a) o ciclo de vida sexual de Chlamydomonas reinhardtii consiste… / Download Do Diagrama Científico

… a natureza das substâncias genéticas que desafiaram a lei de Mendel. Estudos extensivos ao longo do último século, usando várias técnicas, incluindo microscopia eletrônica, genética, biologia molecular e bioquímica, revelaram que as substâncias genéticas são genomas dentro de cloroplastos e mitocôndrias (Kuroiwa 1991; Birky 1995). Acredita-se que cloroplastos (cp) e mitocôndrias (mt) tenham surgido de relações endossimbióticas ancestrais entre células nucleadas e bactérias livres – cianobactérias e bactérias Alfa-roxas, respectivamente. Eles contêm seus próprios genomas, que são presumivelmente vestígios de seus progenitores (Gray 1992). Hoje, sabemos que os genes cp e mt são transmitidos à descendência apenas a partir do progenitor materno nos diversos taxa de plantas superiores, fetos, musgos, algas (Kuroiwa 1991), fungos (Mitchell e Mitchell 1952; Kawano et al. 1987), and animals (Hutchison et al. 1974), incluindo humanos. A herança uniparental dos genomas cp/mt foi pensado por muito tempo para ser um resultado passivo com base no fato de que os ovos contêm múltiplos números de organelas, enquanto os gâmetas masculinos, na melhor das hipóteses, contribuem apenas alguns (Gyllensten et al. 1991). No entanto, é provável que o processo de herança uniparental seja mais dinâmico. Um exemplo clássico e marcante seria a ocorrência de herança não-Mendeliana nas algas verdes unicelulares, Chlamydomonas reinhardtii , que produz gâmetas de tamanhos idênticos (isogamous) (Sager 1954). O ciclo de vida de C.reinhardtii é extremamente simples. Existem dois tipos de acasalamento de C. reinhardtii, tipo de acasalamento plus (mt+) e tipo de acasalamento menos (mt), controlados por um único tipo complexo de acasalamento loci no grupo de ligação VI (Ferris et al. 2002). C. reinhardtii sofre um ciclo de vida sexual, que inclui estágios definidos de diferenciação (Figura 1). As células vegetativas diferenciam-se em gâmetas em condições de inanição de azoto e irradiação de luz (Pan et al. 1996). Poucos minutos depois de serem misturados, gâmetas de tipos de acasalamento opostos aderem uns aos outros por sua flagela e fundem-se para formar zigotos. Após um período obrigatório de dormência, o zigoto sofre meiose e germinação para produzir quatro progênios haplóides. Mais de 90% da descendência formada herdam traços de cloroplastos (cp), preferencialmente do progenitor mt+, um fenômeno descrito pela primeira vez há mais de 50 anos (Sager 1954). Sager descreveu os padrões de herança de duas mutações induzidas pelos UV, sr1 e sr2 . A mutação sr1 confere resistência a níveis baixos da estreptomicina antibiótica e a mutação sr2 confere resistência a níveis elevados de estreptomicina. Quando a sr1 foi cruzada para uma estirpe sensível à estreptomicina, baixos níveis de resistência à estreptomicina foram herdados, seguindo a lei de Mendel. Em contraste, quando um progenitor mt+ que transportava a mutação sr2 foi cruzado para um progenitor sensível mt, todos os descendentes meióticos eram resistentes a níveis elevados de estreptomicina. Na cruz recíproca, os descendentes meióticos eram todos sensíveis à estreptomicina (Sager 1954). Em 1962, a evidência da existência da cpDNA veio do trabalho microscópico de luz e elétrons por Ris e Plaut (Ris e Plaut 1962). Apenas um ano depois, Sager e Ishida descreveram o isolamento da cpDNA por centrifugação de gradiente de densidade de cloreto de césio (CsCl) (Sager e Ishida 1963). Em 1989, a mutação sr2 foi mostrada como localizada dentro do gene rps12 do genoma cp (Liu et al. 1989). Em 1972, um estudo bioquímico mostrou que a quantidade de mt – cpDNA diminuiu em relação ao mt + cpDNA, 6-24 h após acasalamento (Sager e Lane 1972). O DNA de mt+ e mt – gâmetas foi rotulado com 14 N-ou 15 NH 4 Cl, e centrifugação de gradiente de densidade CsCl foi usado para monitorar o destino do DNA nuclear e cpDNA em zigotos 6 – e 24-h. Seis horas após o desenvolvimento de zigotos, o sinal representando mt – cpDNA era claramente inferior ao mt+ cpDNA, indicando uma redução preferencial de mt – cpDNA em relação ao mt+ cpDNA. Em 1980, a primeira evidência molecular para a redução preferencial do mt – cpDNA foi fornecida por Grant et al. (Grant et al. 1980). Os autores monitoraram o comportamento de mt+ e mt-cpDNA, aproveitando-se dos polimorfismos de comprimento dos fragmentos de restrição (RFLPs), em uma estirpe mutante C. reinhardtii ac-u-g-23 que carrega duas pequenas deleções em seu DNA cloroplastos. Os autores descobriram que tanto as deleções na cpDNA quanto o fenótipo não-fotossintético eram hereditárias. The 203-kb chloroplast genome of C. reinhardtii (Maul et al. 2002) está presente em ~80-100 cópias por célula, e é organizado em 5-10 complexos de proteína de DNA, que são chamados de nucleoides cloroplastos (Kuroiwa et al. 1981). Em 1982, Kuroiwa et al. descobriu-se que os nucleoides mt-cp tingidos de DAPI (fluorocromo específico dsDNA, 4′,6-diamidino-2 – fenilindol) desapareceram preferencialmente em zigotos jovens dentro de 50 minutos de acasalamento (Kuroiwa et al. 1982). Em 1999, o desaparecimento preferencial dos nucleóides mt – cp foi observado num zigoto vivo, utilizando o SYBR Green I (fluorocromo específico dsDNA que pode permear-se em células vivas) (Figura 1) (Nishimura et al. 1999). A interpretação deste fenómeno dramático, no entanto, foi controversa porque o desaparecimento preferencial dos nucleóides fluorescentes mt – cp ocorreu muito antes da redução do ADN ser detectada por métodos bioquímicos ou biológicos moleculares (6-24 H após o acasalamento) (Sager e Lane 1972). Foram propostas duas possibilidades principais para explicar isto. Uma possibilidade era que a desintegração dos nucleoides cp poderia levar à dispersão das moléculas de cpDNA, e a segunda possibilidade era que a rápida digestão das moléculas de cpDNA poderia levar ao desaparecimento dos nucleoides de cpDNA. Um problema ao abordar esta questão é que a reação de acasalamento é realizada usando milhões de mt+ e mt-gâmetas (Figura 2). A população celular é inevitavelmente uma mistura heterogênea de células, tais como mt+ e mt – gâmetas, zigotos com ou sem nucleóides mt – cp, e zigotos excecionais meitóticos (1~5%) que não formam zigotos meitóticos (Ebersold 1967). Geralmente, métodos moleculares e bioquímicos requerem grandes quantidades de amostras homogêneas para análises precisas, e qualquer heterogeneidade nas amostras confundiria os resultados. Em outras palavras, as” personalidades ” de células individuais ou organelas dentro de uma população seriam diluídas e provavelmente perdidas no processo de análises. Por outro lado, a microscopia pode revelar as “personalidades” ao nível morfológico, mas não ao nível molecular. Para estudar a condição das moléculas de cpDNA durante o desaparecimento dos nucleoides mt – cp, foi necessário coletar zigotos com base na presença ou ausência de nucleoides mt – cp, e analisar os zigotos individuais usando técnicas biológicas moleculares. Para tal, foram utilizadas pinças ópticas (Figura 3). O uso de pinças ópticas é uma técnica nova para manipular células vivas ou organelas sob observação microscópica direta (Ashkin et al. 1987). Neste estudo, um único zigoto com ou sem nucleóides cp foi coletado usando pinças ópticas, e a presença ou ausência de moléculas mt – cpDNA foi determinada pela análise aninhada da PCR. Os destinos individuais do cpDNA mt+ e mt – zigótico foram seguidos separadamente utilizando um transformador de cloroplastos LO3c, que alberga o gene bacteriano aadA (aminoglicosido adenil transferase). Os zigotos simples obtidos com as pinças ópticas foram submetidos a uma análise aninhada altamente sensível para a aadA (Figura 4)(Nishimura et al. 1999). Quando os gâmetas l03c mt+ foram cruzados com gâmetas de tipo selvagem mt-gâmetas, as sequências dos genes aadA foram detectadas em todos os zigotos que foram examinados. Pelo contrário, quando os gâmetas l03c foram cruzados com gâmetas de tipo selvagem, as sequências de aadA só foram amplificadas em zigotos mais jovens (10 e 30 minutos após a formação de zigotos). Após o desaparecimento dos nucleóides mt – cp fluorescentes, as sequências aadA não foram mais detectadas nos zigotos (90 e 120 minutos após a formação de zigotos). Estes resultados indicam que as moléculas mt – cpDNA são completamente digeridas em 10 minutos, durante os quais os nucleóides mt – cp desaparecem, e também que pelo menos um nuclease altamente eficaz é ativado no mt – cloroplast logo após a formação de zigotos. Esta digestão activa do mt – cpDNA é provavelmente a base para a herança materna do cpDNA. O modelo mais simples para a herança uniparental de cpDNA é que o processo consiste de dois eventos distintos que são prováveis de ocorrer em diferentes fases do ciclo de vida: uma “proteção” do mt+ cpDNA, talvez durante gametogenesis, e um “destruidor” de desprotegidos mt – cpDNA, durante os primeiros anos de desenvolvimento do zigoto. A) Restrição –Metilação hipótese Em 1972, Sager e colegas proposto que o mt – cpDNA foi digerido pela ação de enzimas de restrição, considerando que o mt+ cpDNA foi protegido por metilação – um modelo análogo para a restrição bacteriana-a metilação do sistema (Sager e Lane, 1972). Sager e colegas rapidamente acumularam evidências convincentes que mostram um aumento no nível de metilação do mt+ cpDNA, que foi detectado 7 h após o acasalamento (Burton et al. 1979; Royer and Sager 1979; Sano et al. 1980). Além disso, foi notificada a purificação das metiltransferases do ADN específico mt+ gâmeta, com pesos moleculares de 60 kDa e 20 kDa (Sano et al. 1981). Este evento de metilação específica de mt+ gâmetas foi aparentemente reversível, como seria esperado para proteção (Sano et al. 1984). O gene da metiltransferase residente em cloroplastos foi finalmente identificado em 2002, e a sua expressão específica mt+ gamete e localização de cloroplastos foram confirmadas (Nishiyama et al. 2002). Por outro lado, uma série de documentos de grupos independentes argumentou subsequentemente que a metilação do mt+ cpDNA não podia explicar adequadamente a protecção. Bolen et al. isolou um mutante Nuclear me1 que constitui metila a cpDNA a um nível mais elevado em ambas as células mt+ e mt (Bolen et al. 1982). Quando os gâmetas me1 foram usados para Cruzes, padrões normais de herança uniparental foram observados, inconsistentes com o…