Arabidopsis cmt3-Chromomethylase-Mutationen blockieren die Nicht-CG-Methylierung und Stummschaltung eines endogenen Gens | Jiotower

Ergebnisse und Diskussion

Um Faktoren zu identifizieren, die die Methylierung und Stummschaltung der WS-PAI-Gene steuern, isolierten wir eine mutierte Variante von WS, pai1C251Y, bei der die Stummschaltung des methylierten Singulett-PAI2-Gens durch die Intensität eines blau fluoreszierenden Pflanzenphänotyps unter Ultra-Licht sichtbar gemacht werden kann -violettes (UV) Licht (Bartee und Bender 2001). Im pai1C251Y-Stamm sind die einzigen potenziellen Quellen der PAI-Enzymaktivität das PAI1-Gen, das durch eine Missense-Mutation verkrüppelt ist, und das PAI2-Gen, das zum Schweigen gebracht wird. Aufgrund dieses PAI-Mangels akkumuliert der Stamm fluoreszierende Zwischenprodukte des Tryptophanweges sowie gelbgrüne Blattpigmentierungen, verringerte Größe, erhöhte Buschigkeit und verringerte Fruchtbarkeit. Mutationen an zweiter Stelle, die die PAI2-Stummschaltung erleichtern, unterdrücken jedoch die PAI-defizienten Phänotypen (Bartee und Bender 2001). Daher mutagenisierten wir den pai1C251Y-Stamm und suchten nach Sämlingen mit unterdrückten schwach fluoreszierenden Phänotypen. Als sekundäres Screening testeten wir die PAI-Methylierung durch Southern-Blot-Analyse mit methylierungsempfindlichen Restriktionsenzymen. Insbesondere untersuchten wir die Methylierung mit den Isoschizomeren HpaII und MspI, die die Sequenz 5′-CCGG-3′ erkennen. HpaII reagiert empfindlich auf die Methylierung sowohl der inneren (CG) als auch der äußeren (CNG) Cytosine, während MspI nur empfindlich auf die Methylierung der äußeren Cytosine reagiert. Diese Enzyme spalten einmal in jedem WS PAI-Locus und zeigen sowohl die Dichte als auch das Muster der Methylierung für jedes Gen (Bender und Fink 1995; Luff et al. 1999; Melquist et al. 1999).

Aus dieser Screening-Strategie isolierten wir 11 Loss-of-Function-Allele im CMT3-Gen (siehe unten und Materialien und Methoden). Die cmt3-Mutanten im pai1C251Y-Hintergrund zeigten eine stark reduzierte Fluoreszenz in der frühen Sämlingsentwicklung und eine teilweise reduzierte Fluoreszenz in adulten Pflanzen mit erhöhter Größe, verminderter Buschigkeit und erhöhter Fruchtbarkeit (Abb. (Abb.1).1). Diese intermediären fluoreszierenden cmt3-Isolate kehrten bei einer nachweisbaren Frequenz nicht zur Nichtfluoreszenz zurück, die für den Verlust der verbleibenden PAI2-Methylierung (Bender und Fink 1995) diagnostisch ist. Sie zeigten eine teilweise erhöhte Spaltung mit HpaII und eine stark erhöhte Spaltung mit MspI für die PAI-Gene im Vergleich zu parentalem pai1C251Y (Abb. (Abb.2A).2A). Das Spaltmuster deutete darauf hin, dass die cmt3-Mutanten am stärksten von der Aufrechterhaltung der CNG-Methylierung der PAI-Gene betroffen waren. Um festzustellen, ob die cmt3-Mutanten auch die Methylierung einer stark wiederholten genomischen Sequenz beeinflussten, haben wir den HpaII / MspI-Southern-Blot mit einer Sonde auf die 180-bp-Zentromer-assoziierten Wiederholungssequenzen (CEN) umgestellt (Vongs et al. 1993). Diese Sonde zeigte einen geringen Effekt auf die HpaII-Spaltung, erhöhte jedoch die MspI-Spaltung, was mit dem für die PAI-Gene beobachteten Muster übereinstimmt (Abb. (Abb.2B).2B). Ein ähnliches Muster einer erhöhten MspI-Spaltung wurde auch an der wiederholten rDNA beobachtet (Daten nicht gezeigt). Alle 11 getesteten cmt3-Allele wiesen in diesen Assays identische Methylierungsmuster auf. Wenn die cmt3-Allele vom pai1C251Y-Allel in einen Wildtyp-WS-Hintergrund getrennt wurden, zeigten sie außerdem identische Methylierungsmuster in diesen Assays (Abb. (Abb.2).2). Die PAI- und CEN-Methylierungsmuster unterschieden sich von den Mustern, die durch die charakterisierten ddm1- und met1-methylierungsdefizienten Mutationen induziert wurden (Abb. (Abb.2;2; Bartee und Bender 2001).

Um Methylierungsmuster im cmt3-Mutantenhintergrund genauer zu bestimmen, führten wir eine genomische Sequenzierung von Methylierungsmustern in den PAI1- und PAI2-Promotorregionen eines repräsentativen cmt3-Allels unter Verwendung von Natriumbisulfit-Mutagenese durch (Frommer et al. 1992). Diese Analyse ergab, dass die Mehrheit der methylierten Cytosine (87% in PAI1 und 70% in PAI2) an CG-Resten auftrat (Abb. (Abb.3;3; Tabelle Tabelle1).1). Verglichen mit dem Wildtyp-Promotor WS PAI1 (Luff et al. 1999; Tabelle Tabelle1), 1), CG-Methylierung wurde um 34% reduziert, CNG-Methylierung wurde eliminiert und asymmetrische Methylierung wurde um 93% reduziert; Im PAI2-Promotor wurde die CG-Methylierung um 8%, die CNG-Methylierung um 92% und die Nicht-CG-Methylierung um 75% reduziert. Somit hat der Verlust der CMT3-Funktion einen starken Einfluss auf die Aufrechterhaltung der CNG- und CG-Methylierung und einen schwächeren Effekt auf die Aufrechterhaltung der CG-Methylierung. Diese Ergebnisse stimmen mit Berichten überein, dass Arabidopsis CMT3 und Mais ZMET2 für die Aufrechterhaltung der CNG-Methylierung an verschiedenen genomischen Stellen wichtig sind (Lindroth et al. 2001; Papa et al. 2001), aber sie zeigen weiter, dass CMT3 auch für die Aufrechterhaltung der asymmetrischen Methylierung für die PAI-Gene wichtig ist. Dieses Ergebnis impliziert entweder, dass CMT3 sowohl die symmetrische als auch die asymmetrische Methylierung direkt steuert oder dass die Verringerung der symmetrischen Methylierung im Hintergrund der cmt3-Mutante eine reduzierte asymmetrische Methylierung als sekundäre Konsequenz verursacht. Da die methylierten Sequenzen im Promotor und im ersten Exon des PAI2-Reportergens (∼370 bp) nur 16 dispergierte CG-Motive enthalten, hypomethyliert der Verlust der Nicht-CG-Methylierung diesen Bereich des Gens signifikant (Abb. (Abb.3), 3), unter Berücksichtigung einer verstärkten PAI2-Expression in der Suppressormutante.

Der cmt3-Mutantenlocus in den pai1C251Y-cmt3-Suppressor-Isolaten wurde durch Kreuze mit dem polymorphen Stamm Nd-0 kartiert, der eine ähnliche Anordnung dicht methylierter PAI-Gene aufweist wie in WS (Melquist et al. 1999). F2-Nachkommen mit schwach fluoreszierenden Phänotypen, die sowohl für pai1C251Y als auch für cmt3 homozygot waren, wurden durch visuelle Inspektion unter UV-Licht identifiziert und durch MspI Southern Blot für eine starke PAI-Spaltung bestätigt, ähnlich der in den elterlichen Suppressor-Isolaten beobachteten. Eine Kartierungspopulation von F2-Pflanzen, die diese Kriterien erfüllten, wurde dann verwendet, um nach genomischen Loci zu suchen, die mit dem unterdrückten Phänotyp verknüpft waren. Die Kartierungsanalyse ergab eine Verknüpfung mit einem einzelnen Locus am unteren Arm von Chromosom 1. Da das mutmaßliche CMT3-Cytosinmethyltransferase-Gen auf diesen Locus abgebildet ist, haben wir uns auf dieses Gen als Kandidaten konzentriert. Innerhalb jeder Kartierungspopulation fanden wir eine vollständige Verknüpfung mit einem polymorphen Marker, der innerhalb von 100 kb des CMT3-Gens liegt. Um zu bestätigen, dass das CMT3-Gen tatsächlich die Stelle der Methylierungssuppressormutationen war, klonierten und sequenzierten wir das Gen aus den 11 mutierten Isolaten. Die Sequenzierung ergab eine einzige Basenänderung in der CMT3-kodierenden Sequenz in jedem Isolat. Drei der mutierten Allele betrafen absolut konservierte Aminosäuren in der katalytischen Methyltransferase-Domäne, einschließlich des repräsentativen cmt3G456D-Allels, das für die Bisulfit-Sequenzierung verwendet wurde. Es wurde vorhergesagt, dass ein anderes Allel das Protein vorzeitig beendet. Zwei Allele erzeugten Spleißübergangsmutationen. Die verbleibenden fünf Allele betrafen Aminosäuren zwischen Methyltransferase-Motiv IV und dem C-Terminus des Proteins, die unter den CMT-Genen hochkonserviert sind (Abb. (Abb.4).4).

Um weiter zu bestätigen, dass das CMT3-Gen der Mutantenlocus war, transformierten wir die pai1C251Y cmt3-Isolate mit einem Wildtyp-WS-genomischen Klon des CMT3-Gens. Transformante Keimlinge waren stark fluoreszierend, ähnlich denen des pai1C251Y-Stammes (Abb. (Abb.1).1). Transformantenlinien, die durch Southern-Blot-Analyse in der T2-Generation untersucht wurden, zeigten eine Remethylierung des PAI2-Gens auf die im ursprünglichen pai1C251Y-Stamm beobachteten Werte (Daten nicht gezeigt). Somit könnte das klonierte CMT3-Gen die mutierten Methylierungsdefekte ergänzen. Als Kontrolle wurde die repräsentative pai1C251Y cmt3G456D-Mutante ebenfalls mit einem Wildtyp-WS-genomischen Klon des CMT2-Gens transformiert. CMT2-Transformanten-Keimlinge waren schwach fluoreszierend, ähnlich wie die des nicht transformierten Elternstamms (Abb. (Abb.1), 1) und zeigte keine nachweisbare Remethylierung von PAI2. Diese Analyse zeigt, dass CMT2 die CMT3-Funktion nicht ersetzen kann. In diesem Zusammenhang ist es interessant festzustellen, dass sich CMT2 von CMT3 hauptsächlich in seiner N-terminalen Sequenz unterscheidet (Abb. (Abb.44).

Zuvor charakterisierte methylierungsdefiziente Arabidopsis-Stämme mit Defekten entweder im SWI2/SNF2-Chromatin-Remodeling-Faktor-verwandten Gen DDM1 (Jeddeloh et al. 1999) oder das Dnmt1-verwandte MET1-Cytosinmethyltransferase-Gen zeigen progressive Entwicklungsstörungen (Finnegan et al. 1996; Kakutani et al. 1996; Ronemus et al. 1996). Unsere vorläufige Analyse von pai1C251Y cmt3-Inzuchtstämmen mit sechs Generationen und cmt3-Inzuchtstämmen mit zwei Generationen ergab keine offensichtliche Segregation morphologischer Veränderungen. Dieser Unterschied zwischen cmt3 und anderen methylierungsdefizienten Mutanten spiegelt wahrscheinlich die Tatsache wider, dass die CG-Methylierung in cmt3 in höherem Maße erhalten bleibt als in ddm1 oder met1 (Abb. (Abb.2;2; Bartee und Bender 2001). Da viele der endogenen methylierten Stellen im Arabidopsis-Genom, wie die CEN-Wiederholungen (Abb. (Abb.2;2; Vongs et al. 1993; Lindroth et al. 2001) und der Promotor des FWA-Homedomänen-Gens (Soppe et al. 2000; Lindroth et al. 2001), tragen in erster Linie CG-Methylierung, cmt3 Mutationen würden nicht erwartet, dass diese Loci stark beeinflussen. Stattdessen wirkt CMT3 höchstwahrscheinlich als verstärkende Methylase, die bestimmten genomischen Regionen wie den PAI-Genen eine zusätzliche Methylierungsschicht hinzufügt, in der die erhöhte Methylierungsdichte zu einer erhöhten Stummschaltung führt. Ein spezifisches Modell ist, dass die basale Schicht der CG-Methylierung, die durch andere Funktionen wie MET1 bereitgestellt wird, als Leitfaden für CMT3 dienen könnte, das dann die basale Schicht mit zusätzlicher CG- und Nicht-CG-Methylierung dekorieren würde. Die Rekrutierung von CMT3 in Zielregionen könnte Chromatinproteininteraktionen mit dem Chromodomänenmotiv beinhalten (Henikoff und Comai 1998), zusammen mit Interaktionen, die durch die einzigartigen N-terminalen Sequenzen vermittelt werden.

Weil Pilze wie Neurospora crassa und Ascobolus immersus die Nicht-CG-Methylierung aufrechterhalten können (Selker et al. 1993; Goyon et al. 1994) könnten diese Organismen CMT-Gene kodieren. Umgekehrt, weil Tieren wie Menschen und Mäusen die Nicht-CG-Methylierung fehlt, wird vorhergesagt, dass diesen Organismen CMT-Gene fehlen, wie dies bei Analysen aktueller Sequenzdatenbanken der Fall ist. Der offensichtliche Mangel an CMT-ähnlichen Methylasen in tierischen Genomen (Finnegan und Kovac 2000) legt nahe, dass Tiere alternative Mechanismen zur Verstärkung von Chromatinzuständen entwickelt haben.