepaart mit Ergebnissen von FAT und IHC für C. novyi. Die Diagnose des von C. novyi Typ B produzierten INH wurde durch PCR-Nachweis der fliC- und TcnA-Gene dieses Mikroorganismus bestätigt. Unseres Wissens wurden bisher nur 6 Fälle von Verdacht auf IHN bei Pferden gemeldet. Drei Fälle ereigneten sich in Australien,8, 9,11 und jeweils einer in Neuseeland,23 Schottland,19 und den Vereinigten Staaten (Montana).16 In diesen Fällen beruhte eine vermutliche Diagnose auf groben und mikroskopischen Schädigungen in Verbindung mit dem Nachweis von C. novyi durch FETT,9,16,19 IHC,23 und / oder Kultur.9,19 In keinem dieser Fälle wurde jedoch festgestellt, um welche Art von C. novyi es sich handelte.

C. novyi ist ein grampositiver, sporenbildender, anaerober Bazillus, der häufig im Boden und im Kot von Tieren vorkommt.15 Es wird basierend auf der Bandbreite der produzierten Toxine in die Typen A, B und C eingeteilt.4C. novyi Typ A produziert hauptsächlich das tödliche, ödeminduzierende Alphatoxin (TcnA) und die nicht tödliche Phospholipase Gamma-Toxin; Dieses Bakterium ist mit Gasbrand von Mensch und Tier verbunden und wirkt normalerweise zusammen mit anderen Clostridien. C. novyi Typ B produziert neben dem nekrotisierenden und hämolytischen Beta-Toxin auch TcnA, obwohl ersteres als der wichtigste Virulenzfaktor für die Pathogenese von INH angesehen wird. C.novyi Typ C gilt als nicht toxisch undnicht pathogen.13,15C. haemolyticum war früher als C bekannt. novyityp D, und es wird immer noch von einigen Autoren mit diesem Namen bezeichnet; deshalb diskutieren wirauch diesen Mikroorganismus hier. C. haemolyticum auchproduziert Beta-Toxin, aber in viel größeren Mengen als C. novyityp B; Dieses Toxin gilt als der Hauptvirulenzfaktor dieses Mikroorganismus und ist verantwortlich für die bazilläre Hämoglobinurie (BH), eine Krankheit, die hauptsächlich Rinder befällt und klinisch und pathologisch der INH sehr ähnlich ist.11,10,14

Die Sporen von C. novyi sind gegen environmentalconditions in hohem Grade beständig und, da die Sporen allgemein im Boden gefunden werden, können weidende animalsmay sie häufig aufnehmen.6,19 Obwohl nicht vollständig bewiesen, ist das derzeitige Dogma, dass die Sporen von C. novyi Typ B nach der Einnahme aus dem Darm resorbiert werden und über den Pfortaderkreislauf in die Leber gelangen, wonach sie sich auf andere Organe ausbreiten. Die Sporen sind phagozytiert und bleiben in Kupferzellen der Leber und in Makrophagen der Milz und des Knochenmarks latent.2,6 INH wurde häufig als Gegenstück zu BH angesehen, da angenommen wird, dass beide Krankheiten nach einer Leberschädigung auftreten und Nekrose und die damit verbundenen anaeroben Bedingungen verursachen, die für die Keimung latenter Sporen und die Produktion von Toxinen erforderlich sind.14 Migration von unreifen Formen von Fasciola hepatica durchdie Leber gilt als der wichtigste prädisponierende Faktor für BH und INHin Wiederkäuer, und beide Krankheiten sind häufiger in Gebieten mit hoher Prävalenz von Fascioliasis.1 INH von Wiederkäuern wurde auch mit Cysticercustenuicollis und anderen Parasiten in Verbindung gebracht, einschließlich Fascioloidesmagna, Dicrocoelium dendriticum undThysanosoma actinoides,2,6,15,21 obwohl die Rolle dieser Parasiten bei der Pathogenese der Krankheit nicht nachgewiesen wurde.Jede Leberschädigung, die zur Entstehung anaerober Zustände führt, kann jedoch ein prädisponierender Faktor für INH sein. Dazu gehören unter anderem Leberabszesse, Biopsien, Fettveränderungen, Teleangiektasien und toxische Agenzien. Sobald TcnA isproduced und freigegeben durch die vegetativen Formen von C. novyi Typ B, seine Monoglycosyltransferase-Aktivität inaktiviert mehrere Guanosin5′-Triphosphat (GTP) -bindende Proteine in Zellen des Wirts, was zu einer Veränderung und Umverteilung des Aktin-Zytoskeletts führt.3 TcnA stört auch das Vimentin- und Tubulinsystem.7,18 Diese Veränderungen scheinen im Kapillarendothel dramatischer zu sein, was zu der in INH15 beobachteten weitverbreiteten Extravasation von Flüssigkeit und wahrscheinlich zu der multisystemischen Thrombose führt, die beim Pferd unseres Berichts beobachtet wurde. Bei Schafen erschwert die hochakute Natur der Krankheit den Nachweis vonklinische Anzeichen, bei denen Tiere normalerweise tot aufgefunden werden. In Fällen, in denen Zeichensind beobachtet, sie sind unspezifisch und umfassen Schwäche, Lethargie, Anorexie,Hyperthermie, Tachypnoe, Hyperpnoe und schließlich Liegeposition. Klinisch-pathologische Veränderungen können Neutrophilie mit Linksverschiebung, Azotämie, metabolische Azidose und erhöhte Leber- und Muskelenzymaktivitäten umfassen.15,19

Da bisher nur 6 Fälle von mutmaßlichem INH bei Pferden beschrieben wurden, sind die verfügbaren epidemiologischen, klinischen und pathologischen Informationen spärlich. Aufgrund dieser begrenzten Anzahl von Fällen gibt es keine offensichtliche Geschlechts- oder Rassenprädisposition in Fällen von Pferde-INH, und sowohl junge als auch erwachsene Tiere können betroffen sein. Derklinischer Verlauf ist bei Pferden in der Regel länger als bei Wiederkäuern, dauert 12-72 h,und das Ergebnis war immer tödlich. Die klinischen Symptome variieren von leicht bis schwerdepression und Bewegungsunwilligkeit, neurologische Anzeichen einschließlich Ataxie und Kopfneigung, hyperämische und / oder ikterische Schleimhäute und Augensklera, Bauchschmerzen und Liegeposition.20,23 In einem Fall, in dem eine Abdominozentese durchgeführt wurde,wurde eine erhöhte Menge an trüber Flüssigkeit mit erhöhter Proteinkonzentration undspezifischem Gewicht erhalten.9

Klinisch-pathologische Profile von Pferden mit INH sind sehr variabel und können verschiedene Stadien von Toxämie und Leberschäden darstellen. Diese Veränderungen können Neutrophilie mit Linksverschiebung, erhöhte Leberenzymaktivität, Thrombozytopenie, Hyperfibrinogenämie, Hyperbilirubinämie und verminderte Elektrolytkonzentration umfassen.9,16,19 Darüber hinaus wurden erhöhte aktivierte partielle Thromboplastin-, Prothrombin- und Thrombinzeiten berichtet.23 Diese Veränderungen deuten in Kombination mit den beobachteten kapillaren Mikrothromben auf eine disseminierte intravaskuläre Koagulation hin, ein Prozess, der wahrscheinlich im Verlauf von Toxämie und Hämolyse bei großen Tieren auftritt.22,23 Der daraus resultierende Verbrauch von Gerinnungsfaktoren, ihre verminderte Synthese aufgrund von hepatischem Versagen und die synergistische Wirkung von TcnA auf das vaskuläre Endothel sind vermutlich für die weit verbreiteten Blutungen verantwortlich, die bei INH beobachtet werden.

Obwohl Ikterus bei Wiederkäuern nicht beschrieben wird, können Pferde manchmal dieses mit INH assoziierte Zeichen aufweisen.19,23 Ikterus scheint mit der Schwere vonhepatische Schädigung und bis zu einem gewissen Grad Hämolyse, wie in unserem Fall, in Demhämoglobin wurde in den Nierentubuli durch Okajima-Färbung sichtbar gemacht. Das Pferd in unserer Studie hatte eine moderat erhöhte Eisenkonzentration in der Leber, was auf einen hämolytischen Prozess hindeutet.5 Dieser Eisengehalt in der Leber ist jedoch ein häufiger Befund bei Pferden, die aus einer Vielzahl von Ursachen absterben, und wird häufig als zufälliger Befund angesehen, der mit Stauung und postmortaler Autolyse in Verbindung gebracht wird (unveröffentlichte Beobachtung der Autoren).

Obwohl angenommen werden kann, dass Pferde anfälliger für die Wirkung des hämolytischen Beta-Toxins sind, das von C. novyityp B produziert wird, wurden hämoglobinurale Veränderungen in vermuteten Fällen VONINH.16,23 Im Vergleich zu C. haemolyticum produziert C. novyi Typ B geringere Mengen an Beta-Toxin;15 daher wird angenommen, dass sein Beitrag zur Pathogenese von INH gering ist und bei Pferden einen gewissen Grad an Hämolyse verursacht, jedoch nicht ausreicht, um signifikante Hämoglobinurie-assoziierte Veränderungen hervorzurufen. Darüber hinaus schloss keiner der vorhergehenden Fälle die Rolle von C. haemolyticum als Krankheitserreger aus, so dass aus diesen Fällen keine endgültigen Schlussfolgerungen gezogen werden können. C.haemolyticum wurde in einem Fall von septischer Peritonitis bei einer Stute durch Identifizierung mit MALDI-TOF in Verbindung gebracht; in diesem speziellen Fall wurde jedoch keine PCR- oder Toxinidentifikation versucht.11

Der prädisponierende Faktor für INH bei Pferden wurde nicht immer bestimmt, wenngleich Lebermigrationen von F. hepatica und verwandten Trematoden sowie von Mitgliedern der Familie der Strongylidae vermutet wurden.9,12,19 Darüber hinaus wurde eine anthelminthische Behandlung vor dem Auftreten klinischer Symptome als potenzieller Auslöser der Krankheit vorgeschlagen,9,16,23 vermutlich durch einen gewissen Grad an hepatischer Nekrose, die mit der Zerstörung wandernder Parasiten verbunden ist. Es liegen jedoch keine wissenschaftlichen Beweise vor, um diese Hypothese zu stützen. Leider nicht bekanntprädisponierende Faktoren wurden in unserem Fall bestimmt.

Wie in unserem Fall beschrieben die meisten früheren Berichte einen einzigen (multiplen in einem Fall19) Nekrosefokus, der die Leber befällt und sich konsequent im linken Lappen befindet. Dies steht im Gegensatz zu Schafen, bei denen zufällig verteilte, kleine nekrotische Herde häufiger auftreten.6,15 Der Grund für diese Variation in der Verteilung ist unbekannt. Es ist möglich, dass das Vorherrschen vonläsionen am linken Lappen hängen mit dem sogenannten Portalströmen zusammen, das istverantwortlich für den Differentialfluss von Portalblut zu bestimmten Lappen derLeber. Da C. novyi vermutlich aus dem Dünndarm resorbiert wird und das Blut aus diesem Organ Portalströmungen zum linken Lappen folgt, kann dies dazu führen, dass dieser Lappen überwiegend betroffen ist.6 Das Fehlen von Veränderungen im Zusammenhang mit hepatischer Enzephalopathie (z.,Alzheimer Typ II Astrozytose im Zusammenhang mit Hyperammonämie)6 kann darauf hindeuten, dass neurologische Zeichen in diesem und früheren Fällen warenfolge von Blutungen, Stauungen und perivaskulären Ödemen im Gehirn im Zusammenhang mit Toxämie und der Wirkung von TcnA auf das Kapillarendothel.

INH sollte in der Liste der Differentialdiagnosen von Pferden mit neurologischenklinischen Anzeichen, Toxämie, akutem Leberversagen und Peritonitis stehen. Obwohl die Behandlung mit hohen Dosen von Penicillin und Tetracyclinen gegenc wirksam sein kann. novyi, die fortgeschrittene Produktion von Toxinen führt in der Regel zu einer schlechten Prognose.19 In Gebieten, in denen die Krankheit eindeutig mit Leberegelund/oder anderen Parasiten in Verbindung gebracht wird, kann als vorbeugende Maßnahme versucht werden, die Parasitenbelastung zu verringern und den Zugang der Tiere zu schlecht entwässerten Weiden zu beschränken.15

Da angenommen wird, dass mehrere Clostridienerkrankungen mit einer beschleunigten postmortalen Zersetzung einhergehen, ist eine wichtige Überlegung für die korrekte Diagnose von INH die Notwendigkeit einer schnellen Bewertung und Konservierung von Geweben nach dem Tod des Tieres.6,23 Anamnese, routinemäßige Autopsie, Histopathologie und Immunfärbung von C. novyi in Leberläsionen sind unerlässlich, um eine vermutliche Diagnose von INH zu stellen. Da die Isolierung angesichts der strengen anaeroben Anforderungen des Mikroorganismus nicht immer erfolgreich ist, ist die molekulare Identifizierung durch PCR ein wertvolles Instrument, um eine ätiologische Diagnose zu stellen und C. novyi Typ B von anderen Clostridienpathogenen zu unterscheiden.