Prävalenz und einige mögliche Mechanismen der Colistinresistenz bei multiresistenten und extensiv resistenten Pseudomonas aeruginosa

Einführung

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) ist ein opportunistischer Erreger, der häufig in Umgebungen wie Boden, Wasser, Pflanzen und Krankenhausumgebungen vorkommt, mit bekannter intrinsischer Resistenz gegen viele antimikrobielle Mittel und der Fähigkeit, die lebensbedrohliche Infektionen verursachen. Es gilt als die zweithäufigste Ursache für Sepsis auf Intensivstationen und kann beatmungsassoziierte Pneumonien, Wundinfektionen und Harnwegsinfektionen (UTI) verursachen. Viele Studien berichteten über die Zunahme der Mortalität und Morbidität von Infektionen im Zusammenhang mit P. aeruginosa, insbesondere solche, die Multiresistenzmuster aufweisen.1-3

Die Entstehung von multiresistenten (MDR) oder extensiv arzneimittelresistenten (XDR) oder pandrugresistenten (PDR) P. aeruginosa wird zu einem bedeutenden Problem der öffentlichen Gesundheit, das zu einer verzögerten antimikrobiellen Therapie oder deren Versagen und zur Erhöhung der Mortalitätsrate führen kann, insbesondere mit dem Auftreten von Carbapenem-resistentem P. aeruginosa. Daher ist Aufmerksamkeit erforderlich, da diese resistenten Stämme möglicherweise Resistenzen gegen alle verfügbaren antimikrobiellen Mittel aufweisen oder nur für toxische Mittel wie Colistin oder Polymyxine anfällig sind, so dass das Gesundheitsteam bei der Behandlung schwerer Infektionen im Zusammenhang mit MDR keine Wahl hat P. Aeruginosa.4

In jüngster Zeit wurde bei bestimmten Arten von Enterobacteriaceae wie K. pneumoniae, E. coli, Enterobacter aerogenes und Enterobacter cloacae aufgrund seiner breiten Verwendung zur Bekämpfung von Infektionen in der Veterinärmedizin eine Resistenz gegen Polymyxine beobachtet. Die Colistinresistenz ist zu einer großen Herausforderung für die Behandlung lebensbedrohlicher Infektionen geworden, insbesondere bei der Koexistenz von mcr-1-Genen mit anderen Multiple Drug Resistance Gene als ESBL, MBL, NDM-Gene mit der Möglichkeit der Entstehung von Pan-Drug-Resistenz.5,6

Colistin, bekannt als Polymyxin E, ist ein Mitglied einer Familie von kationischen Polypeptiden, die als Polymyxine bekannt sind. Diese Antibiotikafamilie ist durch das Vorhandensein einer lipophilen Fettacylseitenkette gekennzeichnet. Heutzutage wird Colistin wieder in die medizinische Therapie eingeführt und gilt als letzter Ausweg zur Behandlung schwerer Infektionen durch MDR- und XDR-Flecken. Im Allgemeinen hängt die Wirkung von Polymyxinen auf Bakterien hauptsächlich von der elektrostatischen Wechselwirkung zwischen dem positiv geladenen Antibiotikum und der negativ geladenen Phosphatgruppe von Lipid A ab, die nach ihrer Bindung auf der äußeren Membran lokalisiert ist. Polymyxine verursachen Destabilisierung der äußeren Membran, Porenbildung, Erhöhung der Permeabilität, Leckage zum zytoplasmatischen Inhalt gefolgt von Zelllyse.7

Die Colistinresistenz tritt hauptsächlich aufgrund der chemischen Modifikation durch enzymatische Addition von Phosphoethanolamin an der 4ʹ- Phosphatgruppe der Lipid-A-Einheit des Lipopolysaccharids auf, wodurch die netto-negative Ladung der äußeren Membran verringert wird, was zu einer Verringerung der Polymyxin-Affinität führt. Die Resistenz gegen Colistin kann aus einer chromosomal kodierten Mutation resultieren, wie in K. pneumoniae berichtet, oder aus der horizontalen Übertragung der Resistenz mittels eines Plasmids, das ein colistinresistentes Gen trägt (mcr-1).8-11

Das Auftreten von Colistin-Resistenzen in verschiedenen Ländern Asiens, Europas und einiger Länder Afrikas ist zu einem der globalen Anliegen geworden. Die Verbreitung der Colistinresistenz zeigt an, dass sie horizontal durch konjugative Plasmide oder vertikal durch chromosomale Mutation übertragen werden kann.12,13 Außerdem ist Colistin eine der letzten Behandlungslinien für schwere Infektionen, wodurch die Entstehung von Colistin-Resistenz-Isolaten die Welt durch das Auftreten von unbehandelbaren Infektionskrankheiten bedroht.14 Nachweis von Colistinresistenz in Ägypten, einem Land, das für seine hohe Belastung durch Infektionskrankheiten und das Vorhandensein einer geringen oder keiner Einschränkung des antimikrobiellen Einsatzes sowohl in der Veterinärmedizin als auch in der Medizin bekannt ist, was auf das Auftreten von unheilbaren Krankheiten in unserer Region hinweist aufgrund der Möglichkeit, Colistinresistenz auf hochresistente Bakterien zu übertragen.15

In dieser Studie untersuchen wir die Prävalenz der Colistinresistenz bei MDR und XDR P. aeruginosa isoliert von Patienten, die an einer Vielzahl von Infektionen auf der Intensivstation (ICU) des Minia University Hospital in Ägypten leiden.

Materialien und Methoden

Sammlung von Isolaten

Einhundertfünfundsiebzig klinische Proben verschiedener Infektionsquellen wurden von Patienten gesammelt, die im Rahmen routinemäßiger Krankenhauslaborverfahren auf die Intensivstation des Minia University Hospital in Minia, Ägypten, aufgenommen wurden. Alle klinischen Proben wurden auf Trypticase-Soja-Agar (Lab M, UK) bei 37 °C und 42 °C für 24 Stunden kultiviert. Eine Kolonie wurde auf MacConkey-Agarplatten und Cetrimid-Agar subkultiviert. Isolierte Kolonien wurden weiter identifiziert nach Kolonieformologie, Laktosefermentation, biochemischen Reaktionen (einschließlich Sulfid-Indol-Motilität, Katalase-, Dreifachzucker-Eisen-, Urease- und Oxidase-Tests), Fähigkeit, auf Cetrimid-Agar zu wachsen und bei 42 ° C zu wachsen.16 P. aeruginosa-Kolonien wurden durch Streifen gereinigt und reine Kolonien wurden bei 4 ° C gelagert.

Antibiotika-Suszeptibilitätstests

Antibiotika-Suszeptibilität nach Kirby-Bauer-Scheibendiffusionsmethode

Die Antibiotika-Suszeptibilität gegen verschiedene Antibiotikaklassen wurde nach Kirby-Bauer-Scheibendiffusionsmethode getestet.17 Verwendete Antibiotika-Discs waren Amoxicillin/Clavulansäure (AMC) (20/10 µg), Ampicillin/ Sulbactam (SAM) (20 µg), Meropenem (MEM) (10 µg), Imipenem (IPM) (10 µg), Cefepim (FEB) (30 µg), Cefoperazon (CEP) (75 µg), Polymyxin B (PB) (300 µg), Ciprofloxacin ( CIP) (5 µg), Levofloxacin (LEV) (5 µg), Gentamicin (CN) (10 µg), Ceftazidim (CAZ) (30 µg), Tigecyclin (TGC) (15 µg), Amikacin (AK) (30 µg), Tobramycin (CF) (10 µg), Aztreonam (ATM) (30 µg), Piperacillin (PRL) (30 µg), carbenicillin (CAR) (100 µg) (Oxoid; Basingstoke, Vereinigtes Königreich). Isolate wurden gemäß den Interpretationsstandards der Inhibitionszonen des Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI) 2018.18

MIC-Bestimmung des Colistin-Antibiotikums

Die Agarverdünnungsmethode auf Müller-Hinton-Agar wurde zur Bestimmung der minimalen Colistin-Inhibitorkonzentration verwendet.19 Eine Resistenz gegen Colistin wurde in Betracht gezogen, wenn die MHK ≥4 µg / ml gemäß den Standardrichtlinien von CLSI beträgt.18

Gemäß den Ergebnissen der Antibiotikaempfindlichkeit wurden Isolate gemäß den zuvor berichteten Kriterien in MDR, XDR und PDR klassifiziert.20

Kombinierter Scheibendiffusionstest (CDT)

Alle Colistin-resistenten Isolate (MHK ≥4) wurden mit 100 mM EDTA (Sigma-Aldrich; St.268 Louis, MO, USA) auf Inhibierung der mcr-1-Aktivität getestet, da diese Konzentration keine antimikrobielle Aktivität zeigte. Die Bakterienstämme wurden auf Muller-Hinton-Agar (Lab M, UK) kultiviert, auf dem drei Scheiben verwendet wurden. Eine Scheibe wurde mit 10 µL 100 mm EDTA gesättigt, um keine Hemmung des Bakterienwachstums durch die verwendete EDTA-Konzentration zu gewährleisten. Die anderen beiden Scheiben waren 10 µg Colistin-Scheibe und 10 µg Colistin plus 10 µL 100 mm EDTA-Scheibe. Die Isolate wurden für eine Zunahme von ≥3 mm im Durchmesser der Hemmzone der Colistin / EDTA-Scheibe im Vergleich zur Colistin-Scheibe beobachtet.21

Veränderung des Zetapotentials

Die mcr-Gene kodieren Phosphoethanolamin-Transferasen Enzyme, die enzymatisch eine Phosphoethanolamin (PEtN) -Einheit an das Lipid A der äußeren Membran von gramnegativen Bakterien binden, was zu einer Verringerung ihrer negativen Nettoladung führt, die die Colistinresistenz verleiht.22

Die Bakterienzellen wurden in Gegenwart und Abwesenheit von 80 µg/ml EDTA wachsen gelassen. Dann wurde die Bakteriensuspension bei 5000 U / min für 5 min bei 5 ° C zentrifugiert, dann wurden die Pellets zweimal gewaschen, danach wurden die Pellets in 2 ml steriler 1 mM NaCl-Lösung suspendiert, die auf eine Trübung der 0,5 McFarland-Standardlösung eingestellt war. Die Proben wurden mit 1 mm NaCl auf 1:4 verdünnt. Das Zetapotential wurde in 2 ml der verdünnten Probe bestimmt. Veränderungen des durch EDTA induzierten Zetapotentials wurden aus dem Zetapotentialverhältnis (RZP = ZP + EDTA / ZP-EDTA) berechnet, wobei ZP + EDTA und ZP-EDTA den Zetapotentialwerten entsprechen, die für Bakteriensuspensionen erhalten wurden, die in Gegenwart bzw. Abwesenheit von 80 µg / ml EDTA gezüchtet wurden. RZP von ≥ 2,5 als Kriterien für die Identifizierung von mcr-1-positiven Stämmen.21

DNA-Extraktion

Das DNA-Template wurde wie zuvor beschrieben aus einer Übernachtkultur von P. aeruginosa extrahiert.23 Eine Suspension des Bakterienpellets wurde 10 min gekocht, dann zentrifugiert. Überstand wurde direkt in den PCR-Assay eingesetzt.

PCR-Analyse der getesteten Gene

Exotoxin A ist ein wichtiger Virulenzfaktor (ein zytotoxisches Mittel) von P. aeruginosa bei klinischen Infektionen. Dieser Faktor hemmt die Proteinbiosynthese, was zu großen Gewebe- und Organschäden führt. Das toxA-Gen, eine inhärente genetische Sequenz, die sich auf dem P. aeruginosa-Chromosom befindet, wird zur Bestätigung von P. aeruginosa durch PCR verwendet.

Die PCR wurde in einem Gesamtvolumen von 25 µL durchgeführt, das 1X PCR-Puffer, 1 µmol / L jedes Primers, 1 µL genomische DNA (ungefähr 150 ng), 200 µmol / L dNTPs-Mix, 2 mmol / L MgCl2 und 0,05 U / µL Taq-DNA-Polymerase enthielt. PCR-Amplifikationen wurden für toxA FW:CTGCGCGGGTCTATGTGCC, RV:GATGCTGGACGGGTCGAG in einem automatisierten Thermocycler (Eppendorf, Hamburg, Deutschland) unter folgenden Bedingungen durchgeführt: 30 Zyklen von 1 min bei 94°C, 1,5 min bei 63°C und 1 min bei 72°C.24

Die Gene mcr-1 und mcr-2 wurden mittels konventioneller PCR-Technik unter Verwendung von die folgenden Primer: mcr-1 FW (5′-AGTCCGTTTGTTCTGTGGC-3′), RV (5′-AGATCCTTGGTCTCGGCTTG-3′) und mcr-2 Fw (5ʹ-ATGACATCACATCACTCTTGG-3ʹ), Rv (5ʹ-TTACTGGATAAATGCCGCGC-3ʹ).25,26 Die Technikbedingungen waren 34 Zyklen von 95 ° C für 1 Minute, 58 ° C für mcr-1 und 52 ° C für 30 Sekunden, 72 ° C für 1 Minute, gefolgt von einer endgültigen Verlängerung von 72 ° C für 5 Minuten.

Bestimmung der Effluxpumpenhemmung durch MHK-Reduktion mittels Effluxpumpenhemmer (CCCP)

Zur Bestimmung der MHK wurde die Agarverdünnungsmethode unter Verwendung der kationenadjustierten Mueller-Hinton-Brühe (Sigma-Aldrich, St Louis, USA) verwendet. Für die getesteten Isolate wurden die MICs von CCCP (EPI) und Colistin bestimmt. Sub-MHK von CCCP wurde zur Bestimmung seiner Wirkung auf die Colistin-MHK verwendet; Die Konzentration von CCCP (0,5 × MHK) wurde konstant auf den oben angegebenen MHK-Konzentrationen gehalten, während die des Antibiotikums seriell erhöht wurde. Die MHK der Isolate gegen Colistin in Abwesenheit und Anwesenheit von CCCP wurden wie bereits beschrieben mit einer Sub-MHK von CCCP (Endkonzentration von 10 mg/l) bestimmt.27 Die resultierenden MHK-Faltenänderungen nach der Zugabe von CCCP wurden als Verhältnis des MHK-Spiegels des CCCP-freien Antibiotikums zu dem des CCCP-zugesetzten Antibiotikums berechnet. Wie zuvor von Osei Sekyere beschrieben, berichtete Amoako28 who, dass das positive Kriterium für das Vorhandensein von Effluxpumpen in Isolaten eine ≥ 8-fache Abnahme der Colistin-MHK nach Zugabe von CCCP war.

Outer Membrane Protein Pattern

Eine einzelne Kolonie der getesteten P. aeruginosa Isolate wurde in 5 ml LB-Brühe bei 37°C für 2 Tage unter Schütteln bei 200 rpm kultiviert. Die Zellen wurden bei 8000 U/min für 5 min zentrifugiert. Bakterienpellets wurden in 1 ml Lysepuffer (0,05 M Tris HCL, 2% SDS, 10% Glycerin) suspendiert und 10 min auf 95°C erhitzt. Anschließend wurden die Proben für 10.000 rpm für 30 min zentrifugiert. Ca.50 µL extrahiertes Protein wurden mit Probenpuffer (4 mL entionisiertes Wasser, 1 ml 0,5 M Tris HCL, 1,6ml 10% SDS, 0,4 mL 2-Mercaptoethanol, 0,2 mL 1% (w/v) Bromphenolblau) (1:1) versetzt und durch 12% Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgel (SDS-PAGE) getrennt.29

Lipopolysaccharid-SDS-Polyacrylamid-Gelprofil für Colistinempfindliche und colistinresistente Isolate

LPS der getesteten Isolate wurden mit Westphal, Jann30 durch heiße wässrige Phenolmethode extrahiert und gereinigt und das gereinigte Material mit SDS-PAGE analysiert, gefolgt von einer kohlenhydratspezifischen Silberfärbung.31

Ergebnisse

Pseudomonas aeruginosa Isolation und Antibiotika-Empfindlichkeit

Von 175 Proben, die von Patienten mit verschiedenen Infektionen entnommen wurden, waren 75 Proben (42,8%) phänotypisch positiv für P. aeruginosa und positiv für toxA-Gen.

Antimikrobielle Empfindlichkeitstests ergaben, dass die isolierten P. aeruginosa vollständig resistent gegen Amoxicillin / Clavulansäure waren und eine hohe Resistenz gegen Ampicillin / Sulbactam (68%), Ceftazidim (63%) und Azetreonam (60%) beobachtet wurde. Sowohl gegen Tobramycin als auch gegen Tigecyclin (jeweils 50%) wurde eine mäßige Resistenz beobachtet. Darüber hinaus zeigte sich eine geringe Resistenz gegen Imipenem (6%) und Meropenem (5,3%) (Abbildung 1). Entsprechend den Ergebnissen der Antibiotika-Empfindlichkeit wurden die resistenten Isolate als MDR (96%), XDR (87%) und kein Isolat als PDR klassifiziert. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass von 75 Isolaten 16 Isolate (21,3%) eine Resistenz gegen Colistin-Antibiotika mit MHK ≥ 4 µg / ml (im Bereich von 8 bis 256 µg / ml) zeigten.

Abbildung 1 Antibiotikaresistenzmuster aller isolierten P. aeruginosa-Isolate.

Bestimmung der Mcr-1- und Mcr-2-Gene

Das Mcr-1-Gen wurde phänotypisch in den Colistin-resistenten Isolaten durch CDT nachgewiesen, wobei die Unterschiede zwischen den Durchmessern der Inhibitionszonen von Colistin / EDTA- und Colistin-Scheiben ≥ 3 mm betrugen. Die Ergebnisse zeigten, dass 6 Isolate (37,5%) eine Zunahme des Durchmessers der Colistin / EDTA-Scheibe um 3 bis 10 mm im Vergleich zur Colistin-Scheibe allein zeigten (Abbildung 2).

Abbildung 2 Phänotypischer Nachweis für mcr-positive Isolate durch kombinierten Scheibendiffusionstest (CDT). (A): mcr-1-positiver Stamm zeigte eine Zunahme des Zonendurchmessers von Scheiben mit Colistin und EDTA ≥ 3 mm im Vergleich zu Colistin allein. (B): mcr-1-negatives Isolat zeigte im Vergleich zu Colistin allein eine leichte Veränderung (1 mm) des Inhibitionszonendurchmessers von Colistin und EDTA-Scheibe.

Veränderung des Zetapotentials

Andererseits wurde die Veränderung des Zetapotentialtests als phänotypischer Nachweis für MCR-Gene gehalten, aber die Ergebnisse zeigten keine signifikante Veränderung des Zetapotentials außer in 2 Isolaten.

Nachweis von Resistenzgenen

Der genetische Nachweis von MCR-Genen mittels konventioneller PCR-Technik ergab, dass 8 (50%) Isolate positiv für mcr-1 waren, 6 davon positiv für CDT, während 100% (16 Isolate) negativ für mcr-2 waren.

Antibiotika-Empfindlichkeit von Colistin-resistenten Isolaten

Die Empfindlichkeit des Colistin-resistenten Isolats gegenüber anderen Antibiotika wurde durch die Kirby-Bauer-Scheibendiffusionsmethode bestimmt, die Ergebnisse zeigten, dass 100% der Isolate gegen Amoxicillin / Clavulansäure resistent waren, während die Resistenz gegen Ampicillin / Sulbactam, Cefepim und Tobramycin 78,12%, 71,87% bzw. 68,75% betrug. Die wirksamsten Medikamente waren Meropenem, Imipenem und Ciprofloxacin (Abbildung 3)

Abbildung 3 Antibiotikaresistenzmuster von Colistin-resistenten Isolaten.

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Bestimmung der Effluxpumpenhemmung durch MHK-Reduktion unter Verwendung von CCCP

Durch Untersuchung der Wirkung von 0,5 MHK von CCCP auf das MHK-Colistin wurde festgestellt, dass nur 3/16 Isolate (P6, P8 & P16) (18,75%) eine Reduktion der MHK von Colistin ≥ 8-fach zeigten (Tabelle 1) in Gegenwart von CCCP. Aus früheren Ergebnissen, das Isolat Nr. Es wurde festgestellt, dass 16 einen Effluxmechanismus und ein mcr-1-Gen aufweist.

Tabelle 1 Colistin-resistente Isolate, einige mögliche Resistenzmechanismen gegen Colistin und ihre Anfälligkeit für andere Antibiotika

Äußere Membran SDS-SEITE Profil

Tabelle 2 und Abbildung 4 zeigen, dass fünf bands mit molekulargewichten von 66,7, 56,06, 47,8, 40,18 und 23.6 KDa waren in sensitiven und resistenten Isolaten stabil, während eine Bande mit einem Molekulargewicht von 21 KDa nur in Colistin-resistenten Stämmen gefunden wurde, die P1 (mcr-1 positiv) und P12 (mcr-1 negativ) waren.

Tabelle 2: Molekulargewichte und Menge % der extrahierten äußeren Membranproteine von Colistin-resistentem und Colistin-sensitivem P. Aeruginosa

Abbildung 4 Äußere Membran SDS-SEITE von Colistin resistenten und empfindlichen Stämmen. Spur 1: Proteinmarker, Spur 2 und Spur 3: Colistin-resistente Stämme (P1 & P12), Spuren 4-6: Colistin-empfindliche Stämme.

Lipopolysaccharid (LPS) SDS-PAGE

Lipopolysaccharid-Silber-gefärbte SDS-PAGE zeigte, dass Colistin-resistente mcr-1-negative Isolate (P3, P6 und P10) kein LPS-Banden-Muster (O-Antigen-Wiederholungen oder LPS-Kern) zeigten, das die Möglichkeit ihres Verlustes und die Resistenz dieser Isolate gegen Colistin aufdeckte. Auf der anderen Seite zeigte der Colistin-resistente mcr-1-positive Stamm O-Antigen-Wiederholungen (Abbildung 5, Spur 5), die sich vom O-Antigen-Wiederholungsmuster des Colistin-sensitiven Stammes (Abbildung 5, Spur 4) unterscheiden, während beide einen LPS-Kern zeigten. Diese Ergebnisse können auf das Vorhandensein von modifiziertem LPS im mcr-1-positiven Stamm hinweisen.

Abbildung 5 LPS Bands Muster. Spuren 1, 2 & 3: Colistin-resistente mcr-1-negative Stämme (P3, P6 & P10), Spur 4: Colistin-empfindliche Stämme und Spur 5: Colistin-resistenter mcr-1-positiver Stamm (P1). O-Antigen-Wiederholungen sind boxed und Pfeil bezieht sich auf LPS-Kern.

Diskussion

In letzter Zeit treten multiresistente pathogene Bakterienstämme auf, bei denen die meisten verfügbaren Antibiotika gegen sie nicht wirksam sind.6,32-36 Die Polymyxine als der letzte Ausweg für die Behandlung von multiresistenten bakteriellen Infektionen, so das Studium der Entstehung von Colistin-resistent war ein Muss. Polymyxine zeigten ihre Aktivität durch ihre elektrostatische Wechselwirkung zwischen ihnen und den negativ geladenen Einheiten auf dem Lipid A von gramnegativen Bakterien, was zur Destabilisierung der äußeren Membran und zum Austreten des zytoplasmatischen Gehalts und zur Lyse führte.37,38

Es wurde festgestellt, dass die häufigste Ursache für Polymyxinresistenz die LPS-Modifikation durch Zugabe von 4-Amino-4-desoxy-L-Arabinose (Lara4N) und Phosphoethanolamin (kodiert durch mcr-Gene) oder Galactosamin zu Lipid A des LPS-Kerns ist. Infolgedessen beeinflusst eine Abnahme der netto-negativen Ladung von Phosphatresten die Affinität von Polymyxin zur Membran oder aufgrund der Wirkung von Zweikomponenten-Regulationssystemen (TCSs) pmrA /pmrB und phoP / phoQ.39

In unserer Studie haben wir eine Colistinresistenz gemäß den Ergebnissen von MICs nachgewiesen, gefolgt von deren Test auf das Vorhandensein von mcr-1-Phosphoethanolamin-Transferase unter Verwendung phänotypischer Methoden und dem Nachweis von mcr-1gen. Phänotypische Methoden hängen davon ab, dass mcr-1-Phosphoethanolamin Zink-Metalloprotein ist. Jede Abnahme des Zinks verringert also die MICs von Colistin in Isolaten, die für mcr-1 positiv sind. Als mcr-1-kodierendes Enzym ermöglicht ein Zink-Metalloprotein die Verwendung von EDTA als Metallchelator, um Zink in Medien zu verringern und Colistin-Mikrofone und die Zetapotentiale von mcr-1-positiven Isolaten zu beeinflussen.40

Unsere Studie zeigte eine hohe Prävalenz von P. aeruginosa (42,8%). MDR P. aeruginosa entsprach 96% der Gesamtisolate und 87% war XDR. Hohe Prävalenz von Colistin-resistenten P. aeruginosa (21.3%) wurde festgestellt, was auf unzureichende Infektionskontrollmaßnahmen und den Missbrauch bakterizider Antibiotika auf den Intensivstationen unserer Landeskrankenhäuser zurückzuführen sein kann. Darüber hinaus ist Colistin in unseren Ländern in der Wachstumsförderung von zur Lebensmittelerzeugung genutzten Tieren, insbesondere in der Geflügelindustrie, weit verbreitet, während Carbapeneme in Notfällen eingesetzt werden.15 So zeigten Carbapeneme im Vergleich zu Colistin eine beobachtbare Aktivität gegen die getesteten Organismen. Andererseits wurde beobachtet, dass unsere Ergebnisse höher waren als die von Liassine et al25, die berichteten, dass ein Isolat von 300 Isolaten verschiedener Bakterienspezies als P aeruginosa identifiziert wurde, das eine Resistenz gegen Colistin zeigte und das mcr-1-Gen beherbergte.

Der kombinierte Scheibendiffusionstest (CDT) und die durch EDTA induzierte Veränderung des Zetapotentials wurden als phänotypische Methoden verwendet41,42 zum Nachweis des mcr-1-Gens. Die Ergebnisse zeigten, dass keine Isolate positiv für mcr-2 waren und 8 (50%) Isolate von Colistin-resistenten Isolaten mcr-1-positiv waren, während 2 Isolate dieser Isolate RZP > 2,5 zeigten. Von 8 mcr-1-positiven Isolaten waren 6 Isolate positiv für CDT, während zwei mcr-1-positiv waren (Stamm Nr. P15 und P16) waren negativ für CDT, was auf die Koproduktion eines zusätzlichen Mechanismus der Colistinresistenz zurückzuführen sein kann, der die Wirkung von EDTA beeinträchtigt.21 Als, es wurde festgestellt, dass isolieren keine. P16 (mcr-1 positiv und CDT negativ) war positiv für Efflux.21,43-45 Darüber hinaus können Colistin-resistente Isolate, die für mcr-1 negativ waren, Mutationen aufgrund der langfristigen Verwendung von antimikrobiellen Mitteln aufweisen.

Darüber hinaus testeten wir Colistin-resistente Isolate auf das Vorhandensein von Effluxmechanismen unter Verwendung von CCCP (einem Effluxpumpenhemmer) und den Unterschied im äußeren Membranprotein- und LPS-SDS-PAGE-Profil zwischen empfindlichen und resistenten Isolaten. Unsere Ergebnisse zeigten das Vorhandensein eines Effluxmechanismus unter 3 Isolaten, während eines von ihnen mcr-1-positiv war. Das äußere Membranproteinprofil zeigte eine Bande mit einem Molekulargewicht von 21 KDa in den resistenten Isolaten P1 (mcr-1 positiv) und P12 (Colistin-resistentes mcr-1 negativ). Darüber hinaus wurde festgestellt, dass Colistin-resistente mcr-1-negative Stämme kein LPS-Kernmuster (O-Antigen-Wiederholungen oder LPS-Kern), aber mcr-1-positiv (P1) und Colistin-empfindliche Isolate zeigten LPS-Kern, aber unterschiedliches O-Antigen-Wiederholungsmuster. Machado et al20 untersuchten die Rolle der Effluxpumpe bei der Colistinresistenz bei Acinetobacter baumanni und fanden heraus, dass die Effluxaktivität zur Heteroresistenz von A beiträgt. baumanni in Abwesenheit von Mutation. Marjani et al43 zeigten, dass 22,5% der isolierten P. aeruginosa resistent gegen Colistin waren, was unseren Ergebnissen nahe kommt, und mehr als 50% der colistin-resistenten Isolate waren positiv für Effluxpumpen.

Obwohl der genaue Mechanismus der bakteriellen Abtötung durch Colistin oder Polymyxine nicht eindeutig bekannt ist, ist bekannt, dass ihre Bindung an die positiv geladenen Peptide und das negativ geladene Lipid A ein kritischer Schritt ist. Also testeten wir ihr LPS-SDS-PAGE-Profil und es wurde ein signifikanter Unterschied zwischen den getesteten Stämmen beobachtet. In einer Studie von Moffatt et al.46 wurde berichtet, dass der Verlust von LPS zum Auftreten von A. baumanii-Colistin führte, das aufgrund der Inaktivierung von Lipid-A-Biosynthesegen (lpxA, lpxC oder lpxD) auftritt. Äußere Membranproteinmuster zeigten das Vorhandensein einer Bande mit einem Molekulargewicht von 21 KDa in Colistin-resistenten Isolaten, die OprH entsprechen können, wie von Nicas und Hancock47 berichtet, die berichteten, dass die OprH-Expression eine Rolle bei der Resistenz von Pseudomonas gegen Polymyxine und EDTA spielt, da OprH zweiwertige Kationen in der äußeren Membran ersetzt, was zur Blockierung der polykationischen Antibiotikaaufnahme führt. Der vorherige Befund könnte erklären, warum Stamm Nr. P1 (mcr-1 positiv) war negativ für CDT.

Schlussfolgerungen

Die vorliegende Studie zeigte eine hohe Prävalenz von MDR und XDR P. aeruginosa mit Colistin-Resistenz bei Patienten, die auf der Intensivstation mit verschiedenen Infektionen aufgenommen wurden. Es zeigte sich auch das Vorhandensein verschiedener Mechanismen, die zu einer Colistinresistenz führen können. Dies zeigt die dringende Notwendigkeit, die Antibiotika-Behandlungsstrategien für Mensch und Tier zu ändern.